Summary
Her presenterer vi adresserbare slippverktøy microarrays (ADMs), en dråpe matrise basert metode finne absolutt protein overflod i enkeltceller. Vi demonstrere evnen ADMs å karakterisere heterogenitet i uttrykket av tumor suppressor protein p53 i en menneskelig kreft cellen linje.
Abstract
Ofte mobilnettet atferd og mobilnettet svar analyseres på befolkningsnivå der svarene på mange celler er samlet sammen som en gjennomsnittlig resultat maskering rik enkeltcelle virkemåten i komplekse innbyggere. Enkelt celle proteinet oppdagelsen og kvantifisering teknologi har gjort en bemerkelsesverdig innvirkning de siste årene. Her beskriver vi en praktisk og fleksibelt enkelt celle analyse plattform basert på adresserbare slippverktøy microarrays. Denne studien beskriver hvordan absolutt kopi antall mål proteiner kan måles med enkeltcelle oppløsning. Tumor suppressor p53 er vanligvis muterte genet menneskelige kreft, med mer enn 50% av totale krefttilfeller viser et ikke sunt p53 uttrykksmønster. Protokollen beskriver fremgangsmåten for å opprette 10 nL dråper som enkelt menneskelige celler er isolert og kopien antall p53 protein måles med ett molekyl oppløsning du nøyaktig finne variasjon i uttrykk. Metoden kan brukes på en celle type inkludert primære materiale til å fastslå hvor absolutt kopi av alle mål proteiner av interesse.
Introduction
Målet med denne metoden er å avgjøre variasjonen i overflod av et mål protein i en celle befolkningen med enkeltcelle oppløsning. Enkelt celle analyse gir en rekke fordeler som ikke er tilgjengelig med tradisjonelle ensemble biokjemiske metoder. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 det første, arbeider på enkeltcelle nivå kan ta den rike mangfold i celle innbyggere som ellers ville gå tapt ved den snitt som oppstår med tradisjonelle ensemble biokjemiske teknikker. Flertallet av verk-hest biokjemiske metoder fungerer med bulk, krever, som de ofte gjør, millioner av celler til å produsere et resultat. Selvfølgelig konsekvensene av vurdere hele celle populasjoner avhenger av flere faktorer, for eksempel heterogenitet i protein uttrykk der noen viktige funksjoner i fordelingen av protein overflod kan bli savnet. Fra et praktisk perspektiv, følsomheten kreves av enkeltcelle teknikker gjør dem i stand til å arbeide med mengder av biologisk materiale som er tilstrekkelig for enda mer følsomme bulk teknikker å fungere. Et sentralt eksempel på dette er studiet av sjeldne celletyper som sirkulerer kreftceller (CTCs) hvor selv for pasienter med en dårlig prognostiske outlook trekke mindre enn 10 CTCs kan finnes i en enkelt 7,5 mL blod. 6 Her presenterer vi metodikken kreves for å utføre enkeltcelle protein mål med en redusert volum antistoff-baserte analysen ansette olje-capped dråper trykt på et antistoff microarray.
Microfluidic slippverktøy plattformer er høy gjennomstrømning, kunne generere tusenvis av dråper per sekund, og i stand til å isolere, og selv dyrking, enkeltceller i individuelle dråper til å utføre en rekke biokjemiske analyser. Slippverktøy-baserte teknikker er godt egnet for enkelt celle analyse,7,8,9 med kjente nyere eksempler inkludert DropSeq10 og inDrop11, som har vært sterkt hjulpet av makt forsterkning teknikker. Begrenset mengde materiale og ingen av metodene av forsterkning for proteiner gjør enkeltcelle Proteomikk spesielt utfordrende.
Dråper kan analyseres av en rekke metoder og fluorescens mikroskopi er blitt vidt anvendt. Ett molekyl teknikker som totalt interne refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi kan fluorescerende molekyler til visualiseres med enestående signal-til-støy-forhold. 12 på grunn av eksponentiell forfallet av feltet evanescent, bare fluorophores i høy nærhet til overflaten (for 100nm) er glade gjør TIRF en god strategi i å oppdage små mengder av et mål molekylet i en kompleks blanding. Iboende optisk snitting styrken på TIRF også bidrar til å unngå vask trinnene og grenser analysen tid og kompleksitet. Men TIRF krever ut flater og eksempler på TIRF mikroskopi på dråper i flyt innebærer dannelsen av en plan overflate som bildet. 13 dette enkelt celle proteomic teknikker ofte design microfluidic brikker rundt overflaten-immobilized fange agenter i et microarray format. 4 , 14
Dråpene, selv, kan dannes i matriser på Plane overflater, såkalte slippverktøy microarrays. 15 , 16 , 17 romlig organisering dråper til matriser tillater dem å beleilig indekseres, lett over tid, individuelt adresserte og, hvis nødvendig. Slippverktøy microarrays kan oppnå en høy tetthet av mikro-reaktorer med tusenvis av elementer per brikke som er frittstående eller støttes av microwell. 18 , 19 , 20 de kan bli dannet av sekvensiell deponering av flytende håndtering roboter, inkjet spotters, kontakt microarrayers21,22,23,24,25, 26 , eller de kan selv montere på overflater som superhydrophillic flekker mønstret på en superhydrophobic overflate. 27 , 28 , 29
Med disse betraktninger i tankene, ble adresserbare slippverktøy Microarrays (ADMs) utviklet for å kombinere allsidighet, romlig adresserbarhet og reduserte mengder slippverktøy microarrays med sensitiviteten av ett molekyl TIRF mikroskopi til kvantitativt måle protein overflod. 5 ADMs kan enkelt celle analyse danner et slippverktøy microarray inneholder enkeltceller over et antistoff microarray, som deretter er avkortet med olje å hindre fordampning. Volum av dråpene er diskret å hindre tap av prøven, som ellers kunne oppnås ved på prosessoren valving i kontinuerlig microfluidics. 30 den absolutte mengden målet protein fra en enkelt celle er ekstremt liten; men lar redusert mengden dråpene for relativt høy lokal konsentrasjon slik at de oppdages ved hjelp av en sandwich antistoff analysen - antistoffer er immobilized i en distinkt region, eller sted, på en overflate som fanger protein som i sin tur binder til en fluorescently merket oppdagelsen antistoff i slippverktøy volumet. Som en etikett-fri tilnærming (i.e. protein mål ikke trenger å være merket direkte), ADMs er generelt gjelder analysere celler fra primærkilder, som behandlet blod, fint må aspirates og dissosiert svulst biopsier, samt celler fra kultur og deres lysates.
Måle variasjonen i protein overflod over en celle befolkningen er heterogenitet svar, for eksempel et stoff og hjelper i å gi innsikt i cellulære funksjoner og veier, vurdere subpopulasjoner og deres atferd samt identifisere sjeldne hendelser som ellers ville bli maskert av bulk metoder. Denne protokollen beskriver hvordan å produsere og bruke adresserbare slippverktøy microarrays å kvantitativt bestemme tettheten av transkripsjon faktor p53 i menneskelige celler og kan brukes til å undersøke hvilken rolle p53 svar på cellegifter. Målet protein bestemmes av fangst og gjenkjenning antistoffer og kan endres for å inkludere mer eller ulike mål. Du finner instruksjoner for å bygge en enkel apparater omfatter en konsentrisk munnstykket fra generell lab forbruksvarer til å manuelt array 10 nL dråper avkortet med olje. Full eksperimentelle prosessen er beskrevet der hver dråpe er så lastet med en enkelt celle, som er så lysed og uttrykk for protein bestemt med ett molekyl oppløsning bruker TIRF mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
-
Chips og print antistoff microarrays
- Feste en selvklebende silikon/akryl isolator til en dekkglassvæske functionalized for å støtte et antistoff microarray. Dette omtales som chip.
Merk: Ulike overflaten kjemikalier har blitt testet for deres egnethet med adresserbare dråper. 5 overflaten kjemikalier må være optimalisert for alternative fange agenter. ADM isolatorer er kommersielt tilgjengelige eller lages med laser cutting akryl (CAD fil for isolator brukt i dette arbeidet er gitt som en nedlasting, se Ekstra koden arkiv). - Slå på microarrayer og sette fuktighet til 75%.
Merk: relativ fuktighet reduserer fordamping av skriverløsning fra microarray pinnen og reduserer intra - og inter - spot variasjon. - Rengjør microarray pinnen i pin rensemiddel for 5 min av ultrasonication. Skyll pin med svært rent vann vaskeflaske og tørr med nitrogen.
Merk: Suspendere pin som bare fordype pin spissen. Et mikroskop lysbilde med et riktig boret sett hull vil hjelpe hvis en pin-holder ikke kan hentes. - Gjør 5 mL utskriftsbufferen bestående av 3 × saltholdig-natriumsitrat (SSC) buffer, 1,5 M betaine supplert med 0,01% natrium dodecyl sulfate (SDS). Lagre på 4 ° C på ubestemt tid.
- For å forberede en utskrift løsning, tine anti-p53 antistoff (p53/Mdm2 ELISA kit, se tabellen for materiale) dele lagret på-80 ° C. Bland det 1:1 med utskriftsbufferen til en siste konsentrasjon på 0,5 mg/mL. Laste 5-10 µL av skriverløsning i en 384 godt-plate ved hjelp av brønnene og plasser i microarrayer.
- Laste inn sjetonger samlet i trinn 1.1.1 inn i microarrayer. Programmet microarrayer skrive ut flekker på koordinatene definert av midten av hver brønn av isolator.
Merk: Microarrayers benytter en rekke, hovedsakelig, proprietær programvare og så leseren er oppmuntret til å konsultere relevant litteratur. Microarray kreves for ADM isolator omtalt i tilhørende CAD-filen i trinn 1.1.1 består av rektangulære elementer; relevante avstandene er gitt. - Lagre chips i lufttette beholdere og sjal med folie. Lagre på 4 ° C opp til 6 uker.
Merk: Folien er å forhindre Foto-skade. Lagring på 4 ° C begrenser fornedrelse graden av biomolecules og eventuelle skadelige reaksjoner som kan handle for å redusere microarray aktivitet. En lufttett beholder lar sjetonger til å equilibrate til romtemperatur før bruk uten kondens dannes på chip overflaten. Kontakt microarray utskrift utnytter overflatespenning og vedheft mellom ut løsningen og print underlaget å produsere flekker. Pre-trykking eller blotting er vanligvis kreves for å fjerne overflødig løsningen fra microarray pin til enhetlig størrelse flekker. Ikke kast det offerplasser pre print dekkglassvæske siden det kan brukes å vurdere satsvise kvalitet.
- Feste en selvklebende silikon/akryl isolator til en dekkglassvæske functionalized for å støtte et antistoff microarray. Dette omtales som chip.
-
Forberede sprøyter, rør og konsentriske munnstykke for dispensering adresserbare dråper
- Demontere 100 µL (for vandige slippverktøyet) og 1 mL (for lokkpåsettingsmaskiner olje) glass Hamilton sprøyter og skyll deler med destillert H2O.
- Mate en 100 mm lengde på 150 µm ID/360 µm OD smeltet silica rør gjennom en 40 mm lengde på 1.0 mm ID/1/16 "OD PFA rør til stikker av 2 mm. Dette vil danne konsentriske munnstykket.
- Påfør et tynt lag av cyanoacrylate lim på slutten av en 10 µL pipette tips og sette inn 40 mm i 1.0 mm ID/1/16 "OD PFA rør. Hvis nødvendig, omplassere smeltet silica slangen for å opprettholde en 2 mm protrusion ved munnstykket før selvklebende settene.
- Sett den andre enden av smeltet silisium kapillær i slutten av en 200 mm lengde på 0.014" ID/0.062" OD PTFE rør, og koble dette til en 100 µL Hamilton sprøyte fylt med 4% bovin serum albumen (BSA) i fosfat-bufret saltvann (PBS) (PBSA).
Merk: Proteiner og andre biokjemiske arter kan nonspecifically binde overflater og kan mistet eller denaturert. BSA brukes til å "blokkere" overflater å minimere uspesifisert binding av sacrificially binding til overflater. - Sett inn en 400 mm lengde 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP rør i et 200 µL pipette tips før det danner en forsegling. Påfør et tynt lag av cyanoacrylate lim til et annet 200 µL pipette tips og presse dette i det første tipset å fikse slangen på plass. Koble den åpne enden av 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP slangen til en 1 mL Hamilton sprøyte fylt med mineralolje.
- 200 µL pipette tips samlingen inn 10 µL pipette spissen av konsentriske munnstykket. Plassere sprøyter i egen sprøyte pumper som de må bli operert uavhengig.
- Fyll sprøyten 100 µL med 4% PBSA blokkerer løsning. Feste og flush 'vandig' slangen med blokkering løsning. Gjenta to ganger for totalt 3 flush.
- Fyll sprøyten 100 µL med 0.125 µg mL-1 oppdagelsen antistoff (anti-p53 antistoff (-1) merket med Alexa 488) i 4% PBSA og re-fest slangen. Erstatte blokkerer løsning i rør ved dispensering 25 µL oppdagelsen antistoff løsning.
- Tømme 'olje' slangen med mineralolje til alle rør og munnstykket fylles med olje. Fylle 1 mL sprøyte med mineralolje og re-fest slangen. Sikre at slangen og munnstykke samlingen en XYZ manipulator.
-
Forberede microinjector og micromanipulator
Merk: Trinnene nedenfor gjør en spesifikk referanse til komponenter av microinjector og micromanipulator apparater angitt i tabell av materialet, men generelt gjelder for alle slike apparater.- Samle på microinjector ved trykkslangen og kapillær holder.
- Sakte rotere stempelet ringe til mineralolje fylles helt linjen.
- Montere kapillær holderen på oversettelse hodet fjellet.
- Fix av kapillær i kapillær holderen med grep hodet.
- Pipetter en løsning på 4% PBSA i en av brønnene i isolator.
- Oversett med micromanipulator og dyppe spissen av av kapillær i løsningen.
- Sakte fyll av kapillær med 4% PBSA og la til å blokkere for 10 min.
- Løse ut microcapillary og sving modulen oversettelse slik at samlingen er klart av chip.
2. danne adresserbare dråper og Last med enkeltceller
- Skjemaet adresserbare dråper
- Sikre chip på mikroskopet scenen.
Merk: Mikroskopet er en invertert fluorescens automatisert mikroskop kan enkelt molekyl TIRF utstyrt med en en kodet XY-scenen og et elektron multiplisere kostnad - sammen enheten kameraet (EM-CCD). - Registrere mikroskop scenen koordinatene for hver spot i matrisen ved hjelp av automatiserte mikroskop kontroll programvare.
- Angi XYZ manipulatoren mikroskop scenen. Plass munnstykket i en vinkel på 50-60°. Kontroller at munnstykket har tilstrekkelig lengde og klarering til chip. Angi 'vandig' og 'olje' sprøyte pumper å dispensere 10 nL 100 µL/min og 5 µL på 100 µL/min, henholdsvis.
Merk: Under forberedelse, vannoppløsning ved munnstykket kan tørke. - Dispensere vandig løsning til en perle av væske er synlig ved munnstykket. DAB med støv gratis tørk for å fjerne den.
Merk: Avhengig av antall vilkår under etterforskning, reservere en rekke brønner som reservoarer for celler. En enkelt reservoaret vil være tilstrekkelig for en enkeltcelle/linjetypen. - Ved hjelp av automatiserte mikroskop kontroll programvare, satt mikroskop scenen koordinatene til et antistoff sted i matrisen og fokus på dekkglassvæske overflaten.
- Forsiktig for ikke å forstyrre stedet, bruker XYZ manipulator, justere glass kapillær spissen av konsentriske dysen ved siden av antistoff sted og dispensere 10 nL vandig løsning. Uten bevegelige stadier, dispensere 5 µL olje cap den vandig løsningen. Sakte heve munnstykket klar av slippverktøyet og flytte til neste godt.
- Gjenta trinn 2.1.6 for alle antistoff flekker i matrisen.
- Etter 30 min, bilde alle flekker i matrisen ved hjelp av automatiserte mikroskop kontroll programvare for å finne bakgrunnen for enkelt molekyler bundet til hver antistoff spot før lasting celler.
- Sikre chip på mikroskopet scenen.
- Last adresserbare dråper med celler
- Fjern celle kultur kolber settefiskanlegg og koble celler ved hjelp av trypsin/EDTA løsning.
Merk: I denne studien er menneskelig kolon karsinom celle linjen ble brukt og kultivert bruker Dulbeccos endret Eagles Medium (DMEM) med 10% (v/v) fosterets bovin serum (FBS) i en CO2 inkubator. - Eventuelt fluorescently flekken celler.
- Resuspend celler i en løsning av 0.125 μg/mL oppdagelsen antistoff (anti-p53 antistoff (-1) merket med Alexa 488) i 10% FBS i L-15 medier. For å sikre en enkeltcelle suspensjon, filtrere celle løsningen gjennom en 40 µm pitch celle sil.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og fortynne eller konsentrere celle løsningen en konsentrasjon av 25-400 × 103 celler/mL. Dette sikrer at cellene sediment med tilstrekkelig avstand å manipulere komfortabelt i microcapillary.
- Legg enkeltceller i adresserbare dråper fra cellen reservoaret micromanipulator og microcapillary.
Merk: Ikke-tilhenger celler kan lastes samtidig i brønnene og utlevert enkeltvis i adresserbare dråper. Til tross for blokkering overflatebehandling tilhenger cellelinjer vil tendere til å nonspecifically stikke til glass microcapillary indre veggen og tapt. - Bruker en 10 × målsetting å observere, bruker microinjector inneholder en enkelt celle i microcapillary fra cellen reservoaret.
- Lagre micromanipulator scenen koordinatene hvis bruker et elektronisk manipulator stadium eller manuelt merke z-posisjonen.
- Trekke i brønnene ved å oversette det oppover for å fjerne 1 mm høyden av chip. Utføre dette manuelt med en styrespak eller automatisk ved hjelp av funksjonen "Løs ut" av et elektronisk manipulator stadium.
- Sett scenen koordinater til at av en adresserbare slippverktøy ved hjelp av automatisert programvare for mikroskop. 'Injiser"av brønnene av tilbake til den lagrede (eller bemerket) z-posisjonen. Utføre dette manuelt med en styrespak eller automatisk hvis bruker et elektronisk manipulator stadium.
Merk: Microcapillary vil pierce lokkpåsettingsmaskiner olje og ligger i den vandige delen av adresserbare slippverktøyet. - Dispensere cellen i adresserbare slippverktøyet ved hjelp av microinjector. Volumet av en 10 nL adresserbare dråpe vil øke med mindre enn 1%.
- Gjenta 2.2.5-2.2.9 for gjenværende adresserbare dråpene forlate noen gratis for eksperimentell kontrollen der adresserbare dråper ikke inneholder en celle.
Merk: Et enklere alternativ til laste enkeltceller i adresserbare dråper bruker microcapillary og micromanipulator er å erstatte løsningen i trinn 1.2.8 med en løsning av gjenkjenning antistoff 4% PBSA inneholder celler i en konsentrasjon på 10 5 celler/mL, tilsvarende 1 cellen/10 nL. Enkelt celle bruk vil være Poissonian og celle konsentrasjonen må optimaliseres.
- Fjern celle kultur kolber settefiskanlegg og koble celler ved hjelp av trypsin/EDTA løsning.
- Lyse cellene og bilde matrise
- Bildet cellene i dråper med brightfield mikroskopi, inkludert noen fluorescens bildebehandling.
Merk: Bildebehandling tar omtrent 3 minutter å image ~ 100 dråper med en automatisert mikroskop. Utføre bildebehandling med en 60 NA = 1.49 oljeneddyp målet. Ingen filtre er nødvendig for brightfield imaging mens standard filteret sett brukes til fluorescens bildebehandling. - Bilde alle flekker i matrisen med ett molekyl TIRF mikroskopi.
Merk: Innstillingene brukes som i trinn 2.3.1 med en spesialisert TIRF filtrerer sett. Disse bildene vil deretter analyseres i del 3 å finne bakgrunnen for enkelt molekyler bundet til hver antistoff spot før lysis. Ett molekyl bildevisning totale interne refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi tar ca 5 min å image ~ 100 plasser. - Fokus på en celle i en adresserbare slippverktøy. Oppnå full optisk lysis ved å fokusere en enkelt 6 ns laser puls (bølgelengde 1064 nm, puls energier 14,1 ± 0,3 µJ per puls) nær plasseringen av cellen.
Merk: Laser pulsen setter opp en voksende kavitasjon boble som hagesaks cellen og frigjør mobilnettet bestanddeler i slippverktøy volum. 4 , 31 mekaniske prosesser på grunn av laser-indusert lysis ikke forstyrr olje-vann-grensesnittet på lav puls energier. Optisk lysis tar ca 20-30 min å lyse 100 celler. Som beskrevet under diskusjon, finnes det en rekke alternative metoder for å lyse enkeltceller hvis optisk lysis installasjonen ikke er mulig. - Gjenta for alle cellen inneholder adresserbare dråper forlater 5 gratis for eksperimentell kontrollen der adresserbare dråpestørrelse inneholder en un lysed celle.
- Merk tiden der hver celle er lysed.
Merk: Disse tider skal brukes til å rette enkelte bindende kurver for hver spot i trinn 3.1.9. Ofte er det tilstrekkelig å merke tidene når første og siste cellene er lysed og beregne resten forutsatt at et tilstrekkelig konsekvent tid mellom lyse hendelser. - Hente ett molekyl bilder med TIRF mikroskopi alle steder hvert 10 min for de første 30 min deretter hvert 20 min for ytterligere 60 min. Hvis bare interessert i protein bundet på likevekt, bilde alle flekker etter rugende chip i 90 min ved romtemperatur.
Merk: Tiden nå likevekt avhenger slippverktøy volumet og slektskap av antistoffer brukt i analysen. TIRF mikroskopi utføres ved hjelp av en laser excitation kilde på = 488 nm og 1,5 mW kraften målt på tilbake aperture bruker en optisk strømmåleren. Ett molekyl bilder er ervervet ved å sette innstillingen oppkjøp på EM-CCD kameraet 900 ms anskaffet, 16-bit-digitalisering med 1 MHz avlesning hastighet og Gefirt gevinst faktor av 10. Isolator kan brukes på nytt ved å nøye fjerne dekkglassvæske.
- Bildet cellene i dråper med brightfield mikroskopi, inkludert noen fluorescens bildebehandling.
3. dataanalyse
-
Ett molekyl teller (ikke-trafikk/digitale regimet)
- Bruker Fiji (eller Matlab), for et ikke-trafikk antistoff sted, laste bildet anskaffet før lysis (bakgrunn, BKD).
Merk: Operasjonene i følgende utføres oversiktlig bruker Fiji analyseprogramvare. En brukerveiledning kan finnes på følgende link https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html. - Fiji, velger du BKD bildet. Under "Bilde"-menyen velger du "Duplisere" å like BKD. Velg like bildet under "Prosess > Filter", velg "Gaussian Blur" og angi en radius på 50 piksler.
- Flat BKD bildet slik at det er en effektiv uniform intensitet distribusjon av eksitasjon lyskilden ved å dele BKD bildet av uskarpe BKD bildet, produserer BKD_FLAT.
- Under "Prosess" Velg "bildet kalkulator...", angir operasjonen "Divider", bildene kreves, og velge boksene "Opprett nytt vindu" og "32-biters (flyt) resultat."
- Trekk fra hver piksel i bildet av 1 ("prosessen > Math", velg "Trekke..." og angi verdien 1). Gjennomsnittlig pixel intensiteten skal være 0.
Merk: Feltet sammenslåing og flat bakgrunnsbilder kan kontrolleres enkelt siden summen av alle bildepunkter skal være 0 og gjenværende forskyvningen kan bli mer oversiktlig kompensert for. - Velg et 50 pixel × 50 pixel område i noen av de 4 hjørnene av BKD_FLAT bildet. Måle pixel intensitet standardavviket (σ) ved å velge "Analysere" og "Tiltak".
Merk: Sammendrag statistikken av utvalget vil bli presentert i en resultatvinduet. Dette bestemmer av-spot bakgrunn der det er lite sannsynlig å være en høy tetthet av enkelt molekyler. Området skal måles kan være manuelt valgt ved hjelp av standard menyen markeringsverktøyene eller ved å kjøre makroen koden "makeRectangle (x, y, bredde, høyde)"; Dette skaper en rektangulær markering, der x- og y-argumentene, koordinatene (i piksler) for øverst til venstre. - Angitt bilde terskelen til 3σ og opprette en binær image SM_MASK.
- Velg "Terskelen..." under "Image > Juster", og angi lavere terskel for 3σ.
Merk: Piksler hvis verdien er under grensen er satt til null og piksler overskrider terskelen er satt til 1. Terskelverdien bestemmer tillit som thresholded piksler tilhører et enkel molekyl.
- Velg "Terskelen..." under "Image > Juster", og angi lavere terskel for 3σ.
- I segmentert bildet SM_MASK, angi bildepunktverdiene intensitet til null for alle objekter som ikke har en størrelse på 4-9 pixel2 og en sirkularitet på 0,5 - 1 ved å velge "Analysere" etterfulgt av "Analysere partikler" og angi størrelse og sirkularitet.
Merk: Pikselstørrelsen må være optimalisert for andre fluorophores og mikroskopet satt ups. På grunn av kameraet Støy enkelt piksler kan være over denne grenseverdien og kastes ikke til tross for ikke enkelt molekyler. Piksel størrelse vilkåret vil riktig fjerne slike bildepunktene. Enkelt molekyler er generelt rund i formen. Sirkularitet verdien 1 indikerer en perfekt sirkel mens verdien nærmer 0 angir en stadig mer avlang form. De gjenværende objektene er enkelt molekyler og kan telles. En maske kan angis til å avgrense området av sted å diskriminere på stedet og av-spot teller per bilde. Dette er lettere for rammer kjøpt på senere tidspunkt når det er en tilstrekkelig signalet på stedet som kan deretter brukes til tidligere rammer. - Den samme ikke-trafikk antistoff plassen, laste og Gjenta trinnene 3.1.1 - 3.1.7 for alle delbildene tatt som en tid-løst serie ervervet innlegget lysis. Bruk lyseringstid noterte i trinn 2.3.5. å korrigere noen binding kurver.
- Bruker Fiji (eller Matlab), for et ikke-trafikk antistoff sted, laste bildet anskaffet før lysis (bakgrunn, BKD).
-
Ett molekyl teller (trafikk/analog regimet)
- For å beregne gjennomsnittlig intensiteten av et eneste molekyl, før du fortsetter, kan du gjenta trinn 3.1.1 - 3.1.8.
- Multiplisere bilder BKD_FLAT og SM_MASK for å produsere et bilde der null bildepunktverdiene er forbundet med enkelt molekyler.
- For å utføre dette, på "Process"-menyen, velg "Bildet kalkulator...", angi operasjonen "Multipliser" og bilder kreves, og velg bokser "Opprett nytt vindu" og "32-biters (flyt) resultat."
- Summere alle bildepunktverdiene intensitet ved å velge "Analysere" og deretter "Mål"; Sammendrag statistikken av utvalget vil bli presentert i en resultatvinduet. Dele på antall telt enkelt molekyler som trinn 3.1.8 til å beregne gjennomsnittlig intensiteten per ett molekyl.
- For noen trafikk antistoff spot, laste bildet ervervet etter lyse og flat med en uskarpe bakgrunnen image ifølge trinn 3.1.2 og 3.1.3.
- Trekk fra hver piksel i det sammenslåtte bildet av 1 ("prosessen > Math", velg "Trekke..." og angi verdien 1)
- Velg 50 × 50 pixel Enkeltpunk i noen av de 4 hjørnene av bildet og måle pixel intensitet standardavviket (σ). Se trinn 3.1.5 for detaljer.
- Opprett en binære bilder maske ved å sette bildet terskelen til 3σ og angi intensitet bildepunktverdier til null av objekter med en størrelse mindre enn 4 pixel2. For å utføre dette, "Analysere"-menyen, velg "Analysere partikler" og angi størrelse og sirkularitet.
- Multiplisere flat trafikk antistoff spot bildet av den binære bilder.
- For å utføre dette, på "Process"-menyen, velg "Bildet kalkulator...", angi operasjonen "Multipliser" og bilder kreves, og velg bokser "Opprett nytt vindu" og "32-biters (flyt) resultat."
- Summen av de gjenværende pixel intensiteter ved å velge "Analysere" etterfulgt av "Tiltak"; Sammendrag statistikken av utvalget vil bli presentert i en resultatvinduet.
- Dividere summen av pixel intensiteter av gjennomsnittlig ett molekyl intensiteten til å beregne antall enkelt molekyler bundet til trafikk stedet.
-
Kalibreringskurven for absolutt kvantifisering
- Gjenta delene 1 og 2 til 10 nL adresserbare dråper med oppdagelsen antistoffer i 4% PBSA løsning spiked med et kjent konsentrasjon rekombinant protein.
- Utføre en konsentrasjon rekke 102- 107 rekombinante proteinene per dråpe av varierende kjent konsentrasjonen av rekombinant protein lagt til løsningen. Det anbefales å arbeide i form av antall proteiner per slippverktøy å kalibrere enkelt celledata direkte.
- Bruke konsentrasjon serien data i trinnet 3.3.2 kalibrere et enkel molekyl teller per sted å protein overflod per slippverktøy og av forlengelsen protein overflod per enkelt celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Absolutt basale protein kopien antall p53 identifiserte med enkeltcelle oppløsning i en menneskelig kolon kreft cellen linje, være celler. Viser vi hvordan p53 uttrykk kan variere over flere størrelsesordener og viser en svakt positiv sammenheng mellom cellen størrelse og protein kopi tall i hvile være celle befolkningen.
Adresserbare slippverktøy Microarrays dannes når vandig dråper er utlevert å antistoff spot steder og avkortet med olje. Her støtte dråpene en følsom p53 protein analysen. Coverslips er plassert med fangst antistoff flekker med en kontakt microarrayer og en PIN-kode. Anti-p53 fange antistoffer er tatt fra en kommersiell ELISA test kit. Utskrift forholdene var slik at fange flekker var ca 100 µm i diameter med en maksimal fange kapasitet på 6,2 ± 0.5 x 105 proteiner per sted. 32
Bruk av en isolator limt til dekkglassvæske tillater en høyere tetthet av dråper oppsamlingen siden det begrenser spredningen av olje til nærliggende antistoff fange flekker. I hver brønn av isolator dannes dråper ved dispensering en vandig løsning, som deretter er avkortet med olje å hindre fordampning (figur 1A). En minimal mengde olje kan bli utlevert til cap slippverktøyet; Imidlertid er det nyttig å dispensere et beløp som fyller hver isolator Vel akkurat slik at olje er flatt for bildebehandling. Isolatorer er enten kommersielt Hentet eller laget av laser cutting akryl ark. Silikon isolatorer er tilgjengelig pre-cut brønner i en 4 x 6 matrise (n = 24), men kan endres til et 4 x 11 utvalg (n = 44) bruker en biopsi eller flere hull skinn punch. Laser kuttet isolator i figur 1B viser en rekke 100 Sekskantet brønner hver med en maksimal diameter på 2.89 mm, et midtpunkt å skille 3,9 mm og en høyde på 0,5 mm. Dråpene lagres og forbli stabil i lengre tid (helligholdt inntil 3 måneder).
Dråper opprettes manuelt ved hjelp av en hjemme-bygget apparater, som betyr en konsentrisk slange munnstykke (figur 1 c), som er koblet til to sprøyte pumper (figur 1A). Konsentrisk slange munnstykke består av en smeltet silica kapillær, som utleverer den vandige fasen, matet via en kort lengde på PEEK rør, som utleverer olje fasen. Bruker et mikroskop, munnstykket er justert til et antistoff sted og pumpene vil først kvitte vannoppløsning etterfulgt av olje (figur 1E, trinn 1-4). Når alle dråper i ADM dannes, brukes en microinjector og micromanipulator (se tabell for materiale) til å laste hver dråpe med en enkelt celle (figur 1 d). Brønnene ville fange en celle fra et reservoar av celler, utlevert i en av brønnene på chip, oversettes til et slippverktøy godt og deretter trenge inn olje cap å levere cellen i vandig slippverktøyet (figur 1 d, trinn 5-8).
Alle steder innenfor dråpene er fotografert før lyse og brukes til å fastslå graden av ikke-spesifikk binding til stedene (figur 2A). Enkeltceller er fullt lysed (inkludert kjernen) ved hjelp av optiske metoder. 31 optisk lysis avhengig klipping kraft av en voksende laser puls-indusert kavitasjon boble å forstyrre cellene. Forsiktighet må gjøres at olje-vann-grensesnittet ikke bli forstyrret av disse prosessene ved å begrense puls energier og innskudd celler fra olje/vann-grensesnittet. Når cellene er lysed, er matrisen fotografert av TIRF mikroskopi bruker en automatisert mikroskop; rammer er ervervet hvert 10 min 30 min og deretter hvert 20 min for ytterligere 60 min. Forholdene, som antistoff affinitet, protein diffusjon og slippverktøy volum, er slik at bindende likevekt er nådd innen 90 min oppkjøpet. En typisk enkeltcelle pulldown vises i figur 2A.
Prosessen med bildeanalyser å finne enkelt molekylet teller er skjematisk avbildet i figur 2B. Bilder av stedene anses enten å være ikke-trafikk, hvor målet protein konsentrasjon er slik at enkelt molekyler er godt atskilt og lett skilles, eller trafikk, hvor målet protein konsentrasjon er høyere og ett molekyl bilder overlapping og er ikke lenger individuelt identifiserbar. Siden TIRF eksitasjon profilen er ujevn, er det avgjørende at alle kjøpt bilder være flat-feltet korrigert. En Gaussian blur brukes til ikke-trafikk ramme, som fungerer som et utjevning filter fjerner detaljer og støy og produsere et bilde med gjennomsnittlig profilen TIRF eksitasjon profilen. Behandlet bildet kan brukes å "flat" originalbildet. For ikke-trafikk bilder, der, selv ved likevekt, det er noen enkelt molekyler, kan en ramme bli behandlet for å rette seg selv. Denne fremgangsmåten gjelder ikke for en trafikk sted, hvor enkelt molekyler tett okkupere stedet og krever bakgrunnsbilde erverves for sammenslåing. Flat rammer er thresholded for bildepunkter med intensiteter minst 3 ganger standardavviket bakgrunn pluss sine middelverdien. Enkelt molekyler registreres deretter automatisk identifisere 4-9 gruppert piksler med sirkularitet større enn 0,5 bruke partikkel analyse funksjoner i Fiji. Fra resultatene, kan gjennomsnittlig intensiteten av et eneste molekyl beregnes. Det brukes til å bestemme antall enkelt molekyler på et overbelastet sted ved å dele antistoff spot totale intensiteten av kjente gjennomsnittlig intensiteten av et eneste molekyl. Denne fremgangsmåten kan automatiseres ved hjelp av Fijis Skriptredigering.
En konsentrasjon serie utføres for å finne ett molekyl greven på likevekt i dråper med kjente konsentrasjoner av rekombinant p53 protein (figur 3A). Forholdene er slik at den fange antistoff flekker fange en brøkdel av samlet mål protein, ca 1% i regionen av linearitet (for 105-108 proteiner per slippverktøy R2 = 0,99). Uspesifisert binding i dråpene er 187 ± 60 molekyler. Resultatene av enkeltcelle pulldowns kan deretter konverteres for å oppnå distribusjoner av absolutt protein kopi tall per celle. Figur 3B viser fordelingen av absolutt p53 protein uttrykk i enkelt være celler ved hjelp av ADMs. P53 protein uttrykk i være celler som kan antas for å være genetisk identiske eller lignende, er en Stokastisk prosess. Fordelingen er Gamma-like - asymmetrisk og unimodal med lang hale. Følgelig gjennomsnittet (1.82 × 106 proteiner) kan overvurdere sperrende protein overflod (bin 0 - 5.0 × 105 proteiner), og standardavviket (1.88 × 106 proteiner) fullt ta ikke funksjonene i distribusjonen. Dette er et eksempel på betydningen av enkeltcelle mål å fange heterogenitet protein uttrykk i celle befolkningen, som ellers ville gå tapt når snitt med bulk mål. Tilleggsparametere for hver celle kan måles. Her, anslås celle volum ved å måle hver celle diameter før lysis i slippverktøyet og antar cellen er ca sfærisk. Figur 3 c viser en sammenligning av p53 absolutt protein antall kopier i enkeltceller skal som en funksjon av Cellestørrelse. Det er en tendens til større celler ha et høyere totale p53 kopi nummer. Interessant, er det mulig fra distribusjon at det er koordinering mellom p53 uttrykk og Cellestørrelse siden det synes å være et minimum p53 kopi tall per celle; men mekanismer som dette oppstår krever videre etterforskning.
Figur 1: adresserbare slippverktøy Microarray apparater og Chip. (en) dråper er utlevert manuelt ved hjelp av en 3-akse manipulator for å oversette en konsentrisk slange munnstykke. Vandig slippverktøyet er utlevert på bestemte steder i et antistoff microarray etterfulgt av capping olje. (b) av isolator kan en høyere tetthet av adresserbare dråpestørrelse på underlaget ved å begrense spredningen av olje. Isolatorer kan produseres av laser cutting 0,5 mm akryl ark. For å hjelpe visualisering av dråper, blå konditorfarge fargestoff settes inn ved hjelp av apparatet i en). Skalere bar 10 mm, innfelte skala bar 1 mm. (c) konsentriske rør dysen lar adresserbare dråper til å bli dannet, samlet i trinn 1.2 av protokollen. (d) en microinjector og micromanipulator brukes til å isolere celler i individuelle adresserbare dråper, forberedt som trinn 1.3 av protokollen. (e) de viktigste trinnene under oppretting og lasting adresserbare dråper vises. Et antistoff sted ligger ved hjelp av en kodet oversettelse stage (1) der spissen av kapillær slangen justeres (2) og vandig (3) deretter olje (4) komponentene er avviklet. Enkeltceller kan lastes inn fra en glass microcapillary (5-8) som kan gjentatte ganger adresse vandig slippverktøyet (7) og sette inn en celle (8). Skala barer 100 µm. Den røde pilen i (5) og (8) understreker den isolerte enkelt cellen og rammemargen i (8) viser den isolerte enkeltcelle på forstørring (skala bar 10 µm). Deler av dette tallet har blitt endret fra referanse12, gjengitt med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Image analyse trinnene. Hver flekk i matrisen er regelmessig fotografert av TIRF mikroskopi til likevekt (tEq) (90 min for p53 analysen). Likevekt tiden avhenger av t løsning som slektskap av antistoffer par for målrettet protein. a) eksempel enkelt molekyl TIRF mikroskopi bilder av bakgrunnen så vel som et eksempel enkeltcelle pulldown (skala barer 20 μm). Innfelt bilde viser en forstørret del av bakgrunnsbilde med noen enkelt molekyler markert med røde piler (skala bar 5 μm). b) omrisset av bildeanalyse detaljert i trinn 3 i protokollen. Kort, det er to brede regimer der stedene anses ikke-trafikk, enkelt molekyler er sparsom og trafikk, der tettheten av enkelt molekyler er slik at det er betydelig overlapping og kan ikke lenger være enkeltvis identifiserbar. Et viktig skritt i bildeanalyse er feltet sammenslåing for å fjerne effekten av ikke-uniform intensitet profilen av eksitasjon laser. I digital telling regimet, er enkelt molekyler identifisert direkte, basert på deres intensitet og figur parametere. I analog teller regimet, beregnes antall enkelt molekyler av måler totalt spot intensiteten på likevekt og dele gjennomsnittlig intensiteten av et eneste molekyl, som er kjent fra digital telling regimet. Trinnene kan automatiseres oversiktlig i ImageJ analysere dataene. Den nedre panelet sekvensen av bilder viser opphopning av målet protein til antistoff fange sted; i utgangspunktet flekker er ikke trafikk (t1) mens som mål protein akkumuleres på antistoff stedet, enkelt molekyler kan bli stadig trafikk (tn) til likevekt er nådd (teq). Merk at om et sted er fortsatt ikke-trafikk eller blir overbelastet avhenger av flere faktorer, spesielt av målet protein i analyse volumet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: enkelt celledata. Absolutt kvantifisering oppnås ved hjelp av en kalibreringskurven. (en) ett molekyl teller er laget ved hjelp av kjente konsentrasjoner av rekombinante proteiner. Dette er en kalibreringskurven og brukes til å konvertere enkelt molekyl telles på hver spot antall mål proteiner i analyse volumet og dermed enkelt celle kopi nummer. Den vannrette røde stiplede linjen angir uspesifisert binding av 187 ± 60 molekyler. Feilfeltene er ett standardavvik for gjennomsnittet 3 eksperimentelle kjører. Den stiplede linjen representerer 100% deteksjon av protein. (b) en fordeling av enkeltcelle basale p53 protein uttrykk i være kreftceller vises viser en langhala gamma-lignende distribusjon der p53 protein uttrykk i noen celler er betydelig høyere enn sperrende verdien. (c) Scatter handlingen i p53 protein kopi tall per celle som funksjonen celle volum viser hvordan protein uttrykk varierer som en funksjon av Cellestørrelse. Deler av dette tallet har blitt endret fra 12 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adresserbare slippverktøy Microarrays er følsom og utvidbart metoder kvantitativt avgjør hvor absolutt kopi av protein i én celle.
Begrenser grad av ikke-spesifikk binding er (NSB) kritisk i protokollen for å oppnå så lavt en grense på oppdagelsen som mulig. Proteiner og andre biokjemiske arter kan nonspecifically binde til et antall grensesnitt stede i dråpene-dekkglassvæske overflaten, antistoffer spot og olje/vann-grensesnittet. Proteiner gå tapt ved partisjonering i grensesnittet eller selve oljen. Vi har vist at 4% BSA i vandig slippverktøyet er i stand til å begrense NSB proteiner med antistoffer angitt i protokollen. Alternative protein mål og antistoffer brukes til å oppdage dem kan kreve alternative blokkerer tilnærminger, slik ikke-ioniske vaskemidler eller kompatibel tensider. Fluorholdige oljer kan også bli testet for deres egnethet i som lokkpåsettingsmaskiner olje. I slike tilfeller må flere hensyn som kritisk micelle konsentrasjon og tettheten av lokkpåsettingsmaskiner oljen gjøres.
Den uvaskede bufferen som utskrift, som fortsatt er på hvert sted sted etter stiller opp hjelpemidler i justeringen. Når først innskudd dråpene, må utvises å ikke klø eller skade antistoff stedet av spissen av konsentriske slange munnstykke. Utvikle metoden videre, kan en fluorescerende farge være dopet i antistoff utskrift bufferen som blir immobilisert i tillegg til fange antistoffer. Dette ville tillate for vask og blokkerer trinnene utføres før slippverktøy stiller opp; men ville slikt skritt ikke nødvendigvis være nødvendig hvis bruker automatiserte metoder for slippverktøy stiller opp som for eksempel inkjet utskriftsmetoder.
Overflaten av kommersielt Hentet coverslips dråper dannes som er belagt med en hydrofile polymer og vandig dråpene produsert dem med et volum på 10 nL har en diameter på 751 ± 42 mm. Det er en grense for hvor mye avsatt slippverktøyet bør våt overflaten eller sprer vekt lokkpåsettingsmaskiner olje siden under minimum tykkelse er det økt optisk scatter fra TIRF eksitasjon laseren. Scatter øker gjennomsnittlig bakgrunn og kan overdøve signal å oppdage enkelt molekyler. Antistoff stedet må også befinne seg fra dråpe kanten siden eksitasjon laserlys kan delvis eller fullstendig strike et område utenfor vandig slippverktøyet. Kritisk vinkel tilstanden vil ikke lenger bli møtt for lett slående glass-olje grensesnittet i motsetning til glass-vann-grensesnittet.
For å fastslå kvantitativt overflod av protein antallet enkelt molekyler er bundet til et sted må bestemmes gjennom bildeanalyser. For å bestemme totalen mengden protein i løsning fra ett molekyl teller en kalibreringskurven kreves og gjør teknikken skal absolutt kvantitative.
For å minimere photobleaching, flekker er ikke avbildet kontinuerlig og kraft TIRF eksitasjon laser kilden er minimert. Protokollen som presenteres har vært brukt med hell i photostable fluorophores som Alexa Fluor fargestoffer. Alternativt fluorophores kan brukes, men photobleaching må vurderes og tenkelig protokollen tilpasset om nødvendig. Totalt antall enkelt molekyler per bilde kan tegnes mot tiden for å reprodusere bindende kurven selv om dette ikke er absolutt nødvendig hvis bindingen kinetics ikke søkt og tenkelig et enkeltbilde på likevekt vil være nok.
Selv om det er et krav for to høy affinitet antistoffer, resulterer dette i en svært følsom og svært spesifikke analysen, avgjørende for målinger på én cellenivå. P53 antistoffer i denne protokollen er godt optimalisert oppdage gratis p53 fra enkeltceller. Målet protein bestemmes av antistoffer og kan endres på en rekke måter: 1, begge fange og oppdagelsen antistoffer kan erstattes for å binde alternativ mål; 2, oppdagelsen antistoffer kan erstattes for å undersøke protein-protein interaksjoner eller post-translasjonell endringer protein bundet til fange antistoffer, f.eks fastslå statusen fosforylering fanget p53; 3, multiplekset analyser kan oppnås ved å skrive ut flere fange antistoff flekker i nærheten-utskrift en 3 × 3 spot matrise er mulig innenfor 10nL dråper. Selvfølgelig for enhver endring av målet protein en rekke antistoff skjermer, må kontroller og optimaliseringer foretas.
Flere metoder for lysing enkeltceller er rapportert. 33 optisk lysis er en kjemisk fri tilnærming til raskt lyse individuelle celler uten å endre innholdet i celler og opprettholde integriteten til proteiner og deres komplekser. Kjemisk lysis bruker rengjøringsmidler utgjør et problem til integriteten til dråpene når du bruker mineralolje og kan forstyrre interaksjoner mellom molekyler. 34 men for analyser der kjemiske lysis er kompatibel er det tiltalende tilnærming siden det ikke er avhengig av utstyr som lasere eller micropatterned elektroder. 35
Dråpene viste sammenlignbar ytelse med alternative enkeltcelle metoder. I den nåværende generasjonen av dråper med foreslåtte p53 antistoffer, er nivået av NSB 187 ± 60 molekyler per sted. Ett molekyl teller viser sterk linearitet (R2 = 0,99) i regionen spenner 105-108 rekombinant p53 proteiner per slippverktøy. Dette tyder på at mens lavere nivåer av protein kan registreres i celler, det er en grense for kvantifisering av 105 p53 proteiner; Dette tilsvarer en enkel molekyl teller på flekker av 901 ± 83. Dette er hovedsakelig begrenset av antall dråper og adsorberes i grensesnittet. Resultatene av p53 analysen er slik at når utført i en 10 nL volum bare 1.1 ± 0,2% av samlet mål protein tatt fra løsning; Dette øker til 85 ± 9% når redusere analyse volumet til 0,2 nL. 36 ved å redusere volumet av dråper til under 1nL og redusere adsorpsjon, er potensielle bruker de angitte Antistoffene mot p53 i å forbedre grensen for påvisning til < 50 proteiner per celle. Derfor har adresserbare dråper potensial til å bli brukt til å måle svært lav overflod proteiner fra enkeltceller.
Adresserbarhet til dråper by av lett penetrable olje cap tillater celle analyse volumet skal utfordres sekvensielt. Bruk av brønnene kan injeksjon av et ønsket antall celler i hver dråpe i en plugg av 10-20 pL, som ikke øker volumet betydelig. For chip vist i figur 1B med 100 brønner, å danne dråper og laste dem med enkeltceller vanligvis tar 75-90 min. lasting celler kan også oppnås ved adressering slippverktøyet konsentriske rør munnstykket i stedet for brønnene eller bruke en løsning som inneholder celler når utgangspunktet danner dråpene. Sistnevnte vil være nyttig i å begrense antall trinn i protokollen men i begge tilfeller, belegget per slippverktøy ville følge en Poissonian distribusjon. Dette ville begrense andelen enkeltcelle data per brikke; Imidlertid ville dråper med null eller flere celler tjene som kontroller. En ekstra begrensning ved konsentriske munnstykket til adressen dråper er slippverktøy volumet vil øke i 10nL intervaller. Med de foreslåtte endringene over dette kan forbedres. På prosessoren dråpe microfluidics kan produsere dråper på høy frekvens og har potensialet i blir automatisk kombinert med ADMs å produsere og manipulere dråper og sekvensielt sette dem i en plan matrise. Dette ville sikkert overvinne begrensningene i produksjon av ADMs samtidig også ett molekyl avlesning av dråper.
Muligheten til å ta hvert individuelle slippverktøy har en rekke mulige bruksområder. Vi har vist evne til å laste sekvensielt enkeltceller. Det tillater også fjerning av ubundet mobilnettet materiale innlegget lyse og innlegget analyse av pipette for analyse ved hjelp av andre metoder. Eksempler på påfølgende analyse ville være kvantitative sanntid PCR eller massespektrometri.
En av gjeldende flaskehalser for laboratorier som ønsker å ta en kvantitativ tilnærming til enkeltcelle protein analyse er høyt teknisk barrieren og behovet for spesialisert utstyr. Med ADMs, miniatyriserte, kan høy følsomhetsanalyser oppnås uten behov for rene rom å dikte microfluidic lab-på-chip enheter. Eksperimenter er ikke begrenset til utformingen av chip og deres volum og posisjon kan endres uten behov for fabrikasjon nye originaler. Selvfølgelig er det rom for forbedring forenkle teknikken og senke barrieren til oppføring til én celle analyse til bare en microarrayer, skrive ut både antistoff og slippverktøy microarrays og fluorescens microplate leser, bildet.
En rekke kliniske applikasjoner enkelt celle analyse er nye, spesielt i behandling av kreft. Svulst heterogenitet er en stor utfordring å effektiv kjemoterapi. I svulst utvikling, mutasjoner oppstår med økende frekvens og heterogenitet kan føre morfologiske, genetisk, og proteomic. Enkelt celle analyse er kjøpedyktig løse mobilnettet heterogenitet innenfor en svulst og gir en plattform for å bedre forstå og forutse narkotika motstand og guide terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
ASR designet eksperimenter, utviklet protokoller og analysert data. SC og PS utført celle størrelsen eksperimenter. ASR og OC skrev manuskriptet. Forfatterne vil takknemlig anerkjenner støtte fra Professor David R. Klug for å gi tilgang til utstyr. Forfatterne ønsker å takke de Imperial College avansert Hackspace for tilgang til fabrikasjon og prototyping fasiliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al.
- Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
