Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Published: July 6, 2018 doi: 10.3791/56110
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Burada adresli damlacık microarrays (ADM'ler), bir damlacık array tabanlı yöntemi mutlak protein bolluk içinde tek hücreleri belirlemek mümkün mevcut. Biz heterojenite tümör baskılayıcı protein p53 bir insan kanser hücre satırı ifade derecesinin ADM'ler kapasitesini göstermek.

Abstract

Sık sık hücresel davranış ve hücresel yanıt nerede birçok hücre yanıtları birlikte zengin tek hücre davranış karmaşık bir nüfus içinde maskeleme ortalama bir sonucu olarak havuza nüfus düzeyinde analiz edilir. Tek hücre proteini algılama ve miktar teknolojileri son yıllarda kayda değer bir etki yapmış. Burada bir pratik ve esnek tek hücre Analizi platform adresli damlacık microarrays üzerinde tabanlı açıklayın. Bu çalışma nasıl hedef proteinler mutlak kopya sayısına tek hücre çözünürlük ile ölçülen açıklar. Tümör baskılayıcı p53 ile toplam kanser vakalarının bir sigara sağlıklı p53 ifade deseni sergileyen % 50'den fazla insan kanseri en sık mutasyona uğramış gen var. Protokolü ile tam ifade değişkenlik belirlemek için tek molekül kararlılık içinde olan tek insan kanser hücreleri izole edilmiştir ve p53 protein kopya sayısı ölçülen 10 nL damlacıkları oluşturmak için adımları açıklar. Yöntem ilgi herhangi bir hedef proteinler mutlak kopya sayısını belirlemek için birincil malzeme dahil olmak üzere herhangi bir hücre türüne uygulanabilir.

Introduction

Bu yöntemin amacı bereket bir hedef proteinin hücre popülasyondaki özneleri, tek hücre çözünürlük varyasyon tespit etmektir. Tek hücre Analizi birçok geleneksel ensemble biyokimyasal yöntemlerle kullanılamaz avantaj sağlar. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 öncelikle, tek hücre düzeyinde çalışan nüfusunun geleneksel ensemble biyokimyasal teknikleri ile oluşan sayı ortalaması alınarak kaybeden bir hücre zengin heterojenite yakalayabilirsiniz. Genellikle yapmak gibi çoğu iş-at biyokimyasal Yöntemler ile toplu, gerektiren, milyonlarca hücre bir sonucu elde etmek için çalışır. Tabii ki, tüm hücre popülasyonlarının değerlendirme sonuçlarını bağlı bir dizi faktöre, örneğin, heterojenite protein ifadesindeki nerede bazı önemli özellikleri protein bereket dağılımı özledim. Pratik bir bakış açısından, tek hücre teknikleri gerekli hassasiyeti onları çalışmaya bile daha duyarlı toplu teknikleri için yetersiz biyolojik malzeme miktarları ile çalışma yeteneğine sahip olun. Bu anahtar bir örnek gibi tümör hücreleri (CTCs) nerede kötü prognostik outlook olan hastalar için bile 10 CTCs bir tek 7.5 mL kan mevcut olabilecek daha az çizmek dolaşan nadir hücre tipleri çalışmadır. 6 burada tek hücre proteini ölçümleri antikor tabanlı tahlil petrol şapkalı damlacıkları istihdam bir antikor Mikroarray baskılı azaltılmış bir birim için gerçekleştirmek için gereken yöntemi mevcut.

Mikrosıvısal damlacık platformlarına yüksek işlem hacmi, damlacıkları ikinci ve yetenekli yalıtma ve hatta kültür, tek hücre başına binlerce bireysel damlacıkları biyokimyasal testleri geniş bir dizi gerçekleştirmek için elde edebilecektir. Damlacık tabanlı teknikleri de tek hücre analizi,7,8,9 ile hangi büyük ölçüde gücüyle destekli DropSeq1110 ve inDrop, dahil olmak üzere önemli son örnek için uygundur güçlendirme teknikleri. Malzeme sınırlı miktarda amplifikasyon hiçbir yöntem proteinler için yapmak ve tek hücre proteomik özellikle zorlu.

Damlacıkları birkaç yöntem tarafından analiz edilecek ve floresans mikroskobu yaygın olarak kullanılmıştır. Toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi gibi tek molekül teknikleri ile eşsiz sinyal-gürültü oranı görüntülenmeyecektir floresan molekülleri sağlar. 12 fani alan üstel çürümesi nedeniyle, TIRF iyi bir strateji karmaşık bir karışımı bir hedef molekül küçük miktarlarda saptamada yapma sadece fluorophores (sırasıyla 100nm) yüzeyine yüksek birbirine heyecanlı mısın. Zaman ve karmaşıklık sınırları tahlil ve TIRF doğal optik parça gücünü de yıkama adımları önlemek için yardımcı olur. Ancak, TIRF düzlemsel yüzeyler gerektirir ve bir düzlemsel yüzeyine hangi görüntü oluşumu damlacıkları akışı uygulanan TIRF mikroskobu örnekleri içerir. 13 bu amaçla, tek hücre proteomik teknikler kez mikrosıvısal çip çevresinde yüzey immobilize yakalama ajanlar bir Mikroarray biçimde tasarlayın. 4 , 14

Damlacıkları, kendilerini, düzlemsel yüzeylerde, sözde damlacık microarrays dizilerde oluşmuş. 15 , 16 , 17 dağınık şekilde organize damlacıkları dizilerden onlara uygun dizine, kolayca zaman içinde izlenen, ayrı ayrı ele alınması ve gerekirse, alındı sağlar. Damlacık microarrays yüksek yoğunluklu mikro-reaktörler müstakil veya microwell yapıları tarafından desteklenen elemanları küçük parça başına binlerce elde edebilirsiniz. 18 , 19 , 20 oluşturdular tarafından sıvı işleme robotlar, mürekkep püskürtmeli spotters, sıralı ifade tarafından microarrayers21,22,23,24,25, iletişim 26 ya da kendi kendine bir araya superhydrophillic gibi yüzeylerde lekeler desenli bir superhydrophobic yüzeye. 27 , 28 , 29

Bunu göz önünde bulundurarak, adresli damlacık Microarrays (ADM'ler) çok yönlülük, kayma adreslenebilirliği ve damlacık microarrays düşük hacimli teminatlarının tek molekül TIRF Mikroskopi için duyarlılık ile birleştirmek için tasarlanmıştır protein bereket ölçmek. 5 daha sonra buharlaşma önlemek için yağ ile kaplıdır bir antikor Mikroarray üzerinde tek hücreleri içeren bir damlacık Mikroarray oluşturan tek hücre Analizi ADM'ler etkinleştirin. Damlacıkları hacimleri üstünde-küçük parça içinde sürekli akışı Havacilik valving tarafından elde örnek kaybını önlemek için ayrı. 30 hedef protein tek bir hücreden mutlak miktarı son derece küçüktür; Ancak, damlacıkları azaltılmış hacmi için nispeten yüksek yerel yoğunlaşması sağlar bir sandviç antikor tahlil kullanarak algılanır - antikor ayrı bir bölgede ya da nokta, hangi sırayla bağlayan protein yakalar bir yüzey üzerinde immobilize umulur ki için bir fluorescently etiketli algılama antikor damlacık hacmindeki mevcut. Bir etiket içermeyen bir yaklaşım (yani protein hedefler doğrudan etiketli gerek yok), ADM'ler işlenmiş kan gibi birincil kaynakları hücrelerinden analiz için genellikle tabidir, iyi örnekleri ve Disosiye tümör biyopsi yanı sıra kültür hücrelerden gerekir ve onların lysates.

Buna karşılık, örneğin, heterojen bir ilaç belirlemede önemlidir varyasyon protein bolluk içinde bir hücre nüfus arasında ölçme ve hücresel işlevler ve yollar, altgrupları değerlendirme sağlamada yardımcı olacak ve onların Aksi takdirde toplu yöntemlerle maskeli nadir olayları tanımlayın yanı sıra davranış. Bu iletişim kuralı üretmek ve adresli damlacık microarrays kantitatif transkripsiyon faktörü p53 insan kanser hücrelerinin içinde bolluk belirlemek için nasıl kullanılacağını açıklar ve p53 kemoterapötik ilaçlara yanıt rolünü araştırmak için kullanılabilir olur. Hedef protein yakalama ve algılama antikorları seçimi ile belirlenir ve daha fazla veya farklı hedefleri içerecek şekilde değiştirilmiş. Genel Laboratuvar sarf malzemeleri el ile yağ ile şapkalı 10 nL damlacıkları dizi için gelen eş merkezli bir meme birleştiren bir basit aparatı oluşturmak için yönergeler sağlanmıştır. Her damlacık sonra sonra lysed tek bir hücre TIRF mikroskobu kullanılarak tek molekül çözümleme ile belirlenen protein ifade dolu olan sayede tam deneysel işlemi açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlık

  1. Cips ve yazdırma antikor microarrays olun
    1. Bir yapışkan silikon/akrilik izolatör bir antikor Mikroarray desteklemek için functionalized bir coverslip ekleyin. Bu kozu olarak adlandırılır.
      Not: Çeşitli yüzey kimyaları adresli damlacıkları ile uygunluk için test edilmiştir. 5 yüzey kimyaları alternatif yakalama maddeleri için optimize edilmiş olması gerekir. ADM izolatörler ticari olarak kullanılabilir veya lazer kesim akrilik tarafından üretilen (CAD için bu çalışmada kullanılan izolatör bir yükleme olarak sağlanan dosya; Ek kod dosyasınabakın).
    2. Microarrayer üzerinde geçiş ve nem % 75'e ayarlayın.
      Not: bağıl nem yazdırma çözümü buharlaşma Mikroarray iğnesinden azaltır ve içi ve arası spot varyasyon azaltır.
    3. Mikrodizi PIN PIN tarafından ultrasonication temizleme solüsyonu 5 min için temiz. PIN bir yıkama şişe kullanarak ultra saf su ile durulayın ve nitrojen kullanarak kuru.
      Not: yalnızca toplu iğne ucu sokmak için PIN askıya alma. Pim tutucu aldıysanız mikroskop slayt uygun şekilde açılmış bir set delikleri ile yardımcı olacaktır.
    4. 3 × Serum sodyum sitrat (SSC) arabelleği, 1.5 M betan % 0,01 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ile desteklenen Yazdırma arabelleği oluşan 5 mL olun. 4 ° C'de süresiz olarak depolar.
    5. Yazdırma çözüm hazırlamak için anti-p53 antikor çözülme (p53/Mdm2 ELISA kiti; malzemeler tablo bakın)-80 ° C'de depolanan aliquots Yazdırma arabelleği için 0,5 mg/mL nihai bir konsantrasyon ile karıştırın 1:1. 5-10 µL bir micropipette kullanarak 384 bir şey plaka baskı çözüm yük ve microarrayer içinde yer.
    6. 1.1.1. adımda microarrayer monte cips yükleyin. Her şey İzolatör Merkezi tarafından tanımlanan koordinatları spotları yazdırmak için microarrayer program.
      Not: Microarrayers bir dizi istihdam ağırlıklı olarak, özel mülk yazılım ve okuyucu ilgili edebiyat danışmak için teşvik edilmektedir. Adım 1.1.1 eşlik eden CAD dosyasında özellikli ADM İzolatör için gerekli Mikroarray dikdörtgen öğelerini kapsar; ilgili mesafeler sağlanır.
    7. Fişleri hava geçirmez kaplarda saklayın ve folyo ile sarın. 6 haftalık 4 ° C depolama yapar.
      Not: Folyo fotoğraf zarar önlemek içindir. Depolama 4 ° C'de biomolecules ve Mikroarray etkinliğini azaltmak için hareket edebilir herhangi bir zararlı reaksiyonlar bozulma hızı sınırlar. Hava geçirmez bir kaba çip yüzeyinde şekillendirme yoğunlaşma olmadan kullanmadan önce oda sıcaklığına equilibrate için fiş sağlar. Mikrodizi yazdırma patlatır yüzey gerilimi ve yazdırma çözüm ve noktalar üretmek için baskı yüzey arasındaki yapışma başvurun. Önceden yazdırma veya kurutma normalde fazla çözüm birörnek boyutlu lekeler vermeye Mikroarray iğnesinden kaldırmak için gereklidir. Toplu iş kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir beri kurban önceden yazdırma coverslip atmayın.
  2. Şırınga, hazırlamak adresli damlacıkları dağıtımı için Borulama ve konsantrik parke bașlığı
    1. (İçin sulu damlacık) 100 µL sökmeye ve 1 mL (için kapatma yağı) Hamilton şırınga cam ve distile H2O. bölümleriyle durulama
    2. 150 µm 100 mm uzunluğunda besleme kimliği/360 µm OD erimiş silis boru 1.0 mm ID/1/16 40 mm uzunluğu ile "tarafından 2 mm dışarı çıkar kadar OD PFA boru. Bu konsantrik meme oluşturacak.
    3. 10 µL Pipet Ucu ucuna cyanoacrylate tutkal ince bir tabaka uygulayın ve 1.0 mm ID/1/16 40 mm parça içine ekle "OD PFA boru. Gerekirse, yapışkanlı setleri önce meme, 2 mm çıkıntı korumak için erimiş silis boru yeniden konumlandırın.
    4. Erimiş silis kılcal diğer ucunu 200 mm uzunluğu 0,014" kimliği/0.062 ucunu bağlayın" OD PTFE boru ve bu Hamilton şırınga % 4 Sığır serum albümin (BSA) ile dolu bir 100 µL fosfat tamponlu tuz (PBS) (PBSA Web site) bağlanın.
      Not: Protein ve diğer biyokimyasal türler özel olarak sigara yüzeylere bağlamak kaybetti ve denatüre. BSA 'non-spesifik bağlama sacrificially Bu yüzeylere bağlayarak en aza indirmek için yüzeyler engellemek için ' kullanılır.
    5. Bir mühür oluşturur kadar 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP boru 400 mm uzunluğu 200 µL pipet ucu sokun. Başka bir 200 µL pipet ucu cyanoacrylate tutkal ince bir tabaka uygulayın ve bu tüp burada düzeltmek için ilk ipucu içine itin. 1 ml Hamilton şırınga mineral yağ ile dolu 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP boru açık ucunu bağlayın.
    6. 200 µL pipet ucu derleme 10 µL pipet ucu konsantrik meme yerleştirin. Onlar bağımsız olarak ameliyat olmak ihtiyacınız olacak gibi şırıngaları ayrı şırınga pompaları yerleştirin.
    7. 100 µL şırınga %4 PBSA Web site engelleme çözüm ile doldurun. Yeniden bağlayın ve engelleme Çözümle 'sulu' boru temizleme. Toplamda 3 basması için iki kez tekrarlayın.
    8. %4 PBSA Web site ve yeniden taktığınızda boru 0,125 µg mL-1 algılama antikoru (anti-p53 antikor (-1) ile Alexa 488 etiketli) ile 100 µL şırıngaya doldur. Boru içinde engelleme Çözüm dağıtım 25 tarafından yerine µL algılama antikor çözüm.
    9. Tüm boru ve meme doldurur kadar yağ ile 'Petrol' boru mineral yağ ile yıkayın. Mineral yağ ile 1 mL şırınga dolum ve boru re-attach. XYZ manipülatör boru ve meme derlemeye güvenli.
  3. Microinjector ve micromanipulator hazırlamak
    Not: Aşağıdaki adımları microinjector ve malzemeler tablo belirtilen micromanipulator aparatı bileşenleri belirli başvuru yapmak, ancak genellikle bu tür cihazlar için geçerlidir.
    1. Microinjector basınç boru ve kapiller tutucusu ekleyerek birleştirin.
    2. Mineral yağ tamamen çizgiyi dolduracak kadar yavaş yavaş piston arama döndürün.
    3. Kapiller tutucu çeviri baş bağlama monte.
    4. Kılcal damar kılcal sahibi kavrama kafa ile düzeltmek.
    5. % 4'lük bir çözüm pipette PBSA Web site içine bir izolatör Wells.
    6. Micromanipulator kullanarak çevirmek ve kılcal ucu çözüm içine bırakın.
    7. Yavaş yavaş kılcal %4 PBSA Web site ve bırakın 10 dakikadır blok ile doldurun.
    8. Microcapillary çıkarma ve böylece derleme çipi açıktır çeviri modülü döner.

2. form adresli damlacıkları ve yük ile tek hücre

  1. Form adresli damlacıkları
    1. Belgili tanımlık küçük parça mikroskop sahne alanı'nda güvenli.
      Not: Otomatik mikroskop tek molekül TIRF yetenekli donatılmış ile ters bir floresan mikroskop olan bir kodlanmış bir XY sahne ve şarj kuplajlı cihaz kamera (EM-CCD) çarparak bir elektron.
    2. Mikroskop sahne alanı koordinatlarına her spot otomatik mikroskop kontrol yazılımı kullanarak dizi kaydedin.
    3. XYZ manipülatör mikroskop sahne alanı'nda ayarlayın. Meme 50-60 ° lik bir açıyla yerleştirin. Meme yeterli uzunlukta ve çip ulaşmak için izni olduğundan emin olun. Set 'sulu' ve 'Petrol' şırınga 10 dağıtmak için pompalar nL 100 µL/dk ve 5 µL 100 µL/dk, anılan sıraya göre.
      Not: hazırlık sırasında meme başında sulu çözüm kuru.
    4. Sıvı bir boncuk meme başında görünene kadar sulu çözüm dağıtmak. Bunu kaldırmak için toz ücretsiz temizleme işlemi ile kurulamak.
      Not: koşullar altında soruşturma sayısına bağlı olarak, kuyu rezervuar hücrelerin olarak hizmet verecek bir dizi saklıdır. Bir tek hücre satırı/türü için tek bir rezervuar yeterli olacaktır.
    5. Otomatik mikroskop kontrol yazılımı kullanarak, coverslip yüzeyinde bir antikor nokta dizi ve odak için mikroskop sahne alanı koordinatlarına ayarlayın.
    6. Dikkat et de rahatsız etmeyin XYZ manipülatör kullanarak spot, cam kapiller antikor nokta tarafına konsantrik meme hizalayın ve 10 dağıtmak nL sulu çözüm. Belgili tanımlık sahne hareket olmadan, sulu çözüm kap petrolün 5 µL dağıtmak. Yavaş yavaş damlacık açık meme büyütmek ve de geçmek.
    7. Dizideki her antikor noktalar için 2.1.6 arasındaki adımları yineleyin.
    8. 30 dakika sonra arka plan her antikor hücreleri önce yükleme spot bağlı tek moleküllerin belirlemek için otomatik mikroskop kontrol yazılımı kullanarak dizideki tüm noktalar görüntü.
  2. Yük hücreleri ile adreslenebilir damlacıkları
    1. Hücre kültür şişeler kuluçka makinesi kaldır ve tripsin/EDTA çözüm kullanarak hücreleri ayır.
      Not: Bu çalışmada BE insan kolon karsinomu hücre kültürünü kullanıldı ve Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 (v/v) fetal Sığır serum (FBS) CO2 kuluçka ile takıma DMEM) kullanarak kültürlü.
    2. Gerekirse, fluorescently hücreleri leke.
      1. Hücrelerde 0,125 μg/mL algılama antikoru (anti-p53 antikor (-1) ile Alexa 488 etiketli) çözeltisi % 10'luk resuspend FBS L-15 medya. Bir tek hücre süspansiyon emin olmak için bir 40 µm pitch hücre süzgeç aracılığıyla hücre çözümü filtre.
    3. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve seyreltik veya hücre çözümü 25-400 × 103 hücre/mL konsantrasyonu konsantre. Bu o hücreleri tortu ile rahat microcapillary işlemek için yeterli aralığı sağlar.
    4. Tek hücre micromanipulator ve microcapillary kullanarak hücre rezervuar adresli damlacıkları içine yükleyin.
      Not: Sigara yapışık hücreleri toplu micropipette içine yüklenebilir ve tek tek adresli damlacıklar halinde reçete. Yüzey engelleme tedaviye rağmen yapisan hücre hatları olmayan özellikle cam microcapillary iç duvar için sopa ve kayıp eğiliminde olacaktır.
    5. 10 × amacı istimal gözlemlemek, tek bir hücre hücre rezervuar microcapillary içine Aspire edin için microinjector kullanın.
    6. Eğer bir elektronik manipülatör sahne kullanarak micromanipulator sahne alanı koordinatlarına depolamak veya el ile z konumunu not edin.
    7. Micropipette yukarı doğru 1 mm yükseklik çipin temizlemek için çevirerek geri çek. Bu el ile oyun çubuğu veya bir elektronik manipülatör sahne alanı'nın 'Çıkar' özelliği kullanılarak otomatik olarak gerçekleştirin.
    8. Sahne adresli bir damlacık kullanarak mikroskop kontrol yazılımı otomatik olduğunu eşgüdümünü sağlar küme. 'Micropipette saklı (ya da kaydetti) z-konuma döndürerek enjekte'. Bu el ile gerçekleştirmek bir joystick ile ya da otomatik olarak bir elektronik manipülatör sahne kullanıyorsanız.
      Not: Microcapillary kapatma petrol işlemek ve adresli damlacık sulu bölümünde içinde yer.
    9. Microinjector kullanarak adresli damlacık hücreye dağıtmak. 10 nL adresli damlacık hacmi az % 1 oranında artacak.
    10. 2.2.5-2.2.9 nerede adresli damlacıkları bir hücre içeren bazı deneysel kontrol için serbest bırakarak kalan adresli damlacıkları için yineleyin.
      Not: tek hücreleri bir microcapillary ve micromanipulator kullanarak adresli damlacıkları yükleme için basit bir alternatif çözüm adım 1.2.8 algılama antikor %4 PBSA Web site içeren hücrelere 10 sırasına bir konsantrasyon, bir çözüm ile değiştirmektir 5 hücre/mL, 1 cep/10 için eşdeğer nL. Tek hücre doluluk Poissonian olacak ve hücre konsantrasyonu optimize edilmiş olması gerekir.
  3. Hücreleri ve görüntü dizi parçalayıcı
    1. Görüntü hücrelerde aydınlık alan mikroskobu, herhangi bir floresan görüntüleme dahil olmak üzere kullanarak damlacıkları.
      Not: Görüntüleme ~ 100 damlacıkları otomatik bir mikroskop kullanarak görüntü için yaklaşık 3 dakika sürer. Görüntüleme gerçekleştirmek 1,49 petrol-daldırma amacı ile 60 NA =. Hiçbir filtre Standart filtre kümeleri floresans görüntüleme için kullanılır, ancak aydınlık alan görüntüleme için gereklidir.
    2. Tek molekül TIRF mikroskobu kullanarak dizideki tüm noktalar görüntü.
      Not: Ayarları adım 2.3.1 ile özel bir TIRF kümesi filtre olarak kullanılır. Bu görüntüleri daha sonra bölümünde 3 tek moleküllerin her antikor spot lizis önce bağlı arka plan belirlemek için incelenecek. Toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi kullanarak tek molekül görüntüleme ~ 100 noktalar görüntü için yaklaşık 5 dakika sürer.
    3. Adresli bir damlacık hücrede odaklanmak. Bir tek 6 odaklanarak tam optik lizis elde ns lazer darbe (dalga boyu 1064 nm, nabız enerjileri 14,1 ± 0,3 µJ darbe başına) hücrenin konumu yakın.
      Not: Lazer darbe kadar genişleyen bir Kavitasyon kabarcık o makası hücre ayarlar ve hücresel bileşenlerinin damlacık ses özgür kılar. 4 , 31 mekanik işlemler nedeniyle lazer kaynaklı lizis düşük nabız enerjileri yağ-su arayüzü rahatsız etmeyin. Optik lizis genellikle 100 hücreleri parçalayıcı için yaklaşık 20-30 dakika sürer. Tartışma bölümünde açıklandığı gibi optik lizis kurulum mümkün değilse tek hücreleri parçalayıcı için alternatif yöntemler vardır.
    4. Nerede adresli damlacıkları un lysed bir hücre içeren 5 deneysel kontrol için özgür bırakarak tüm hücreyi içeren adresli damlacıkları için yineleyin.
    5. Hangi her hücre lysed zaman unutmayın.
      Not: Bu kez adım 3.1.9 her yerde için bireysel bağlama eğrileri düzeltmek için kullanılır. Sık sık kere ne zaman ilk ve son hücre lysed ve lizis olaylar arasında yeterince tutarlı bir zaman varsayarak dinlenme tahmin Not yeterlidir.
    6. Tek molekül görüntüleri ilk 30 dk sonra her 20 dk daha fazla 60 dakika için tüm noktalar her 10 min TIRF mikroskobu kullanarak elde. Equilibrium'da bağlı protein miktarı ilgilenen yalnızca, tüm noktalar küçük parça için oda sıcaklığında 90 dk kuluçka sonra görüntü.
      Not: damlacık hacmi ve tahlil kullanılan antikor benzeşim denge ulaşmak için zaman bağlı olacaktır. TIRF mikroskobu bir lazer uyarma kaynağı kullanarak gerçekleştirilir, 488 = nm ve bir optik güç metre kullanarak arka diyafram açıklığında ölçülen 1,5 mW güç. Satın alma ayarlarını 900 ms satın alma süresi, 16-bit sayısallaştırma 1 MHz okuma oranı EM-CCD kamera ayarlayarak tek molekül görüntüleri elde ve bir EM kazanç faktörü 10. İzolatör dikkatle coverslip kaldırarak yeniden kullanılabilir.

3. veri analizi

  1. Tek molekül (yığılması/dijital olmayan rejimi) sayma
    1. Fiji (veya Matlab) için herhangi bir antikor sıkışık olmayan nokta kullanarak lysis (arka plan, BKD) daha önce alınan resim yükleyin.
      Not: Aşağıdaki adımlarda operasyonlar delikanlı Fiji görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Bir kullanma kılavuzu aşağıdaki bağlantı https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html bulunabilir.
    2. Fiji'de, BKD görüntüyü seçin. "Görüntü" menüsü altında "Yinelenen" yinelenen BKD için seçin. Yinelenen görüntü seçin ve "işlem > filtreler altında", "Gaussian Blur" seçeneğini belirleyin ve 50 piksel yarıçapı belirtin.
    3. Böylece uyarma ışık kaynağı etkili Tekdüzen yoğunluk dağılımı BKD_FLAT üreten bulanık BKD görüntü tarafından BKD görüntü bölerek BKD Görüntüyü Düzleştir.
      1. Altında "Süreci" select "görüntü hesap makinesi...", "Böl", operasyon görüntüleri gerekli, belirtme ve kutuları "Oluştur yeni pencere" ve "32-bit (float) sonuç." seçerek
    4. Resimdeki her piksele 1 tarafından çıkarma ("işlem > Matematik", "Çıkarmak..." seçeneğini seçin ve 1 değerini belirtin). Ortalama piksel yoğunluğu 0 olmalıdır.
      Not: düzleştirme alanını seçin ve düzleştirilmiş arka plan resimleri kolayca tüm pikseller toplamı 0 olmalıdır ve kalan herhangi bir sapma daha delikanlı için telafi edilebilir beri kontrol.
    5. 50 piksel × 50 piksel alanını BKD_FLAT görüntü 4 köşe birini seçin. Piksel yoğunluğu Standart sapma (σ) "Analiz" ve "Ölçü" seçerek ölçmek.
      Not: Özet istatistikler seçimin sonuçları penceresinde sunulacak. Bu off-spot arka plan belirler tek moleküllerin yüksek yoğunluklu olması pek mümkün olduğu. Ölçülecek alan el ile varsayılan menü seçim araçlarını kullanarak seçilebilir veya makroyu çalıştırarak kodu "makeRectangle (x, y, genişlik, yükseklik)"; Bu dikdörtgen bir seçim oluşturur nerede x ve y bağımsız değişkenler sol üst koordinatlarını (piksel cinsinden).
    6. 3σ için görüntü eşik ayarlayın ve ikili resim SM_MASK oluşturun.
      1. "Görüntü > ayarı", altında "Eşik..." seçeneğini seçin ve 3σ için alt eşik düzeyini ayarlayabilirsiniz.
        Not: piksel değeri vardır eşiğin altına sıfır olarak ayarlanır ve eşiği aşan piksel 1 olarak küme. Eşik ile thresholded piksel için tek bir molekül ait güven belirleyecek.
    7. Kesimli resimdeki SM_MASK, set pixel yoğunluk değerleri sıfır bir Döngüsellik 0,5 - ve 4-9 pixel2 boyutu var mı herhangi bir nesne için "Analiz moleküller tarafından" 1 "Analiz" seçerek ardından ve boyutu ve ürün reçetesinde döngü belirtme.
      Not: Piksel boyutu diğer fluorophores ve mikroskop kümesi için optimize edilmiş olması gerekebilir ups. Kamera gürültü türü nedeniyle tek piksel bu eşiğin olabilir ve tek molekülleri olmama rağmen atılmak değil. Piksel boyutu ölçütü doğru böyle piksel iptal edecektir. Şeklinde genellikle dairesel tek moleküllerdir. Değeri 0 yaklaşıyor giderek uzun bir şekil gösterir, ancak tam bir daire 1 Döngüsellik değeri gösterir. Kalan nesneleri tek moleküllerdir ve sayılır. Bir maske nokta üzerinde ayırımcılık için yer alan ayırma için ayarlanmış olabilir ve nokta kapalı çerçeve başına sayar. Bu, daha sonraki zamanlarda alınan çerçeveleri için kolaydır sonra önceki kare için uygulanabilir bir yeterli sinyal nokta üzerinde olduğunda.
    8. Aynı sıkışık olmayan antikor nokta için yük ve bir zaman çözüldü serisi sonrası lizis alınan adımları 3.1.1 - 3.1.7 tüm görüntü kareleri için yakalanan tekrarlayın. 2.3.5. adımda kaydetti lizis kez kullanın. herhangi bir bağlama eğrileri düzeltmek için.
  2. Tek molekül (yığılması/analog rejimi) sayma
    1. Devam etmeden önce tek bir molekül ortalama yoğunluğunu hesaplamak için adımları 3.1.1 - 3.1.8 yineleyin.
    2. BKD_FLAT ve SM_MASK sayede sıfır piksel değerlerini tek molekülleri ile ilişkili bir görüntü üretmek için görüntüleri çarpın.
      1. Bu, "Süreci" menüsü altında gerçekleştirmek için "... görüntü hesap makinesi" seçin, "Multiply" işlemi ve gerekli görüntüleri belirtin ve seçin kutuları "Oluştur yeni pencere" ve "32-bit (float) sonuç."
    3. "Analiz" ve sonra "Ölçü"; seçerek tüm piksel yoğunluğu değerlerin toplamı Özet istatistikler seçimin sonuçları penceresinde sunulacak. Adım tek molekül başına ortalama yoğunluğu hesaplamak için 3.1.8 başı olarak sayılan tek molekül sayısı bölün.
    4. Herhangi bir kalabalık antikor spot için elde görüntüsü sonrası lizis yüklemek ve bir arka plan bulanık görüntü adım 3.1.2 ve 3.1.3 göre ile düzleştirin.
    5. Düzleştirilmiş resimdeki her piksele 1 tarafından çıkarma ("işlem > Matematik", "Çıkarmak..." seçeneğini seçin ve 1 değerini belirtin)
    6. Görüntü 4 köşe hiçbirinde 50 piksel × 50 piksel alanını seçin ve piksel yoğunluğu Standart sapma (σ) ölçmek. Adım 3.1.5 Ayrıntılar için bkz.
    7. 3σ için görüntü eşik ayarlayarak bir ikili görüntü maskesi oluşturma ve 4 piksel2herhangi bir nesne boyutu sıfır pixel yoğunluk değerleri ayarlayın. Bu, "Analiz" menüsü altında gerçekleştirmek için "analiz" seçen ve Döngüsellik ve boyutu belirtin.
    8. Düzleştirilmiş sıkışık antikor nokta görüntü ikili görüntü maskesi tarafından çarpın.
      1. Bu, "Süreci" menüsü altında gerçekleştirmek için "... görüntü hesap makinesi" seçin, "Multiply" işlemi ve gerekli görüntüleri belirtin ve seçin kutuları "Oluştur yeni pencere" ve "32-bit (float) sonuç."
    9. "Analiz" seçerek kalan piksel yoğunluklarda toplamı takip "Ölçü"; Özet istatistikler seçimin sonuçları penceresinde sunulacak.
    10. Piksel yoğunluklarda tek molekülleri sıkışık noktanın üzerine bağlı sayısını hesaplamak için Ortalama tek molekül yoğunluğu tarafından toplamı bölün.
  3. Kalibrasyon eğrisi için mutlak miktar
    1. Bölüm 1 ve 2 10 nL adresli damlacıkları algılama antikor ile bilinen konsantrasyon Rekombinant protein ile çivili %4 PBSA Web site çözüm oluşturmak için yineleyin.
    2. 10 konsantrasyon dizi yapmak2- 107 rekombinant proteinler tarafından bilinen konsantrasyon Rekombinant protein çözümü eklendi değişen damlacık başına. Bu proteinler ayarlı tek hücre veri basit yapmak için damlacık başına sayısı açısından iş için tavsiye edilir.
    3. Protein bereket damlacık başına ve uzantısı protein bereket tek hücre başına tarafından noktaya başına verilerini adımda 3.3.2 herhangi bir tek molekül kalibre sayar konsantrasyon serisi kullanmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P53 mutlak bazal protein kopya sayısı bir insan kolon kanseri hücre kültürünü, BE hücreleri tek hücre çözünürlük ile tespit edilmiştir. Biz nasıl p53 ifade büyüklükte birkaç emir üzerinde değişir ve hücre boyutu ve protein kopya sayısı içinde dinlenme BE hücre nüfus arasında bir zayıf pozitif korelasyon göstermek göstermek.

Sulu damlacıkları antikor spot yerlerde reçete ve yağ ile şapkalı adresli damlacık Microarrays oluşur. Burada, damlacıkları hassas p53 protein tahlil destekler. Coverslips ilgili bir microarrayer ve bir PIN kullanarak yakalama antikor noktalar ile dizilmiş. Anti-p53 yakalama antikor bir ticari ELISA test kiti alınır. Öyle ki yakalama noktalar yaklaşık 100 µm 6.2 ± 0.5 x 105 proteinler nokta başına maksimum yakalama kapasiteli çapındadır edildi yazdırma koşulları vardı. 32

Coverslip için bağlı bir izolatör kullanımı yüksek yoğunluklu petrol yakındaki antikor yakalama noktalarına yayılmasını sınırlayan bu yana oluşan damlacıkları sağlar. İzolatör her kuyuya damlacıkları buharlaşma (Şekil 1A) önlemek için yağ ile kaplıdır sulu bir çözüm dağıtımı tarafından meydana gelir. En az bir miktar yağ damlacığı kap için reçete; Ancak, bir miktar her İzolatör iyi tam olarak petrol yüzey görüntüleme için düz öyle ki hangi dolgular dağıtmak yararlıdır. İzolatörler ticari kaynaklı veya lazer kesim Akrilik levhalar tarafından yapılmış. Silikon izolatörler vardır bir 4 x 6 dizi kullanılabilir önceden kesilmiş wells (n = 24) 4 x 11 diziye değiştirilebilir ama (n = 44) bir biyopsi veya çoklu delik deri yumruk kullanarak. Şekil 1B adımında İzolatör kesme lazer 2.89 mm, 3.9 mm merkezden merkeze ayrılması ve 0,5 mm yüksekliğinde maksimum çapı 100 altıgen Wells her bir dizi gösterir. Damlacıkları depolanabilir ve uzun bir süre (3 aya kadar gözlenen) için kararlı kalır.

Damlacıkları iki şırınga pompa (Şekil 1A) bağlı konsantrik tüp başlığı (Şekil 1 c), çeviren bir ev inşa aparatı kullanarak el ile oluşturulur. Konsantrik tüp başlığı bir erimiş olan petrol faz dağıtır PEEK boru kısa uzunluğu ile beslenen sulu faz dağıtır silis kapiller, oluşur. Bir mikroskop kullanarak, meme bir antikor noktaya hizalanır ve pompalar ilk yağ (Şekil 1E, adımlar 1-4) hemen ardından sulu çözüm dağıtmak istiyorsunuz. ADM bütün damlacıklar oluşur sonra bir microinjector ve micromanipulator (malzemeleri tablo görmek) her damlacık ile tek bir hücre (Şekil 1 d) yüklemek için kullanılmaz. Micropipette bir hücre hücre bir rezervuar yakalamak istiyorsunuz, bir çip Wells reçete, bir damlacık de tercüme edilebilir ve hücre sulu damlacık (Şekil 1 d, adım 5-8) teslim etmek için petrol kap nüfuz.

Damlacıkları tüm noktalar lizis önce görüntüsü ve non-spesifik bağlama (Şekil 2A) noktalarına derecesini belirlemek için kullanılır. Tek hücreler tamamen (çekirdeği de dahil olmak üzere) lysed optik yöntemlerle. 31 optik lizis hücreleri bozmaya genişleyen bir lazer darbe kaynaklı kavitasyon kabarcığı kesme kuvveti dayanır. Yağ-su arabirimi darbe enerjileri sınırlama ve hücrelerin yağ/su arabirimi uzak yatırma bu işlemler tarafından rahatsız değil bu bakım yapılması gerekir. Hücreleri lysed sonra dizi tarafından otomatik bir mikroskop kullanarak TIRF mikroskobu görüntüsü; çerçeveler her 10 min satın aldı 30 min ve o zaman her 20 dk daha fazla 60 dk için. Öyle ki denge bağlama içinde 90 dk edinme ulaşıldığında antikor benzeşme, protein difüzyon ve damlacık birim, gibi koşullar vardır. Tipik tek hücre açılan Şekil 2Agösterilir.

Tek molekül sayar belirlemek için görüntü analizi süreci şematik Şekil 2Bresmedilir. Noktalar görüntülerini de öyle ki tek moleküller de ayrılmış ve kolayca ayırt veya sıkışık, hedef protein konsantrasyonu yüksek ve tek molekül görüntüleri nerede hedef protein konsantrasyonu olduğu yerde sigara yığılması, kabul edilir örtüşme ve artık tek tek ayırt vardır. TIRF uyarma profil düzensiz olduğu için tüm düz alan düzeltilmiş olması görüntüleri elde önemlidir. Gauss bulanıklığı ayrıntı ve gürültü kaldırmak ve TIRF uyarma profilin ortalama kasalı bir görüntü üretmek için düzeltme bir filtre görevi görür bir sigara kalabalık kare için uygulanır. Bu işlenmiş görüntü 'orijinal görüntüyü düzleştirmek için ' kullanılabilir. Nerede, hatta Equilibrium'da birkaç tek molekülleri, orada olmayan sıkışık görüntülerde bir çerçeve kendisi düzeltmek için işleme. Bu yaklaşım nerede tek molekülleri işgal yoğun spot sıkışık bir nokta için geçerli değildir ve düzleştirme için elde edilebilir için bir arka plan görüntüsü gerektirir. O zaman thresholded yoğunluklarda en az 3 piksel için arka plan standart sapma artı ortalama değerini kez düzleştirilmiş çerçevelerdir. Tek molekülleri sonra Döngüsellik Fiji parçacık çözümleme özelliklerini kullanarak 0.5 büyük ile 4-9 kümelenmiş piksel tespit ederek otomatik olarak algılanır. Test sonuçlarına göre tek bir molekül ortalama yoğunluğu hesaplanabilir. Bu antikor spot toplam yoğunluk tek bir molekül bilinen ortalama yoğunluğu tarafından bölünmesi ile kalabalık bir yerde tek molekülleri sayısını belirlemek için kullanılır. Fiji'nın komut dosyası Düzenleyicisi'ni kullanarak aşağıdaki adımları otomatik.

Toplama serisi damlacıkları rekombinant p53 proteini (Şekil 3A) bilinen konsantrasyonları ile denge, tek molekül sayısı belirlemek için yapılır. Öyle ki yakalama antikor noktalar toplam hedef protein, doğrusallık bölgesinde yaklaşık % 1 bir kısmını yakalamak koşullar (damlacık R2 başına 105-108 proteinler için = 0.99). Non-spesifik bağlamasında damlacıkları 187 ± 60 molekülleri seviyesidir. Tek hücre pulldowns sonuçlarını sonra mutlak protein kopya numarası hücre başına dağılımları ulaşmak için dönüştürülmüş olabilir. Şekil 3B ADM'ler kullanarak tek BE hücrelerde mutlak p53 protein ifade dağılımını gösterir. P53 protein ifade genetik olarak aynı veya çok benzer olarak kabul, BE hücrelerdeki Stokastik bir süreçtir. Dağıtım gama gibi - asimetrik ve uzun bir kuyruk ile tektepeli. Sonuç olarak, ortalama (1.82 × 106 proteinler) kalıcı protein bereket (bin 0 - 5.0 × 105 proteinler) abartma ve standart sapma (1.88 × 106 proteinler) tam olarak dağıtım özelliklerini yakalamak değil. Bu dağıtım protein ifade Aksi takdirde toplu ölçümleri ile ortalama zaman kaybolmuş olurdum hücre nüfus heterojen yakalamak için tek hücre ölçümleri önemini bir örnektir. Her hücre için ek parametreler ölçülen. Burada, hücre hacmi lizis damlacığı önce her hücre çap ölçüm ve hücre yaklaşık küresel olduğunu varsayarak tahmin edilmektedir. Şekil 3 c p53 mutlak protein kopya numarası karşılaştırılması tek BE hücrelerde hücre boyutu bir fonksiyonu olarak gösterilir. Bir daha yüksek toplam p53 kopya numarası olmasını büyük hücreler için bir eğilim vardır. İlginçtir, bir minimum p53 kopya hücre başına olmak var gibi görünüyor beri p53 ifade ve hücre boyutu arasındaki koordinasyon olduğunu dağılımından mümkündür; Ancak, hangi tarafından bu doğar mekanizmaları daha fazla araştırma gerektirir.

Figure 1
Şekil 1: adresli damlacık Mikroarray cihazları ve çip. (bir) damlacıkları elle konsantrik boru meme çevirmek için 3 eksenli manipülatör kullanarak kalmaması sağlanmaktadır. Sulu damlacık, petrol kapatma tarafından takip bir antikor Mikroarray belirli yerlerdeki reçete. (b) İzolatör substrat olarak adreslenebilir damlacıkları yüksek yoğunluklu petrol yayılmasını sınırlayarak sağlar. İzolatörler lazer kesim 0,5 mm Akrilik levhalar tarafından üretilen. Görselleştirme damlacıkları, mavi yardım etmek için gıda boya boyama cihaz kullanarak yatırılan bir). Ölçek 10 mm, iç metin ölçek bar bar 1 mm konsantrik tüp başlığı sağlar oluşturulmasına izin adresli damlacıkları. (c) Protokolü'nün adım olduğu gibi 1.2 toplandı. (d) bir microinjector ve micromanipulator Protokolü'nün adım olduğu gibi 1.3 hazırlanan Bireysel adresli damlacıkları içine hücreleri izole etmek için kullanılır. (e) oluşturma ve adresli damlacıkları yükleme sürecinde önemli adımlar gösterilir. Bir antikor nokta (1) nerede Kılcal boru ucu hizalanır (2) ve sulu (3) sonra petrol (4) bileşenleri kalmaması sağlanmaktadır bir kodlanmış çeviri stage kullanılarak bulunur. Tek hücreleri tekrar tekrar sulu damlacık (7) ve bir hücre (8) mevduat bir cam microcapillary (5-8) kullanarak yüklü. Ölçek 100 µm barlar. Kırmızı ok (5) ve (8) vurgulamaktadır izole tek hücre ve yüksek büyütmede (ölçek 10 µm bar) izole tek hücre iç metin (8) gösterir. Bu rakam bölümlerini başvuru12Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz, modifiye edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: görüntü analiz adımları. Denge (tEq) (p53 tahlil için 90 dk) ulaşılıncaya kadar dizideki her spot düzenli aralıklarla tarafından TIRF mikroskobu görüntüsü. Denge süre t antikorlar çift benzeşim hedeflenen protein için yanı sıra çözüm bağlıdır. a) örnek tek molekül TIRF mikroskobu resimleri arka plan olarak bir örnek tek hücre açılan (ölçek çubukları 20 mikron). İç metin resim kırmızı oklar (ölçek 5 mikron bar) tarafından vurgulanan bazı tek molekülleri ile arka plan görüntüsü büyütülmüş bir bölümünü gösterir. b) Protokolü'nün 3 adımda ayrıntılı görüntü analizi anahat. Kısaca, orada iki geniş rejimler nereye noktalar seyrek ve sıkışık olmayan sıkışık, tek moleküllerdir kabul edilebilir, nerede tek molekülleri yoğunluğu öyle ki önemli örtüşme ve artık olabilir tek başına olarak tanımlanabilir. Bir çok önemli görüntü analizi uyarma lazer üniform olmayan yoğunluk profilini etkisini kaldırmak için alan düzleştirme adımdır. Dijital sayma rejiminde tek moleküller doğrudan, onların yoğunluğu ve şekil parametreleri temel alınarak tanımlanır. Rejim sayma analog içinde denge ve dijital sayım Cao'dan bilinen tek bir molekül ortalama yoğunluğu tarafından bölücü toplam spot yoğunlukta ölçerek tek molekül sayısı hesaplanır. Adımları delikanlı verileri çözümlemek için ImageJ içinde otomatik. Görüntüler alt paneli dizisini hedef protein birikimi üzerinde antikor yakalama spot gösterir; Başlangıçta, noktalar olmayan hedef protein antikoru oracıkta birikir gibi tek molekülleri giderek olabilir, ancak (TRT1) kalabalık denge (teq) ulaşılana kadar (tn) kalabalık. Bir nokta olmayan sıkışık kalır veya kalabalık olur ki Not hedef protein analizi birimindeki bolluk bir dizi faktöre, özellikle de bağlıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: tek hücre veri. Mutlak miktar bir kalibrasyon eğrisi kullanarak elde edilir. (bir) tek molekül sayar bilinen Rekombinant protein konsantrasyonları kullanılarak yapılır. Bu bir kalibrasyon eğrisi ve tek molekül her yerinde analiz birimindeki hedef proteinlerin numarasına sayılan dönüştürmek için kullanılır ve bu nedenle tek hücre kopya sayısı. Yatay kırmızı kesikli çizgi moleküllerin 187 ± 60 non-spesifik bağlama düzeyini gösterir. Hata çubukları 3 deneysel ortalaması bir standart sapması çalışır vardır. Kesikli çizgi protein % 100 tespit temsil eder. (b) bir dağıtım tek hücre bazal p53 protein olması kanser hücrelerinin ifadede bir uzun kuyruklu gama gibi dağıtım p53 protein ifade bazı hücrelerde önemli ölçüde kalıcı değerinden yüksek nerede gösterilen gösterilir. p53 protein kopya bir fonksiyonu olarak hücre başına protein ifade hücre boyutu bir fonksiyonu olarak nasıl değişeceğini gösteren hücre birimin numarasını (c) dağılım arsa. Bu rakam bazı bölümleri 12 den değiştiren ve izni ile yayınlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adresli damlacık Microarrays kantitatif tek bir hücrede bulunan protein mutlak kopya sayısını belirlemek için hassas ve genişletilebilir bir yöntemdir.

Non-spesifik bağlama düzeyini sınırlama (NSB) bir sınır tespiti mümkün olduğunca düşük olarak ulaşmak için iletişim kuralına önemlidir. Protein ve diğer biyokimyasal türler özellikle sigara bağlamak için arabirimler damlacıkları içinde mevcut bir dizi — coverslip yüzey, antikor nokta ve yağ/su arabirimi. Proteinler arabirimi veya petrol kendisi bölümleme tarafından kayıp olabilir. Biz %4 BSA sulu damlacık mevcut NSB iletişim kuralında belirtilen antikorları kullanarak proteinlerin sınırlayıcı kapasitesine sahip olduğunu göstermiştir. Alternatif protein hedefleri ve onları algılamak için kullanılan antikor alternatif engelleme yaklaşımlar, böyle non-iyonik deterjanlar veya uyumlu yüzey gerekebilir. Fluorlu yağlar da kapatma yağ olarak hizmet veren içinde uygunluk için test edilebilir. Bu gibi durumlarda, kritik micelle konsantrasyon ve kapatma Petrol yoğunluğu gibi ek konuları yapılması gerekir.

AIDS uyum içinde diziliyor sonra nokta her konumda kalır yıkanmamış yazdırma arabellek. Başlangıçta damlacıkları yatırırken, çizik veya antikor nokta zarar vermek için konsantrik boru meme ucu tarafından özen göstermelidir. Yöntemi daha da geliştirirken, floresan bir boya içine ek olarak yakalama antikor immobilize olur antikor Yazdırma arabelleği katkılı. Bu yıkama ve adımları engelleme için damlacık diziliyor önce yapılması için olanak sağlayacak; Ancak, böyle bir adım mutlaka bu mürekkep püskürtmeli baskı yöntemleri gibi diziliyor damlacık otomatik yöntemlerle Eğer gerekli olmaz.

Bunun üzerine damlacıklar oluşan ticari kaynaklı coverslips yüzeyine hidrofilik bir polimer ve sulu damlacıkları ile kaplı onlara 10 hacmi ile üretilen nL var 751 ± çapı 42 mm. Ne kadar yatırılan damlacık yüzey ıslak için bir sınır yoktur veya minimum kalınlığı bu yana kapatma yağ ağırlığı nedeniyle yayılır üzerinden TIRF uyarma Lazer optik dağılım arttı. Dağılım arka plan ortalama düzeyini artırır ve sinyal tek molekülleri tespit zaman boğulabilirsin. Uyarma lazer ışık kısmen ya da tamamen bir alanı dışında sulu damlacık strike beri antikor nokta da damlacık kenar uzak yer almalıdır. Kritik açı durumu artık cam-petrol arabiriminin tersine cam-su arabirimi çarpıcı ışık karşılanacak.

Kantitatif protein bir noktaya bağlı tek molekül sayısı bolluk belirlemek için görüntü analizi ile tespit edilmelidir. Toplam belirlemek için tek molekül sayısı bir kalibrasyon eğrisi çözümden protein miktarı gereklidir ve kesinlikle nicel olmak tekniği sağlar.

Photobleaching en aza indirmek için noktalar sürekli görüntüsü değil ve TIRF uyarma Lazer kaynak güç simge durumuna küçültülür. Alexa Fluor Boyayıcılar gibi sunulan protokolü başarılı bir şekilde photostable fluorophores için kullanılır. Alternatif fluorophores kullanılabilir ama photobleaching değerlendirildi ve gerekirse görüntüleme Protokolü uyarlanmış. Çerçeve başına tek molekül sayısı bu kesinlikle denge, tek bir kare bağlama kinetik aranan ve görüntüleme değilseniz yeterli olacaktır gerekli olmamasına rağmen bağlama eğrisi yeniden oluşturmak için zamana karşı çizilen.

İki yüksek afinite antikorlar bir gereği olsa da, bu son derece hassas ve çok özel tahlil, tek hücre düzeyinde ölçümler için çok önemli olur. Bu protokol için kullanılan p53 antikorlar de tek hücrelerden ücretsiz p53 saptamada optimize edilmiştir. Hedef protein antikorlar seçimi ile belirlenir ve birkaç şekilde değiştirilebilir: 1, yakalama ve algılama antikorlar yerine alternatif hedefleri; bağlamak için 2, algılama antikor protein-protein etkileşimleri soruşturma için değiştirilebilir veya protein translasyonel modifikasyon yakalama antikor bağlı, örneğin yakalanan p53 fosforilasyon durumunu belirlemek; 3, çoğaltılmış deneyleri elde edilebilir birden çok yakalama antikor noktalar yakın yazdırarak — 3 × 3 nokta dizi 10nL damlacıkları içinde mümkün dür. Tabii ki, hedef protein antikoru ekranları sayıda herhangi bir değişiklik için denetimleri ve en iyi duruma getirmeleri üstlenilen gerekir.

Tek hücre lysing için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. 33 optik lizis hızla tek tek hücreleri parçalayıcı hücrelerin içeriği değiştirme ve proteinler ve kendi kompleksleri bütünlüğünü korumak için bir kimyasal madde içermeyen bir yaklaşımdır. Mineral yağ kullanarak kimyasal lizis deterjanlar kullanarak damlacıkları bütünlüğü için bir sorun teşkil etmektedir ve moleküller arasındaki etkileşimler engelleyebilir. 34 örneğin lazerler veya micropatterned elektrotlar güvenen değil ancak, kimyasal lizis uyumlu olduğu deneyleri için çekici bir yaklaşım çünkü. 35

Damlacıkları alternatif tek hücre yöntemleri ile karşılaştırılabilir performans göster. Önerilen p53 antikorları kullanarak damlacıkları şimdiki nesil nokta başına 187 ± 60 molekülleri NSB düzeyidir. Tek molekül sayar güçlü doğrusallık Sergi (R2 = 0.99) 105 –108 rekombinant p53 protein damlacık başına kapsayan bölgede. Bu protein düzeyi düşük hücrelerde algılanabilir iken, orada olduğunu Nefelometri 105 p53 protein sınırı göstermektedir; Bu noktalar 901 ± 83 tek molekül sayısı karşılık gelir. Bu ağırlıklı olarak hacmi damlacıkları ve Adsorpsiyon arayüzü ile sınırlıdır. P53 tahlil performansını gerçekleştirilen zaman içinde 10 nL birim sadece 1,1 ± %0.2 toplam hedef protein çözümden kapsanır böyle olduğunu; Bu 85 ± %9 0,2 için analiz ses düzeyini azaltmayı artar nL. 36 1nL aşağıda için damlacıkları ses düzeyini azaltmayı ve Adsorpsiyon azaltarak, işte p53 algılama için limit iyileştirilmesi için belirtilen antikorları kullanarak potansiyel < 50 proteinler hücre başına. Bu nedenle, adresli damlacıkları çok düşük bereket proteinler tek hücrelerden ölçmek için kullanılan potansiyeline sahip.

Kolayca işlenebilir petrol kapakla tanınan damlacıkları adreslenebilirliği hücre analiz birimi sırayla meydan verir. Bir micropipette kullanın istediğiniz bir hücre sayısı her damlacık bir fiş önemli ölçüde ses seviyesini artırmak değil 10-20 pl içine enjeksiyon sağlar. Çip gösterildiği Şekil 1B adımında 100 wells ile damlacıkları oluşturur ve bunları genellikle tek hücrelerle yüklemek için yükleme hücreleri 75-90 dk. alır da konsantrik meme micropipette yerine boru veya kullanarak kullanarak damlacık ele alarak elde edilebilir için bir ne zaman başlangıçta damlacıkları oluşturan hücreleri içeren çözüm. İkinci yararlı olacağını adım protokolündeki ama her iki durumda sayısını sınırlama getirilmeksizin, damlacık başına doluluk Poissonian dağıtım takip eder. Bu çip başına tek hücre veri oranı sınırlandırır; Ancak, damlacıkları ile sıfır veya daha fazla hücre denetimleri hizmet verecek. Adres damlacıkları için konsantrik meme kullanarak bir ek damlacık birim 10nL artışlarla artıracak kısıtlamadır. Bu yukarıda önerilen değişiklikler ile geliştirilebilir. Çip üzerinde Havacilik damlacıkları yüksek frekansta üretebilen ve otomatik olarak üretmek ve damlacıkları işlemek ve onları sırayla düzlemsel bir dizide mevduat ADM'ler ile birlikte olmak potansiyel damlacık. Bu kesinlikle üretiminde de tek molekül okuma damlacıkları etkinleştirme sırasında ADM'ler sınırlamalar üstesinden.

Her bireysel damlacık adres yeteneği bir olası kullanım alanına sahiptir. Sırayla tek hücreleri yüklemek için yetenek göstermiştir. Pipet diğer yöntemlerle analiz için tarafından çıkarılması ilişkisiz hücresel malzeme mesaj lizis ve yazı analizi de verir. Daha sonraki analiz örnekleri nicel gerçek zamanlı PCR veya kütle spektrometresi içerir.

Bir tek hücre proteini analiz için nicel bir yaklaşım isteyen laboratuarlar için geçerli performans sorunlarını yüksek teknik bariyer ve özel ekipman için ihtiyaç var. Minyatür, ADM'ler ile yüksek hassasiyet analizleri temiz oda imkanları mikrosıvısal çip üzerinde laboratuar cihazları imal etmek için gerek kalmadan elde. Deneyler çip tasarım tarafından sınırlı değildir ve kendi birim ve pozisyon yeni ana şablonlar imalatı için gerek kalmadan değişmiş olabilir. Kesinlikle, geliştirme tekniği basitleştirilmesi ve antikor ve damlacık microarrays hem görüntü için bir Floresan Mikroplaka Okuyucu yazdırmak için giriş için sadece bir microarrayer, tek hücre analizi için engel düşürülmesi için kapsam vardır.

Tek hücre analiz klinik uygulamaları bir dizi, özellikle kanser tedavisinde ortaya çıkıyor. Tümör heterojenite etkili kemoterapi için büyük bir sorun olduğunu. Tümör gelişiminde mutasyon sıklığı artan ile ortaya çıkan ve heterojenlik neden olur morfolojik, genetik ve proteomik değişkenlik. Tek hücre Analizi bir tümör içinde hücresel heterojenite gidermek ve daha iyi anlamak ve ilaç direnci ve rehber tedavisi tahmin yardımcı olmak için bir platform sağlamak yapabiliyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

ASR deneyleri, protokolleri tasarlanıp geliştirildi veri analiz. SC ve PS hücre boyutu deneyleri yürüttü. ASR ve OC el yazması yazdı. Yazarlar minnetle Prof. David R. Klug destek ekipman erişim sağlamak için kabul etmek istiyorum. Yazarlar Imperial College gelişmiş Hackspace imalat ve prototip oluşturma özellikleri erişim için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Life Technologies 10010015
DMEM high glucose Sigma D6429
Foetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0115
cell culture flasks Corning SIAL0639
Trypsin/EDTA Biochrom L2153
Name Company Catalog Number Comments
Microarray
Microcontact Arrayer DigiLab, UK OmniGrid Micro
Microcontact pin ArrayIt, USA 946MP2
Coverslips (Nexterion) Schott, Europe 1098523 Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibody Enzo ADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled Santa Cruz sc-126 stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate buffer Gibco 15557-044
Betaine Sigma 61962
Sodium dodecyl sulphate Sigma L3771
384 well plate (low volume) Sigma CLS4511
Nitrogen gas cylinder BOC Industrial grade, oxygen-free
Name Company Catalog Number Comments
Droplets
Micromanipulator Eppendorf Patchman NP2
Manual Microinjector Eppendorf CellTram Vario
Micropipette Origio, Denmark MBB-FP-L-0
Syringe pumps KD Scientific KDS-210
100 μL syringe Hamilton 81020 Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringe Hamilton 81327 Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolator Grace Bio-Labs JTR24R-A-0.5 6x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutter VersaLASE VLS2.30 CO2 Laser 3W for laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheet Weatherall-UK Clarex Precision Sheet 001 for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet 3M used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glue Loctite LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing IDEX FS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing IDEX 1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing Kinesis 008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing IDEX 1673
Bovine Serum Albumen (BSA) Fisher Scientific BP9700100
Mineral oil Sigma M5904
Ultra-pure water Millipore, Germany MilliQ
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stage Nikon, Japan Nikon Ti-E
EM-CCD Andor Technologies, Ireland IXON DU-897E
Laser excitation source Vortran, USA Stradus 488-50
Optical lysis laser source Continuum, USA Surelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRF Chroma, USA z488bp
Microscope filter cube for Optical Lysis Laser 2000, UK LPD01-532R-25
Name Company Catalog Number Comments
Software
Fiji Open Source Image analysis software
Matlab Mathworks version 7.14 or higher Image analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).

Tags

Kanser Araştırmaları sayı: 137 damlacık havacilik tek hücre proteini analiz heterojenlik havacilik damlacıkları mutlak miktar p53 hücre boyutu
Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chatzimichail, S., Supramaniam, P.,… More

Chatzimichail, S., Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays. J. Vis. Exp. (137), e56110, doi:10.3791/56110 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter