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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Published: July 6, 2018 doi: 10.3791/56110
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADM-Dateien), ein Tröpfchen Array-basierte Methode absolute Protein Fülle in einzelnen Zellen zu bestimmen. Wir zeigen die Fähigkeit der ADM-Dateien, die Heterogenität im Ausdruck der Tumorsuppressor Protein p53 in einem menschlichen Krebs-Zell-Linie zu charakterisieren.

Abstract

Oft zellulären Verhalten und zelluläre Reaktionen auf Bevölkerungsebene analysiert, wo die Antworten aus vielen Zellen als ein durchschnittliches Ergebnis Maskierung der reichen einzelne Zelle Verhalten innerhalb einer komplexen Population zusammengefasst sind. Einzelne Zelle Protein Erkennung und Quantifizierung Technologien haben in den letzten Jahren einen bemerkenswerten Einfluss gemacht. Hier beschreiben wir eine praktische und flexible Einzelzelle Analyse-Plattform basierend auf adressierbaren Tröpfchen Microarrays. Diese Studie beschreibt, wie die absolute heftnummern Zielproteine mit einzelligen Auflösung gemessen werden können. Der Tumorsuppressor p53 ist das am häufigsten mutierte Gen im menschlichen Krebs, mit mehr als 50 % der insgesamt Krebsfälle Ausstellen eines nicht gesunden p53 Expressionsmuster. Das Protokoll beschreibt die Schritte zum Erstellen von 10 nL Tröpfchen in dem einzigen menschlichen Krebszellen sind isoliert und die Kopienzahl des p53-Protein wird gemessen mit Einzelmolekül-Auflösung, die Variabilität der Ausdruck genau zu bestimmen. Die Methode kann auf jeden Zelltyp einschließlich Primärmaterial zu bestimmen, die absolute Kopienzahl jedes Ziel interessierender Proteine angewendet werden.

Introduction

Das Ziel dieser Methode ist die Variation in Hülle und Fülle an ein Zielprotein in einer Zellpopulation mit einzelligen Auflösung bestimmen. Einzelne Zelle Analyse liefert eine Reihe von Vorteilen, die nicht mit traditionellen Ensemble biochemischen Methoden zur Verfügung stehen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Erstens kann arbeiten auf der Ebene der einzelnen Zelle die reiche Heterogenität einer Zellpopulation, die sonst durch die Mittelwertbildung verloren gehen würde zu erfassen, die mit traditionellen Ensemble biochemischen Techniken auftritt. Die meisten Arbeitspferd biochemischen Methoden arbeiten mit der Masse erfordern, wie sie oft tun, Millionen von Zellen, um ein Ergebnis zu erzielen. Natürlich die Folgen ganze Zellpopulationen zu bewerten hängt eine Reihe von Faktoren, beispielsweise die Heterogenität in Protein-Expression, wo einige wichtigen Funktionen des Vertriebs von Protein Fülle ausgelassen werden können. Aus praktischer Sicht die Empfindlichkeit der einzelnen Zelle Techniken erforderlich machen sie in der Lage, arbeiten mit Mengen von biologischem Material, das für noch empfindlicheren Bulk-Techniken funktionieren nicht ausreicht. Ein wichtiges Beispiel hierfür ist das Studium der seltene Zelltypen wie zirkulierende Tumorzellen (CTC) wo auch für Patienten mit einer schlechten prognostischen Aussichten ziehen weniger als 10 CTCs in einem einzigen 7,5 mL Blut vorhanden sein könnte. 6 hier präsentieren wir Ihnen die Methodik erforderlich, um einzelne Zelle Protein Messungen mit einem reduzierten Volumen Antikörpern basierende Assays mit Öl-capped Tröpfchen auf ein Antikörper Microarray gedruckt.

Mikrofluidische Tröpfchen Plattformen sind hohen Durchsatz in der Lage, Tausende von Tröpfchen pro Sekunde und in der Lage zu isolieren, und sogar züchten, einzelner Zellen in einzelne Tröpfchen eine Vielzahl von biochemischen Tests durchführen zu erzeugen. Tröpfchen-basierte Techniken eignen sich gut für einzelne Zellanalyse,7,8,9 mit den letzten Beispiele einschließlich DropSeq10 und InDrop11, die stark durch die Kraft des unterstützt worden Verstärkung-Techniken. Die begrenzte Menge an Material und keine Methoden der Verstärkung für Proteine machen einzelne Zelle Proteomics besonders herausfordernd.

Tröpfchen können durch eine Reihe von Methoden analysiert werden und Fluoreszenz-Mikroskopie ist weit verbreitet. Einzelmolekül-Techniken wie Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) können fluoreszierende Moleküle mit unvergleichlicher Signal-Rausch-Verhältnis visualisiert werden. 12 aufgrund der exponentiellen Zerfall der evaneszenten Feldes sind nur Fluorophore in hohen Nähe an die Oberfläche (Reihenfolge der 100nm) begeistert machen TIRF eine gute Strategie bei der Aufdeckung von kleinen Mengen eines Zielmoleküls in einer komplexen Mischung. Die optische Stationspunkte Eigenfestigkeit des TIRF hilft auch waschen Schritte zu vermeiden und Grenzen bestimmen Dauer und Komplexität. Jedoch, TIRF erfordert planare Flächen und Beispiele für TIRF-Mikroskopie auf Tropfen im Fluss angewendet beinhalten die Bildung einer planaren Fläche davon zu Bild. 13 zu diesem Zweck design-Einzelzelle Proteomic Techniken oft mikrofluidischen Chips Oberfläche immobilisiert Capture-Agenten in einem Microarray-Format. 4 , 14

Die Tröpfchen, selbst können in Arrays auf planaren Flächen, sogenannte Tröpfchen Microarrays ausgebildet sein. 15 , 16 , 17 räumlich organisieren Tröpfchen in Arrays ermöglicht es ihnen, bequem indiziert, leicht im Laufe der Zeit überwacht, individuell angesprochen und bei Bedarf abgerufen. Droplet Microarrays erreichen eine hohe Dichte von Mikroreaktoren mit Tausenden von Elementen pro Chip sind freistehend oder von Microwell Strukturen unterstützt. 18 , 19 , 20 sie können gebildet werden durch sequentielle Abscheidung von liquid Handling-Roboter, Inkjet-Spotter, wenden Sie sich an Microarrayers21,22,23,24,25, 26 , oder sie können selbst-zusammenbauen auf Oberflächen wie Superhydrophillic Flecken gemustert auf einer superhydrophob Oberfläche. 27 , 28 , 29

Mit diesen Überlegungen im Auge wurden adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADMs) entwickelt, um die Vielseitigkeit, räumliche Adressierbarkeit und reduzierten Volumina von Tröpfchen Microarrays quantitativ mit der Empfindlichkeit der Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie zu kombinieren Protein-Fülle zu messen. 5 ADMs ermöglichen Einzelzelle Analyse bildet ein Tröpfchen Microarray mit einzelnen Zellen über einen Antikörper Microarray, die dann mit Öl, um Verdunstung zu verhindern begrenzt ist. Die Bände der Tröpfchen sind diskrete Probenverlust, zu verhindern, die sonst durch Ventile auf dem Chip im kontinuierlichen Fluss Mikrofluidik erreicht werden würde. 30 die absolute Menge an Zielprotein aus einer einzigen Zelle ist äußerst gering; Allerdings ermöglicht das geringere Volumen der Tröpfchen für relativ hohe lokale Konzentration, so dass sie erkannt werden, mit einem Sandwich-Antikörper-Assay - Antikörper immobilisiert ist, in eine eigenständige Region oder vor Ort, auf eine Oberfläche, die Protein fängt die wiederum bindet um ein eindringmittel gekennzeichneten detektionsantikörper in Tröpfchen Volumen vorhanden. Als markierungsfreie Ansatz (d.h. Protein Ziele müssen nicht direkt gekennzeichnet werden), ADM-Dateien sind generell für die Analyse von Zellen aus Primärquellen, wie z. B. verarbeitete Blut, gut brauchen Aspiraten und dissoziierten Tumor Biopsien sowie Zellen von Kultur und Ihre Lysaten.

Messung der Variation in Hülle und Fülle Protein in einer Zellpopulation ist wichtig bei der Bestimmung der Heterogenität, z. B. als Reaktion auf ein Medikament und hilft bei bietet Einblick in die Zellfunktionen und Wege, Bewertung von Subpopulationen und ihre Verhalten sowie seltene Ereignisse zu identifizieren, die sonst durch lose Methoden maskiert werden würde. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu produzieren und adressierbare Tröpfchen Microarrays verwenden, um die Fülle der Transkription Faktor p53 in menschlichen Krebszellen quantitativ zu bestimmen und kann verwendet werden, um die Rolle von p53 in Reaktion auf Chemotherapeutika zu untersuchen. Das Zielprotein wird bestimmt durch die Wahl der Erfassung und Erkennung Antikörper und kann geändert werden, um mehr oder andere Ziele enthalten. Anleitung zum Erstellen einer einfachen Apparatur unter Einbeziehung einer konzentrischen Düse aus allgemeinen Labor Verbrauchsmaterial manuell Array 10 nL Tröpfchen mit Öl bedeckt. Die vollen experimentelle Verfahren ist beschrieben, wobei jedes Tröpfchen dann geladen wird, mit einer einzelnen Zelle, die dann lysiert ist und der Ausdruck des Proteins bestimmt mit Einzelmolekül-Auflösung mit TIRF-Mikroskopie.

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Protocol

1. Vorbereitung

  1. Chips und print AntikörperMicroarrays zu machen
    1. Ein Deckglas funktionalisiert, um einen Antikörper Microarray unterstützen zuordnen Sie einen Klebstoff Silikon/Acryl-Isolator. Dies wird als Chip bezeichnet.
      Hinweis: Verschiedene Oberflächen Chemikalien wurden auf ihre Eignung mit adressierbaren Tröpfchen getestet. 5 Oberfläche Chemikalien können für alternative Erfassung Agenten optimiert werden müssen. ADM-Isolatoren sind im Handel erhältlich oder kann durch Laser schneiden Acryl hergestellt werden (CAD Datei für Isolator verwendet in diesem Werk als Download zur Verfügung gestellt wird, siehe der Zusätzliche Code-Datei).
    2. Schalten Sie die Microarrayer und stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 75 %.
      Hinweis: Relative Luftfeuchtigkeit reduziert Verdampfung des Drucklösung von Microarray-Pin und Intra - und inter - spot Variante reduziert.
    3. Reinigen Sie die Microarray-Pin pin Reinigungslösung für 5 min durch Ultraschall. Die Pin mit Reinstwasser mit einer Waschflasche abspülen und Trocknen mit Stickstoff.
      Hinweis: Aussetzen der Pin, Pin-Tipp nur Tauchen. Ein Objektträger mit einer entsprechend Gebohrte Löcher wird helfen, wenn ein Pin-Halter nicht ermittelt werden kann.
    4. Machen Sie 5 mL Druckerpuffer, bestehend aus 3 × Saline-Natriumcitrat (SSC) Puffer, 1,5 M Betain ergänzt mit 0,01 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Lagern Sie auf unbestimmte Zeit bei 4 ° C.
    5. Zur Vorbereitung einer Drucklösung Auftauen Anti-p53-Antikörper (p53/Mdm2 ELISA kit; siehe Tabelle Materialien) Aliquote bei-80 ° c gelagert Mischen sie 1:1 mit Druckerpuffer, eine Endkonzentration von 0,5 mg/mL. Laden Sie 5-10 µL Drucklösung in eine 384 Well-Platte mit einer Mikropipette und legen Sie in der Microarrayer.
    6. Laden Sie Chips in Schritt 1.1.1 in die Microarrayer montiert. Programmieren der Microarrayer Flecken an den Koordinaten definiert durch das Zentrum der jede Vertiefung des Isolators drucken.
      Hinweis: Microarrayers beschäftigen vielfältige, vorwiegend, proprietäre Software und so ist der Leser ermutigt, die einschlägige Literatur zu konsultieren. Die Microarray erforderlich für den ADM-Isolator in der zugehörigen CAD-Datei im Schritt 1.1.1 vorgestellten besteht aus rechteckigen Elementen; die entsprechenden Entfernungen stehen zur Verfügung.
    7. Die Chips in luftdichten Behältern aufbewahren und mit Folie umwickeln. Bei 4 ° C bis zu 6 Wochen speichern.
      Hinweis: Die Folie ist Foto-beschädigt werden kann. Lagerung bei 4 ° C begrenzt die Abbaurate von Biomolekülen und schädlichen Reaktionen, die handeln können, um Microarray-Aktivität zu reduzieren. Ein luftdichter Behälter ermöglicht Chips, vor Gebrauch auf Raumtemperatur ohne Kondensation auf der Chipoberfläche equilibrate. Kontakt Microarray Druck nutzt Oberflächenspannung und Haftung zwischen der Drucklösung und der Bedruckstoff, Flecken zu produzieren. Vordruck oder Löschpapier ist normalerweise erforderlich, um überschüssige Lösung aus der Microarray-Pin zu gleichmäßig große Flecken führen zu entfernen. Verwerfen Sie die aufopfernde-Preprint Deckglas nicht, da es verwendet werden kann, Batch-Qualität zu beurteilen.
  2. Bereiten Sie Spritzen, Schläuchen und konzentrischen Düse für adressierbare Tröpfchen Dosieren
    1. 100 µL (für die wässrige Tröpfchen) zu zerlegen und 1 mL (für die Deckelung Öl) Glas Hamilton Spritzen und spülen Sie die Teile mit destilliertem H2O.
    2. Ein 100 mm Transportlänge von 150 µm ID/360 µm OD verschmolzen Silikon Schlauch durch eine 40 mm Länge von 1,0 mm ID/1/16 "OD PFA Schläuche bis es um 2 mm herausragt. Diese bilden die konzentrische Düse.
    3. Eine dünne Schicht Cyanacrylat-Klebstoff zum Jahresende eine 10 µL PIPETTENSPITZE auftragen und stecken Sie in die 40 mm Stück von 1,0 mm ID/1/16 "OD PFA Schläuche. Falls erforderlich, neu positionieren Sie den Fused-Silica-Schlauch um eine 2 mm überstand an der Düse vor der Klebstoff zu erhalten.
    4. Stecken Sie das andere Ende des Fused-Silica Kapillaren in das Ende mit einer Länge von 200 mm von 0,014" ID/0,062" OD PTFE-Schläuche und verbinden dies mit einer 100 µL Hamilton-Spritze gefüllt mit 4 % bovine Serum Albumin (BSA) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (PBSA).
      Hinweis: Proteine und andere biochemische Arten können unspezifisch binden an Oberflächen und können verloren gehen oder denaturiert. BSA wird verwendet, um Oberflächen um unspezifische Bindung zu minimieren, indem Sie aufopferungsvoll an diesen Oberflächen binden'sperren'.
    5. Einfügen Sie eine Länge von 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP Schlauch 400 mm in einer PIPETTENSPITZE 200 µL, bis sie eine Dichtung bildet. Wenden Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat-Klebstoff auf einem anderen 200 µL PIPETTENSPITZE an und schieben Sie diese in der erste Tipp, den Schlauch zu fixieren. Schließen Sie das offene Ende des 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP Schläuche an eine 1 mL Hamilton mit Mineralöl Spritze.
    6. 200 µL Pipette Tipp Montage in 10 µL-PIPETTENSPITZE der konzentrischen Düse einsetzen. Legen Sie die Spritzen in getrennten Spritzenpumpen, wie sie benötigen, um unabhängig betrieben werden.
    7. Füllen Sie die 100 µL Spritze mit 4 % PBSA blockierende Lösung. Schließen Sie und spülen Sie "wässrige" Schläuche mit den blockierenden Lösung. Wiederholen Sie zweimal für eine Gesamtmenge von 3 spült.
    8. Füllen Sie die 100 µL Spritze mit 0,125 µg mL-1 detektionsantikörper (Anti-p53 Antikörper (-1) beschriftet mit Alexa 488) 4 % PBSA und Schlauch wieder befestigen. Blockierende Lösung im Schlauch zu ersetzen, durch Abgabe 25 µL Erkennung Antikörperlösung.
    9. Spülen Sie die "Öl" Schläuche mit Mineralöl, bis alle Schläuche und die Düse mit Öl füllt. Füllen Sie 1 mL Spritze mit Mineralöl und befestigen Sie Schlauch wieder. Schlauch und Düse Assembly, die eine XYZ-Manipulator zu sichern.
  3. Microinjector und Mikromanipulator vorbereiten
    Hinweis: Schritte unten ausdrücklich auf Komponenten des Microinjector und Mikromanipulator Apparat angegeben in der Tabelle der Materialien zu machen, aber sind generell für solche Geräte.
    1. Montieren Sie die Microinjector durch das Anbringen der Druckschläuche und dem Inhaber der Kapillare.
    2. Drehen Sie langsam das Kolben-Zifferblatt bis das Mineralöl die Zeile vollständig ausfüllt.
    3. Befestigen Sie die Kapillare Halterung in der Übersetzung Galgen.
    4. Befestigen Sie die Kapillare in den Kapillaren Halter mit Griff Kopf.
    5. Pipette eine Lösung von 4 % PBSA in einer der Brunnen des Isolators.
    6. Mit dem Mikromanipulator umrechnen und die Spitze der Kapillare in die Lösung eintauchen.
    7. Füllen Sie langsam die Kapillare mit 4 % PBSA und lassen für 10 min. zu blockieren.
    8. Werfen Sie die Microcapillary und Schwenken Sie die Auswerteelektronik, so dass die Montage des Chips klar ist.

(2) bilden adressierbare Tröpfchen und Last mit Einzelzellen

  1. Form adressierbare Tröpfchen
    1. Befestigen Sie den Chip auf den Mikroskoptisch.
      Hinweis: Das Mikroskop ist ein umgekehrtes Fluoreszenz automatisiertes Mikroskop in der Lage, einzelne Molekül TIRF ausgestattet mit einer eine codierte Kreuztisch und ein Elektron – Coupled Ladegerät Kamera (EM-CCD) multiplizieren.
    2. Nehmen Sie die Mikroskop Bühne Koordinaten von jedem Fleck in das Array mithilfe der automatisierten Mikroskop-Steuerungs-Software auf.
    3. Legen Sie die XYZ-Manipulator für Mikroskoptisch. Legen Sie die Düse in einem Winkel von 50-60°. Sicherstellen Sie, dass die Düse ausreichende Länge und Abstand um den Chip zu erreichen. Set "wässriger" und "Öl" Spritze Pumpen um 10 verzichten nL 100 µL/min und 5 µL bei 100 µL/min, beziehungsweise.
      Hinweis: Während der Zubereitung kann die wässrige Lösung an der Spitze der Düse trocknen.
    4. Wässrigen Lösung zu verzichten, bis eine Perle der Flüssigkeit an der Spitze der Düse sichtbar ist. DAB mit einem staubfrei abwischen, um es zu entfernen.
      Hinweis: Abhängig von der Anzahl der Bedingungen untersucht behalten Sie eine Reihe von Brunnen, dienen als Reservoir für Zellen. Für eine einzelne Zelle/Linientyp reicht ein einziges Reservoir.
    5. Legen Sie mithilfe der Steuerungssoftware automatisiertes Mikroskop Mikroskop Bühne Koordinaten auf ein Antikörper-Ort in das Array und Fokus auf dem Deckglas Oberfläche.
    6. Aufpassen, nicht zu stören der Stelle mit der XYZ-Manipulator, richten Sie die Glas Kapillare Spitze der konzentrischen Düse auf die Seite der Antikörper vor Ort und verzichten 10 nL der wässrigen Lösung. Regungslos die Stufen verzichten Sie 5 µL des Öls, die wässrige Lösung zu begrenzen. Langsam heben Sie die Düse des tropfenabscheiders klar und bewegen Sie gut zum nächsten.
    7. Wiederholen Sie Schritt 2.1.6 für alle Antikörper-Spots im Array.
    8. Nach 30 min Bild alle Spots in das Array mit der Steuerungssoftware automatisiertes Mikroskop um zu bestimmen, den Hintergrund der einzelnen Moleküle, die an jeder Stelle vor dem Laden Zellen Antikörper gebunden.
  2. Adressierbare Tröpfchen mit Zellen zu laden
    1. Entfernen Sie die Zellkulturflaschen aus dem Inkubator und lösen Sie Zellen mittels Trypsin/EDTA-Lösung zu.
      Hinweis: In dieser Studie BE menschlichen Dickdarm-Karzinom Zelllinie diente und kultiviert mit Dulbeccos geändert Eagles Medium (DMEM) mit 10 % (V/V) fötalem Rinderserum (FBS) in einem Inkubator CO2 ergänzt.
    2. Bei Bedarf eindringmittel Beflecken Sie Zellen.
      1. Aufschwemmen Zellen in einer Lösung von 0,125 µg/mL detektionsantikörper (Anti-p53 Antikörper (-1) beschriftet mit Alexa 488) in 10 % FBS in L-15 Medien. Um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewährleisten, Filtern Sie die Zelle-Lösung durch ein 40 µm Tonhöhe Zelle Sieb
    3. Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und verdünnen oder konzentrieren sich die Zelle-Lösung zu einer Konzentration von 25-400 × 103 Zellen/mL. Dadurch wird sichergestellt, dass Zellen Sediment mit ausreichend Abstand zu den Microcapillary bequem zu manipulieren.
    4. Laden Sie einzelne Zellen in adressierbare Tröpfchen aus der Zelle Reservoir mit dem Mikromanipulator und Microcapillary.
      Hinweis: Nicht-anhaftende Zellen können in großen Mengen in die Mikropipette geladen werden und eins nach dem anderen in adressierbare Tröpfchen verzichtet. Trotz Sperrung Oberflächenbehandlung werden adhärenten Zelllinien tendenziell unspezifisch an die Glaswand Microcapillary inneren halten und verloren gehen.
    5. Verwenden ein 10 × Ziel zu beobachten, die Microinjector verwenden, um eine einzelne Zelle in der Microcapillary aus der Zelle Reservoir Aspirieren.
    6. Speichern Sie Mikromanipulator Bühne Koordinaten zu, wenn frühzeitig elektronischer Manipulator oder manuell beachten Sie die Z-Position.
    7. Zurücknehmen Sie die Mikropipette durch die Übersetzung es nach oben, um die 1 mm Höhe des Chips deutlich. Führen Sie dies manuell mit dem Joystick oder automatisch mithilfe der Funktion "Auswerfen" frühzeitig elektronischer Manipulator.
    8. Setzen Sie die Bühne, koordiniert, dass eine adressierbare Tropfens der mit Mikroskop-Steuerungs-Software automatisiert. "Injizieren Sie" die Mikropipette durch Rückgabe an die gespeicherte (oder bekannte) Z-Position. Dies manuell durchführen, mit einem Joystick oder automatisch wenn frühzeitig elektronischer Manipulator zu verwenden.
      Hinweis: Wird die Microcapillary durchbohren die Deckelung Öl und den wässrigen Teil des adressierbaren tropfenabscheiders entfernt sein.
    9. Die Zelle in der adressierbare Tropfen mit den Microinjector zu verzichten. Das Volumen eines 10 nL adressierbare Tropfens erhöht sich um weniger als 1 %.
    10. Wiederholen Sie die 2.2.5-2.2.9 für die verbleibenden adressierbaren Tröpfchen verlassen einige frei für die experimentelle Kontrolle wo adressierbare Tröpfchen eine Zelle nicht enthalten.
      Hinweis: Eine einfachere Alternative zu dem Laden von Einzelzellen in adressierbare Tröpfchen mit einem Microcapillary und einem Mikromanipulator ist die Lösung im Schritt 1.2.8 mit einer Lösung aus detektionsantikörper in 4 % PBSA enthaltenden Zellen in einer Konzentration in der Größenordnung von 10 zu ersetzen 5 Zellen/mL, entspricht 1 Zelle/10 nL. Einzelne Zelle Belegung werden Poisson und die Zellkonzentration müssen optimiert werden.
  3. Lyse der Zellen und Bild array
    1. Bildzellen in Tröpfchen mit Brightfield Mikroskopie, einschließlich Fluoreszenz-Bildgebung.
      Hinweis: Imaging dauert ca. 3 min, ~ 100 Tröpfchen mit einem automatisierten Mikroskop abzubilden. Führen Sie Bildgebung mit 60 NA = 1,49 Ölimmersion Ziel. Ohne Filter sind erforderlich für Hellfeld imaging, während standard-Filter-Sets für die Fluoreszenz-Bildgebung verwendet werden.
    2. Bild alle Spots in das Array mit Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie.
      Hinweis: Einstellungen werden verwendet, wie in Schritt 2.3.1 mit einem spezialisierten TIRF filtern. Diese Bilder werden anschließend in Abschnitt 3 zu bestimmen, den Hintergrund der Einzelmoleküle verpflichtet jeden Antikörper Fleck vor der Lyse ausgewertet. Einzelmolekül-Bildgebung mit Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) dauert ca. 5 min zum Bild ~ 100 Plätze.
    3. Konzentrieren Sie sich auf eine Zelle in eine adressierbare Tröpfchen. Erreichen Sie komplette optische Lyse durch die Konzentration einer einzigen 6 ns laser-Puls (Wellenlänge 1064 nm, Puls Energien 14.1 ± 0,3 µJ pro Puls) in der Nähe von der Position der Zelle.
      Hinweis: Der Laserpuls richtet eine expandierende Kavitation Blase das Scheren die Zelle und zellulären Bestandteile in das Droplet Volumen befreit. 4 , 31 die mechanischen Prozesse durch Laser-induzierte Lyse nicht stören die Öl-Wasser-Grenzfläche bei niedrigen Pulsenergien. Optische Lyse dauert in der Regel ca. 20-30 min, 100 Zellen lysiert. Wie im Abschnitt Diskussion erläutert, gibt es eine Reihe von alternativen Methoden, um einzelne Zellen lysiert, wenn optische Lyse Setup nicht möglich ist.
    4. Wiederholen Sie für alle Handy-haltigen adressierbare Tröpfchen verlassen 5 Gratis für die experimentelle Kontrolle wo adressierbare Tröpfchen eine UN-lysierten Zelle enthalten.
    5. Notieren Sie die Zeit, bei der jede Zelle lysiert wird.
      Hinweis: Diesen Zeiten werden zur individuellen Bindung Kurven für jeden Fleck im Schritt 3.1.9 zu korrigieren. Oft genügt es die Zeiten fest, wann die ersten und letzten Zellen lysiert werden und schätzen den Rest vorausgesetzt, eine angemessen konsequente Zeit zwischen Ereignissen Lyse.
    6. Einzelmolekül-Bilder mit TIRF-Mikroskopie aller Spots alle 10 Minuten für die ersten 30 min dann alle 20 min für weitere 60 min zu erwerben. Wenn nur in der Höhe von Protein gebunden im Gleichgewicht interessiert, Bild alle Spots nach Inkubation des Chips für 90 min bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Die Zeit, um Gleichgewicht zu erreichen hängt von der Tröpfchen-Volumen und Affinitäten der Antikörper in der Probe verwendet. TIRF-Mikroskopie erfolgt mit Hilfe einer Laserquelle Erregung bei = 488 nm und 1,5 mW Leistung gemessen an der hinteren Blende über eine optische Leistungsmesser. Einzelmolekül-Bilder sind von der Übernahme an der EM-CCD-Kamera in 900 ms Erfassungszeit, 16-Bit Digitalisierung mit 1 MHz Anzeige Rate Einstellung erworben und ein EM Verstärkungsfaktor von 10. Der Isolator kann wiederverwendet werden, durch das Deckglas vorsichtig entfernen.

(3) Datenanalyse

  1. Einzelmolekül zählen (nicht-verstopft/digitale Regelung)
    1. Mit Fidschi (oder Matlab), für jede Stelle nicht überlastet Antikörper, laden Sie das Bild vor Lyse (Hintergrund, BKD) erworben.
      Hinweis: Die Vorgänge in den folgenden Schritten werden unkompliziert mit Fidschi Bildanalyse-Software durchgeführt. Eine Bedienungsanleitung finden Sie auf den folgenden Link https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html.
    2. Wählen Sie in Fidschi BKD Bild aus. Wählen Sie im Menü "Bild" "Duplizieren", doppelte BKD. Wählen Sie das doppelte Bild und wählen Sie unter "Prozess > Filter", "Gaußscher Weichzeichner" und geben Sie einen Radius von 50 Pixel.
    3. Glätten Sie das BKD-Bild, so dass es eine wirksame gleichmäßige Intensitätsverteilung der Erregung Lichtquelle durch die Aufteilung der BKD Bild durch das unscharfe Bild der BKD, Herstellung von BKD_FLAT.
      1. Unter "Prozess" wählen Sie "bildrechner...", Angabe der Operation "Kluft", die Bilder benötigt, und Auswahl der Felder "Create new Window" und "32-Bit (Float) Ergebnis."
    4. Jedes Pixel im Bild 1 subtrahieren ("Prozess > Mathematik", wählen Sie "Subtrahieren..." und geben Sie einen Wert von 1). Die durchschnittliche Pixel Intensität sollte 0 sein.
      Hinweis: Feld Abflachung und abgeflachten Hintergrundbilder können leicht überprüft werden, da die Summe aller Pixel 0 sein sollte und alle verbleibenden Versatz mehr unkompliziert kompensiert werden kann.
    5. Wählen Sie einen 50 Pixel × 50 Pixel Bereich in jeder der 4 Ecken des Bildes BKD_FLAT. Messen Sie die Pixel Intensität Standardabweichung (σ) durch Auswahl von "Analyze" und "Messen".
      Hinweis: Zusammenfassenden Statistiken der Auswahl werden in einem Ergebnisfenster angezeigt. Vor-Ort -Hintergrund bestimmt wo es unwahrscheinlich, dass eine hohe Dichte an einzelne Moleküle. Der zu messenden Fläche kann manuell ausgewählt werden, mit Standard-Menü-Auswahl-Werkzeuge oder durch Ausführen des Makros Code "MakeRectangle (X, y, Breite, Höhe)"; Dadurch entsteht eine rechteckige Auswahl, wo die x und y Argumente sind die Koordinaten der oberen linken Ecke (in Pixel).
    6. Legen Sie die Bild-Schwellenwert 3σ und erstellen Sie ein binäres Bild SM_MASK.
      1. Wählen Sie unter "Bild > anpassen" "Schwellenwert" und den unteren Schwellenwert auf 3σ festgelegt.
        Hinweis: Pixel, dessen Wert sind unterhalb der Schwelle, werden auf NULL gesetzt und Pixel, die Überschreitung des Schwellenwerts werden auf 1 gesetzt. Der Schwellenwert bestimmt das Vertrauen mit dem thresholded Pixel zu einem einzigen Molekül gehören.
    7. In das segmentierte Bild SM_MASK, Set Pixelwerte Intensität auf NULL von Objekten, die nicht über eine Größe von 4-9 Pixel2 und eine Zirkularität von 0,5 - 1 durch die Auswahl "Analysieren" gefolgt von "Partikel analysieren" und unter Angabe der Größe und Zirkularität.
      Hinweis: Die Pixelgröße müssen optimiert werden, für andere Fluorophore und Mikroskop-Set Ups. Aufgrund der Art der Kamera Lärm können einzelne Pixel oberhalb dieser Schwelle und nicht weggeworfen werden, obwohl Sie nicht einzelne Moleküle. Die Pixel-Größe-Kriterium wird solche Pixel korrekt entsorgen. Einzelne Moleküle sind in der Regel kreisförmig. Kreisförmigkeit der Wert 1 zeigt einen perfekten Kreis, während ein Wert 0 nähert sich eine zunehmend längliche Form anzeigt. Die restlichen Objekte sind einzelne Moleküle und können gezählt werden. Eine Maske kann festgelegt werden, um den Bereich der Ort, um vor Ort zu diskriminieren abzugrenzen und vor-Ort zählt pro Frame. Das ist einfacher für Frames zu späteren Zeitpunkten erworben wird ein ausreichendes Signal vor Ort, die dann auf früheren Bildern angewendet werden kann.
    8. Den gleichen Platz nicht überlastet Antikörper laden Sie und wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 - 3.1.7 für alle Bildrahmen gefangen wie eine Zeitaufgelöste Serie Post Lyse erworben. Verwenden Sie die Lyse-Zeiten im Schritt 2.3.5 vermerkt. Bindung-Kurven zu korrigieren.
  2. Einzelmolekül zählen (verstopft/Analog Regime)
    1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 - 3.1.8, um die durchschnittliche Intensität eines einzelnen Moleküls, bevor Sie fortfahren, zu berechnen.
    2. Multiplizieren Sie die Bilder BKD_FLAT und SM_MASK, um ein Bild zu erzeugen, wobei null Pixelwerte Einzelmoleküle zugeordnet sind.
      1. Führen Sie hierzu im Menü "Vorgang", wählen "bildrechner...", geben die Operation "Multiplizieren" und die Bilder erforderlich und wählen die Felder "Create new Window" und "32-Bit (Float) Ergebnis."
    3. Summe alle Pixelwerte Intensität durch die Auswahl "Analyze" und dann "Maßnahme"; die zusammenfassenden Statistiken der Auswahl werden in einem Ergebnisfenster vorgelegt werden. Dividieren Sie durch die Anzahl der gezählten einzelne Moleküle wie pro Schritt 3.1.8, berechnen Sie die durchschnittliche Intensität pro Molekül.
    4. Für alle überlasteten Antikörper vor Ort laden die Bild erworben nach Lyse und glätten mit einem unscharfen Hintergrundbild gemäß Schritte 3.1.2 und 3.1.3.
    5. Jedes Pixel in das flache Bild 1 subtrahieren ("Prozess > Mathematik", wählen Sie "Subtrahieren..." und geben Sie einen Wert von 1)
    6. Wählen Sie einen 50 Pixel × 50 Pixel Bereich in jeder der 4 Ecken des Bildes und Messen Sie die Pixel Intensität Standardabweichung (σ) zu. Siehe Punkt 3.1.5 für Details.
    7. Binäres Bildmaske erstellen, indem Sie die Bild-Schwelle auf 3σ und Intensität Pixelwerte auf NULL von Objekten mit einer Größe weniger als 4 Pixel2gesetzt. Um dies, unter dem Menüpunkt "Analyze" durchzuführen, wählen Sie "Analysieren Partikel" und geben Sie die Größe und Zirkularität.
    8. Multiplizieren Sie das abgeflachte überlasteten Antikörper vor Ort Bild mit der binären Bildmaske.
      1. Führen Sie hierzu im Menü "Vorgang", wählen "bildrechner...", geben die Operation "Multiplizieren" und die Bilder erforderlich und wählen die Felder "Create new Window" und "32-Bit (Float) Ergebnis."
    9. Summe der verbleibenden Pixelintensität durch Auswahl von "Analysieren" gefolgt von "Maßnahme"; die zusammenfassenden Statistiken der Auswahl werden in einem Ergebnisfenster vorgelegt werden.
    10. Teilen Sie die Summe der Pixelintensität durch die durchschnittliche Einzelmolekül-Intensität, die Anzahl der einzelnen Moleküle gebunden an die verstopfte Stelle berechnen.
  3. Eichkurve für absolute Quantifizierung
    1. Wiederholen Sie die Abschnitte 1 und 2, 10 nL adressierbare Tröpfchen mit den detektionsantikörper in 4 % PBSA-Lösung versetzt mit einem bekannter Konzentration rekombinante Protein zu bilden.
    2. Führen Sie eine Konzentrationsreihe von 102- 107 rekombinante Proteine pro Tröpfchen durch Variation der bekannten Konzentration des rekombinanten Proteins der Projektmappe hinzugefügt. Es empfiehlt sich, bezogen auf die Zahl der Proteine pro Tröpfchen zur Kalibrierung Einzelzelle Daten unkompliziert arbeiten.
    3. Verwenden Sie die Daten im Schritt 3.3.2 jedes einzelnes Molekül kalibrieren zählt Konzentrationsreihe pro Spot Protein Fülle pro Tröpfchen und durch Erweiterung Protein Fülle pro Einzelzelle.

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Representative Results

Die absoluten basalen Protein Kopienzahl des p53 wurde mit einer Einzelzelle Auflösung in eine menschlichen Dickdarm-Krebs-Zell-Linie, BE-Zellen bestimmt. Wir zeigen, wie p53 Ausdruck über mehrere Größenordnungen variieren kann und zeigen eine schwache positive Korrelation zwischen Größe und Protein Kopie Zellzahl innerhalb der ruhenden BE-Zell-Population.

Adressierbare Tröpfchen Microarrays werden gebildet, wenn wässrige Tröpfchen an Antikörper vor Ort Standorten verzichtet und mit Öl bedeckt. Hier unterstützen die Tröpfchen einen sensiblen p53 Protein Assay. Deckgläsern sind mit Capture Antikörper Flecken mit einem Kontakt Microarrayer und eine Pin angeordnet. Der Anti-p53-Capture-Antikörper stammt von einem kommerziellen ELISA-Test-Kit. Die Druckbedingungen waren so, dass Capture Flecken etwa 100 µm im Durchmesser mit einer maximalen Aufnahme-Kapazität von 6,2 ± 0,5 x 105 Proteine pro Spot waren. 32

Die Verwendung eines Isolators, gebunden an das Deckglas ermöglicht eine höhere Dichte von Tröpfchen gebildet werden, da es die Ausbreitung des Öls zu erfassen-Spots in der Nähe Antikörper begrenzt. In jede Vertiefung des Isolators sind Tröpfchen gebildet, durch den Verzicht auf einer wässrigen Lösung, die dann mit Öl gegen Verdunstung (Abbildung 1A) begrenzt ist. Eine minimale Menge an Öl kann verzichtet werden, um das Droplet Kappe; jedoch ist es sinnvoll, einem Betrag zu verzichten, füllt jeden Isolator nun genau so, dass die Öl-Oberfläche flach für die Bildgebung ist. Isolatoren sind entweder im Handel bezogen oder durch Laser schneiden Acrylplatten. Silikon-Isolatoren sind verfügbar vorgeschnittenen Brunnen in einem 4 x 6-Array (n = 24) aber in ein 4 x 11-Array geändert werden können (n = 44) mit Hilfe einen Biopsie oder Multi-Loch Leder Punch. Die lasergeschnittenen Isolator in Bild 1 b zeigt ein Array von 100 sechseckige Brunnen mit einem maximalen Durchmesser von 2,89 mm, eine Mitte-Mitte-Trennung von 3,9 mm und einer Höhe von 0,5 mm. Die Tropfen können gespeichert werden und für längere Zeit (bis zu 3 Monaten zu beobachten) stabil bleiben.

Tröpfchen entstehen manuell mit einer selbstgebauten Apparatur, übersetzt eine konzentrische Schläuche Düse (Abbildung 1), die mit zwei Spritzenpumpen (Abbildung 1A) verbunden ist. Die konzentrischen Rohren Düse besteht aus einer Fused-Silica Kapillaren, die verzichtet die wässrige Phase, gespeist durch ein kurzes Stück PEEK Rohre, die die Ölphase verzichtet. Unter Verwendung eines Mikroskops, die Düse zu einem Antikörper Ort ausgerichtet ist und die Pumpen würde zuerst die wässrige Lösung, sofort gefolgt von Öl (Abb. 1E, Schritte 1 bis 4) verzichten. Sobald alle Tröpfchen in die ADM gebildet werden, sind ein Microinjector und Mikromanipulator (siehe Tabelle Material) verwendet, um jedes Tröpfchen mit einer einzelnen Zelle (Abbildung 1) zu laden. Die Mikropipette eine Zelle aus einem Reservoir von Zellen erfassen würde, verzichtet in einer der Brunnen auf dem Chip, übersetzt werden, um ein Tropfen gut und dann durchdringen den Öldeckel um die Zelle in das wässrige Tröpfchen (Abbildung 1, Schritte 5-8) zu liefern.

Alle Punkte innerhalb der Tröpfchen werden vor der Lyse abgebildet und werden verwendet, um den Grad der unspezifischen Bindung zu den Spots (Abbildung 2A) bestimmen. Einzelzellen sind vollständig lysiert (einschließlich Zellkern) mit optischen Methoden. 31 optische Lyse stützt sich auf die Scherkraft eine expandierende Laser Puls-induzierten Kavitation Blase, die Zellen zu stören. Betreuung erfolgen, dass die Öl-Wasser-Grenzfläche durch diese Prozesse nicht gestört werden, durch eine Begrenzung der Pulsenergien und Hinterlegung Zellen Weg von der Öl/Wasser-Grenzfläche. Sobald Zellen lysiert werden, wird das Array von TIRF-Mikroskopie mit einem automatisierten Mikroskop abgebildet; Bilder werden alle 10 Minuten erworben für 30 min und dann alle 20 min für weitere 60 min. Die Bedingungen, wie Antikörper-Affinität, Protein Diffusion und Tröpfchen Volumen, sind verbindliche Gleichgewicht innerhalb der 90 min Übernahme erreicht ist. Abbildung 2Azeigt eine typische Einzelzelle Pulldown.

Das Verfahren der Bildanalyse zu bestimmen, dass die einzelnen Moleküls zählt ist schematisch in Abbildung 2 bdargestellt. Bilder der Orte gelten entweder als nicht überlastet, wo Ziel Proteinkonzentration ist so, dass einzelne Moleküle sind gut getrennt und leicht zu unterscheiden, oder überlastet, wo Zielkonzentration Protein ist höher und einzelne Molekül Bilder Überschneidungen und sind nicht mehr individuell unterscheidbar. Da die TIRF Anregung Profil uneben ist, ist es wichtig, dass alle Bilder erworben Wohnung-Feld korrigiert werden. Eine Gaußsche Unschärfe wird zu einem Frame nicht überlastet angewendet, wirkt wie ein Glättungsfilter Details und Rauschen entfernen und erzeugen Sie ein Bild mit dem durchschnittlichen Profil des Profils TIRF Erregung. Das bearbeitete Bild kann verwendet werden, um das Originalbild "flatten". Für nicht überlastet Bilder, wo auch im Gleichgewicht, gibt es nur wenige einzelne Moleküle, kann ein Rahmen verarbeitet werden, um sich selbst zu korrigieren. Dieser Ansatz gilt nicht für einen überlasteten Fleck, wo einzelne Moleküle dicht die Stelle besetzen und erfordert ein Hintergrundbild für Abflachung erworben werden. Abgeflachte Rahmen sind dann thresholded für Pixel mit Intensitäten mindestens 3 Mal die Hintergrund-Standardabweichung sowie der Mittelwert. Einzelne Moleküle werden dann automatisch erkannt, durch die Identifizierung von 4-9 gruppierten Pixel mit Zirkularität größer als 0,5 die Partikelanalyse Funktionen der Fidschi-Inseln. Aus den Ergebnissen kann die durchschnittliche Intensität eines einzelnen Moleküls berechnet werden. Hiermit wird die Anzahl der Einzelmoleküle auf einen verstopften Stelle bestimmen, indem man die Antikörper erkennen Gesamtintensität durch die bekannten durchschnittliche Intensität eines einzelnen Moleküls. Diese Schritte können mit Fidschis Skripteditor automatisiert werden.

Eine Konzentrationsreihe wird durchgeführt, um festzustellen, die Anzahl der einzelnen Moleküls im Gleichgewicht in den Tröpfchen mit bekannten Konzentrationen von rekombinantem p53 Protein (Abb. 3A). Die Bedingungen sind, so dass die Erfassung Antikörper stellen einen Bruchteil des gesamten Zielproteins, ca. 1 % in der Region der Linearität zu erfassen (für 105-108 Proteine pro Tropfen R2 = 0,99). Das Niveau der unspezifischen Bindung in den Tröpfchen ist 187 ± 60 Moleküle. Die Ergebnisse der einzelnen Zelle Pulldowns können dann umgewandelt werden, um Verteilungen der absolute Protein Kopienzahl pro Zelle zu erreichen. Abbildung 3 b zeigt die Verteilung der absolute p53-Protein-Expression in BE Einzelzellen mit ADM-Dateien. P53-Protein-Expression in den BE-Zellen, die genetisch identisch oder sehr ähnlich zu ausgegangen werden kann, ist ein stochastischer Prozess. Die Verteilung ist Gamma-ähnliche - asymmetrisch und unimodalen mit einem langen Schweif. Infolgedessen der Mittelwert (1,82 × 106 Proteine) kann überschätzen die modale Protein Fülle (bin 0 - 5,0 × 105 Proteine) und die Standardabweichung (1,88 × 106 Proteine) nicht vollständig erfassen die Funktionen der Verteilung. Diese Verteilung ist ein Beispiel für die Bedeutung der einzelnen Zelle Messungen, die Heterogenität der Proteinexpression in der Zellpopulation, die andernfalls verloren wären, wenn mit loser Schüttung Messungen durchschnittlich zu erfassen. Zusätzliche Parameter für jede Zelle können gemessen werden. Hier dürfte das Zellvolumen durch Messung jeder Zelle Durchmesser vor der Lyse in den Tropfen und vorausgesetzt, dass die Zelle etwa kugelförmig ist. Abbildung 3 zeigt einen Vergleich der p53 absolute Protein Kopienzahl in Einzelzellen BE als Funktion der Zellengröße. Es gibt eine Tendenz zu größeren Zellen eine höhere Summe p53 Kopienzahl haben. Interessanterweise ist es möglich von der Verteilung gibt es Koordination zwischen p53 Ausdruck und Zellengröße, da scheint es eine minimale p53 Kopienzahl pro Zelle zu sein; jedoch die Mechanismen, mit denen diese entsteht, bedarf weiterer Untersuchungen.

Figure 1
Abbildung 1: adressierbare Tröpfchen Microarray Apparat und Chip. (ein) Tröpfchen entfallen manuell über einen 3-Achsen-Manipulator, um eine konzentrische Schläuche Düse zu übersetzen. Das wässrige Tröpfchen wird an bestimmten Stellen in einem Antikörper Microarray gefolgt von Kappung Öl verzichtet. (b) der Isolator ermöglicht eine höhere Dichte von adressierbaren Tröpfchen auf das Substrat durch Begrenzung der Ausbreitung des Öls. Isolatoren können durch Laser schneiden 0,5 mm Acrylplatten hergestellt werden. Zugunsten der Visualisierung der Tröpfchen, blaue Lebensmittelfarbe färben ist hinterlegt mit den Apparat in einem). 10 mm Einschub-Skala Skala bar 1 mm. (c) konzentrische Schläuche Düse adressierbare Tröpfchen ermöglicht gebildet werden, wie in Schritt 1.2 des Protokolls montiert. (d) eine Microinjector und Mikromanipulator werden verwendet, um Zellen in einzelne adressierbare Tröpfchen, zubereitet wie in Schritt 1.3 des Protokolls zu isolieren. (e) die grundlegende Schritte erstellen und Laden der adressierbare Tröpfchen wird angezeigt. Eine Antikörper-Stelle befindet sich mit einem codierten Übersetzung Stadium (1) Soweit die Spitze der Kapillare Schläuche ausgerichtet ist (2) und die wässrigen (3) dann Öl (4) Komponenten entfallen. Einzelne Zellen können mit einem Glas Microcapillary (5-8) kann immer wieder das wässrige Tröpfchen (7) und Hinterlegung eine Zelle (8) geladen werden. Skalieren Sie Bars 100 µm. Der rote Pfeil (5) und (8) isolierten Einzelzelle und der Inset (8) zeigt die isolierten Einzelzelle bei hoher Vergrößerung (Skala bar 10 µm). Teile dieser Figur verändert wurde, vom Verweis12, reproduziert mit Erlaubnis von The Royal Society of Chemistry. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Bild Analyseschritte. Jede Stelle im Array wird in regelmäßigen Abständen durch TIRF-Mikroskopie abgebildet, bis Gleichgewicht (tEq) (90 min für p53-Assay) erreicht ist. Die Gleichgewichtszeit hängt von t in Lösung als auch die Affinitäten der Antikörper-Paares für das gezielte Protein. (a) Beispiel Einzelmolekül TIRF-Mikroskopie Bilder Hintergrund sowie ein Beispiel Einzelzelle Pulldown (Skala Bars 20 μm). Einschub-Bild zeigt einen vergrößerten Teil des Hintergrundbildes mit einigen Einzelmoleküle hervorgehoben durch rote Pfeile (Skala bar 5 μm). (b) Gliederung der in Schritt 3 des Protokolls detaillierte Bildanalyse. Kurz gesagt, gibt es zwei breiten Regime, wo die Spots gelten darf, sind nicht verstopft, einzelne Moleküle spärlich und überlasteten, wo die Dichte der einzelnen Moleküle ist derart, dass es erhebliche Überschneidungen und kann nicht mehr einzeln identifizierbar sein. Ein entscheidender Schritt in der Bildanalyse ist Feld Abflachung um den Effekt des Profils ungleichmäßige Intensität der Erregung Laser entfernen. In der digitalen Zählwerk Regime werden einzelne Moleküle direkt identifiziert anhand ihrer Form und Intensität Parameter. In der analogen zählen Regime errechnet sich die Anzahl der einzelnen Moleküle durch die Messung vor Ort Gesamtintensität im Gleichgewicht und dividiert durch die durchschnittliche Intensität eines einzelnen Moleküls, die aus dem digitalen zählen Regime bekannt ist. Schritte können unkompliziert in ImageJ zum Analysieren der Daten automatisiert werden. Die unteren Panel Bildsequenz zeigt Ansammlung von Zielprotein auf die Antikörper-Erfassung vor Ort; Flecken sind zunächst nicht überlastet (t1), während als Zielprotein Antikörper vor Ort ansammelt, die einzelnen Moleküle zunehmend werden können (tn) verstopft, bis Gleichgewicht (tEq) erreicht ist. Beachten Sie, dass ein Ort, nicht überlastet bleibt oder überlastet hängt eine Reihe von Faktoren ab, insbesondere die Fülle des Zielproteins in der Analyse-Volumen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Single Zellendaten. Absolute Quantifizierung erfolgt über eine Kalibrierungskurve. (ein) einzelne Molekül zählt erfolgt über bekannte Konzentrationen des rekombinanten Proteins. Dies ist eine Kalibrationskurve und wird verwendet, um Einzelmolekül gezählt auf jede Stelle, Anzahl der Zielproteine in der Analyse Volumen umwandeln und daher einzelne Kopie Handynummer. Der horizontale rote gestrichelte Linie gibt die unspezifische Bindung von 187 ± 60 Molekülen. Die Fehlerbalken sind eine Standardabweichung des Mittelwerts 3 experimentelle läuft. Die gestrichelte Linie repräsentiert 100 % Erkennung von Protein. (b) eine Verteilung von der einzelnen Zelle basale p53-Protein-Expression in BE Krebszellen zeigt einer Long-tailed Gamma-ähnliche Verteilung zeigen, wo p53-Protein-Expression in einigen Zellen deutlich höher als der Modalwert ist. (c) Scatter Plot von p53 Protein Kopienzahl pro Zelle als eine Funktion des Zellvolumens zeigt, wie Protein-Expression in Abhängigkeit von der Zellgröße variiert. Teile dieser Figur wurden von 12 geändert und mit Erlaubnis reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Adressierbare Tröpfchen Microarrays sind eine sensible und erweiterbare Methode für quantitativ bestimmen die absolute Kopienzahl des Proteins innerhalb einer einzelnen Zelle.

Begrenzung der Höhe der unspezifischen Bindung ist (NSB) im Rahmen des Protokolls zur Erreichung möglichst geringen maximal Erkennung wie möglich. Proteine und andere biochemische Arten können unspezifisch binden an eine Reihe von Schnittstellen in die Tröpfchen-Deckglas Oberfläche, der Antikörper vor Ort und der Öl/Wasser-Grenzfläche. Proteine können verloren gehen, durch die Partitionierung in die Schnittstelle oder das Öl selbst. Wir haben gezeigt, dass 4 % BSA im wäßrigen Tröpfchen in der Lage, Begrenzung der NSB von Proteinen mit den Antikörpern im Protokoll angegeben. Alternative Protein-Targets und die Antikörper verwendet, um sie zu erkennen erfordern alternative blockierende Methoden, solche nichtionischen Detergentien oder kompatibel Tenside. Fluorierte Öle können auch auf ihre Eignung im Dienst als die Deckelung Öl geprüft werden. In solchen Fällen müssen weitere Überlegungen wie die kritischen Micelle-Konzentration und die Dichte der Deckelung Öl erfolgen.

Die ungewaschenen Drucken Puffer, der an jedem Ort nach Anordnung Aids ausgerichtet bleibt. Bei der zunächst die Tröpfchen Hinterlegung, muss darauf geachtet werden, nicht zerkratzen oder beschädigen der Antikörper-Spot durch die Spitze der Düse konzentrischen Rohren. Die Methode weiter zu entwickeln, kann ein Fluoreszenzfarbstoff in den Antikörper Drucken Puffer dotiert werden, die neben der Erfassung Antikörper immobilisiert wird. Dies würde es ermöglichen für Wasch- und blockieren Schritte vor Tröpfchen Anordnung durchgeführt werden; jedoch wäre ein solchen Schritt nicht unbedingt erforderlich, wenn automatisierte Methoden der Tröpfchen anordnen, die wie Inkjet-Druckverfahren.

Die Oberfläche der kommerziell sourced Deckgläsern, auf denen Tröpfchen gebildet werden, ist beschichtet mit ein hydrophiles Polymer und die wässrigen Tröpfchen produziert auf sie mit einem Volumen von 10 nL haben einen Durchmesser von 751 ± 42 mm. Gibt es ein Limit, wieviel der hinterlegte Tropfen sollte die Oberfläche nass oder breitet sich durch das Gewicht der Deckelung Öl da unten eine Mindeststärke gibt es erhöhte optische Streuung vom Laser TIRF Erregung. Die Streuung steigt das durchschnittliche Niveau der Hintergrund und kann Signal übertönen, wenn einzelne Moleküle zu erkennen. Der Antikörper-Spot muss auch der Tröpfchen Schneide gefunden werden, da das Anregungslicht Laser kann teilweise oder vollständig schlagen einen Bereich außerhalb der wässrige Tropfen. Der Grenzwinkel Bedingung wird nicht mehr für die Glas-Öl-Oberfläche im Gegensatz zu Glas-Wasser-Grenzfläche fällt Licht erfüllt sein.

Um die Fülle des Proteins die Anzahl der einzelne Moleküle gebunden an eine Stelle quantitativ zu bestimmen müssen durch Bildanalyse ermittelt werden. Um zu bestimmen, die gesamte Menge an Protein in Lösung von der Einzelmolekül-Zählung einer Kalibrationskurve ist erforderlich und ermöglicht die Technik absolut quantitative sein.

Zur Minimierung von Immunofluoreszenz Flecken werden nicht kontinuierlich abgebildet und die TIRF Laser Quelle erregerleistung wird minimiert. Das Protokoll wie vorgestellt hat seit photostabilen Fluorophore erfolgreich eingesetzt, wie z. B. die Alexa Fluor Farbstoffe. Alternative Fluorophore verwendet werden aber Immunofluoreszenz beurteilt werden muss und das Image Protokoll gegebenenfalls anzupassen. Die Gesamtzahl der einzelnen Moleküle pro Frame kann geplottet werden, gegen die Zeit, die verbindliche Kurve zu reproduzieren, obwohl dies sicherlich nicht notwendig wenn verbindliche Kinetik nicht gesucht und imaging sind genügt ein Einzelbild im Gleichgewicht ist.

Zwar gibt es eine Anforderung von zwei hohe Affinität Antikörpern, führt dies in einem hochsensiblen und hochspezifische Assay für Messungen auf der Ebene der einzelnen Zelle von entscheidender Bedeutung. Die p53-Antikörper, die in diesem Protokoll verwendeten sind gut bei der Aufdeckung von freien p53 aus einzelnen Zellen optimiert. Das Zielprotein wird bestimmt durch die Wahl von Antikörpern und können in verschiedener Weise geändert werden: 1, die Erfassung und Erkennung Antikörper können ersetzt werden, um alternative Ziele; binden 2, den detektionsantikörper kann Proteinprotein Interaktionen Sonde ersetzt werden oder Post-translationalen Modifikationen an das Protein gebunden an den Capture-Antikörper, z.B. bestimmen die Phosphorylierung Status der erfassten p53; 3, Multiplex-Assays können erzielt werden, indem Sie drucken mehrere Capture Antikörper-Spots in der Nähe – Drucken ein 3 × 3 vor Ort Array innerhalb 10nL Tröpfchen möglich ist. Natürlich müssen für jede Änderung des Zielproteins eine Reihe von Antikörper-Bildschirme, Steuerelemente und Optimierungen vorgenommen werden.

Mehrere Methoden zur Lyse Einzelzellen sind berichtet worden. 33 optische Lyse ist eine chemiefreie Ansatz zu schnell einzelne Zellen lysiert ohne Änderung der Inhalt der Zellen und Aufrechterhaltung der Integrität der Proteine und ihre komplexe. Chemische Reinigungsmittel Lyse stellt ein Problem für die Integrität der Tropfen bei der Verwendung von Mineralöl und kann Wechselwirkungen zwischen Molekülen stören. 34 Ansatz ist jedoch für Assays, wo chemische Lyse kompatibel ist, es attraktiv, da es nicht auf Geräte wie Laser oder Micropatterned Elektroden angewiesen ist. 35

Die Tröpfchen zeigen vergleichbaren Leistung mit alternativen Einzelzelle Methoden. In der aktuellen Generation von Tröpfchen, die mit der vorgeschlagenen p53-Antikörper ist das Niveau der NSB 187 ± 60 Moleküle pro Spot. Die Einzelmolekül-Grafen zeigen starke Linearität (R2 = 0,99) in der Region 105 –108 rekombinantem p53 Protein pro Tropfen. Dies deutet darauf hin, während niedrigere Niveaus des Proteins in den Zellen erkannt werden können, gibt es eine Begrenzung der Quantifizierung von 105 p53 Proteine; Dies entspricht einen Einzelmolekül-Zähler auf den Flecken der 901 ± 83. Dies ist vor allem durch das Volumen der Tröpfchen und Adsorption an der Oberfläche begrenzt. Die Leistung des p53-Assays ist so, dass wenn durchgeführt in einem 10 nL Volumen nur 1,1 ± 0,2 % der gesamten Zielprotein aus Lösung erfasst wird; Dies erhöht auf 85 ± 9 %, wenn die Analyse-Lautstärke auf 0,2 reduzieren nL. 36 durch die Verringerung des Volumens der Tröpfchen zu unter 1nL und Verringerung der Adsorption, besteht die Möglichkeit mit Hilfe der angegebenen Antikörper gegen p53 bei der Verbesserung der Nachweisgrenze zu < 50 Proteine pro Zelle. Adressierbare Tröpfchen haben daher das Potenzial, verwendet werden, um sehr niedrige Fülle Proteine aus einzelnen Zellen zu messen.

Die Adressierbarkeit der Tropfen durch den leicht durchlässig Öldeckel gewährte erlaubt das Zellvolumen Analyse sequenziell herausgefordert zu werden. Die Verwendung einer Mikropipette ermöglicht die Injektion von einer gewünschten Anzahl von Zellen in jedem Tropfen in einem Stecker von 10-20 pL, die nicht signifikant erhöht die Lautstärke. Für der Chip, dargestellt in Abbildung 1 b mit 100 Brunnen, Tröpfchen bilden und laden Sie sie mit einzelnen Zellen in der Regel dauert 75-90 min. Laden Zellen auch erreicht werden kann, durch die Adressierung des tröpfchens mit dem konzentrischen Düse anstelle der Mikropipette Schläuche oder mit einem Lösung, die Zellen enthält, wenn zunächst die Tröpfchen bilden. Letzteres wäre sinnvoll begrenzen Sie die Anzahl der Schritte im Protokoll aber in beiden Fällen, würde die Belegung pro Tröpfchen eine Poisson-Verteilung folgen. Dies würde den Anteil der einzelnen Zellendaten pro Chip begrenzen; jedoch würde die Tröpfchen mit NULL oder mehrere Zellen als Kontrollen dienen. Eine weitere Einschränkung bei der Verwendung der konzentrischen Düse zu Adresse Tröpfchen ist das Tröpfchen im 10nL Schritten steigern würde. Mit die vorgeschlagenen Änderungen über das könnte verbessert werden. Auf dem Chip Tröpfchen Mikrofluidik produzieren Tröpfchen mit hoher Frequenz und Potenzial in werden automatisch kombiniert mit ADM-Dateien zu erzeugen und manipulieren Tröpfchen und nacheinander in einer planaren Anordnung zu hinterlegen. Dies würde sicherlich Überwindung der Grenzen in der Produktion von ADMs Einzelmolekül Auslesen der Tröpfchen ermöglicht.

Die Fähigkeit, jeden einzelnen Tropfen zu bewältigen hat eine Reihe von Einsatzmöglichkeiten. Wir haben die Fähigkeit, einzelne Zellen nacheinander laden gezeigt. Es erlaubt auch Entfernung der Lyse ungebunden zellulärer materiellen Post und Post-Analyse mit Pipette für die Analyse, die mit anderen Methoden. Beispiele für nachfolgende Analyse sind quantitative Real-Time PCR oder Massenspektrometrie.

Die aktuelle Engpässe für Labore wollen in einzelne Zelle Protein-Analyse einen quantitativen Ansatz gehört die hohe technische Barriere und die Notwendigkeit für spezielle Ausrüstung. Mit ADMs, miniaturisierte können hohe Sensitivitätsanalysen ohne die Notwendigkeit für Reinraumanlagen, mikrofluidischen Lab-on-a-Chip-Geräte zu fabrizieren erreicht werden. Experimente sind nicht begrenzt durch die Gestaltung des Chips und ihre Lautstärke und die Position können geändert werden, ohne die Notwendigkeit für die Herstellung von neuen Meister. Natürlich gibt es Raum für Verbesserungen bei der Vereinfachung der Technik und senken die Einstiegsschwelle für einzelne Zelle Analyse, nur eine Microarrayer, Antikörper und Tröpfchen Microarrays sowohl ein Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser, Bild drucken.

Eine Reihe von klinischen Anwendungen der einzelnen Zelle Analyse entstehen, insbesondere bei der Behandlung von Krebs. Tumor-Heterogenität ist eine große Herausforderung für wirksame Chemotherapie. In Tumorentwicklung, Mutationen entstehen mit zunehmender Häufigkeit und Heterogenität kann dazu führen, morphologische, genetische, und Proteomic Variabilität. Einzelne Zelle Analyse kann lösen zellulären Heterogenität innerhalb eines Tumors und bieten eine Plattform, um zu helfen, besser zu verstehen und vorherzusagen, Widerstand und Guide Arzneimitteltherapie.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

ASR geplante Experimente, Protokolle entwickelt und analysiert Daten. SC und PS durchgeführt Zelle Größe Experimente. ASR und OC schrieb das Manuskript. Die Autoren möchten die Unterstützung von Prof. David R. Klug dankbar anerkennen, für den Zugriff auf Geräte. Die Autoren danken der Imperial College Advanced Hackspace für den Zugriff auf Fertigung und Prototyping Anlagen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Life Technologies 10010015
DMEM high glucose Sigma D6429
Foetal Bovine Serum (FBS) Biochrom S0115
cell culture flasks Corning SIAL0639
Trypsin/EDTA Biochrom L2153
Name Company Catalog Number Comments
Microarray
Microcontact Arrayer DigiLab, UK OmniGrid Micro
Microcontact pin ArrayIt, USA 946MP2
Coverslips (Nexterion) Schott, Europe 1098523 Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17
p53 capture antibody Enzo ADI-960-070
p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled Santa Cruz sc-126 stock concentration 200μg/mL
Saline-sodium citrate buffer Gibco 15557-044
Betaine Sigma 61962
Sodium dodecyl sulphate Sigma L3771
384 well plate (low volume) Sigma CLS4511
Nitrogen gas cylinder BOC Industrial grade, oxygen-free
Name Company Catalog Number Comments
Droplets
Micromanipulator Eppendorf Patchman NP2
Manual Microinjector Eppendorf CellTram Vario
Micropipette Origio, Denmark MBB-FP-L-0
Syringe pumps KD Scientific KDS-210
100 μL syringe Hamilton 81020 Gas tight, PTFE Luer lock
1 mL syringe Hamilton 81327 Gas tight, PTFE Luer lock
Silicone isolator Grace Bio-Labs JTR24R-A-0.5 6x4 well silicone isolator with adhesive
Laser cutter VersaLASE VLS2.30 CO2 Laser 3W for laser cutting of custom isolators
1mm thick acrylic sheet Weatherall-UK Clarex Precision Sheet 001 for laser cutting of custom isolators
Adhesive sheet 3M used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips
Super glue Loctite LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing IDEX FS-115
1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing IDEX 1503
0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing Kinesis 008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing IDEX 1673
Bovine Serum Albumen (BSA) Fisher Scientific BP9700100
Mineral oil Sigma M5904
Ultra-pure water Millipore, Germany MilliQ
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy & Optics
TIRF microscope with encoded XY stage Nikon, Japan Nikon Ti-E
EM-CCD Andor Technologies, Ireland IXON DU-897E
Laser excitation source Vortran, USA Stradus 488-50
Optical lysis laser source Continuum, USA Surelite SLI-10
Microscope filter cube for TIRF Chroma, USA z488bp
Microscope filter cube for Optical Lysis Laser 2000, UK LPD01-532R-25
Name Company Catalog Number Comments
Software
Fiji Open Source Image analysis software
Matlab Mathworks version 7.14 or higher Image analysis software

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References

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Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays
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Chatzimichail, S., Supramaniam, P.,… More

Chatzimichail, S., Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays. J. Vis. Exp. (137), e56110, doi:10.3791/56110 (2018).

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