Summary
Robust afledning af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPS) celler blev opnået ved anvendelse af ikke-integrerende Sendai virus (SeV) vektor-medieret omprogrammering af dermal fibroblaster. HiPS-cellevedligeholdelse og klonal ekspansion blev udført under anvendelse af xenofrie og kemisk definerede dyrkningsbetingelser med rekombinant human laminin 521 (LN-521) matrix og essentielt E8 (E8) medium.
Abstract
Xeno-fri og fuldt definerede betingelser er nøgleparametre for robust og reproducerbar generation af homogene humane inducerede pluripotente stamceller (hiPS) celler. Vedligeholdelse af hiPS-celler på feederceller eller udefinerede matricer er modtagelige for batchafvigelser, patogen forurening og risiko for immunogenicitet. Ved anvendelse af den definerede rekombinante humane laminin 521 (LN-521) matrix i kombination med xenofri og definerede medier formuleringer reducerer variabilitet og muliggør konsistent generering af hiPS celler. Sendai-viruset (SeV) -vektoren er et ikke-integreret RNA-baseret system, hvorved omgåelse af bekymringer forbundet med den potentielle forstyrrende virkning på genomets integritet integrationsvektorer kan have. Desuden har disse vektorer vist relativt høj effektivitet ved omprogrammeringen af dermale fibroblaster. Derudover letter enzymatisk enkeltcellepassaging af celler homogen vedligeholdelse af hiPS-celler uden væsentlig tidligere erfaring med stamcellerLl kultur. Her beskriver vi en protokol, der er blevet omfattende testet og udviklet med fokus på reproducerbarhed og brugervenlighed, hvilket giver en robust og praktisk måde at generere definerede og xenofrie humane hiPS celler fra fibroblaster.
Introduction
Siden den første afledning af hiPS cellelinier af Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-celler har tilvejebragt et nyttigt værktøj til sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og som kildemateriale til generering af celleterapier i regenerativ medicin 3 . HiPS cellekultur har længe været afhængig af co-kultur med fibroblast feederceller 4 , 5 eller på Matrigel 6 og med medieformuleringer indeholdende føtalt bovint serum (FBS). Batch-to-batch-afvigelser er en fælles konsekvens af de ubetingede karakter af disse kulturbetingelser, hvilket resulterer i uforudsigelige variationer, hvilket er en væsentlig bidragyder til disse protokolers upålidelighed 7 . Udviklingen af defineret medium, såsom essentielle 8 (E8) 8 og definerede cellekulturmatricer, for eksempel LN-521 9 , tilladerS til etablering af højt reproducerbare protokoller og hjælp til robust generering og vedligeholdelse af homogene hiPS celler 7 , 8 , 9 , 10 .
Udvikling af integrationsfri omprogrammeringsteknikker har været et spring fremad. Oprindelig var omprogrammeringen afhængig af retrovirale vektorer, som tilfældigt integreredes i genomet med forstyrrende virkninger på genomisk integritet 11 . Fremskridt i omprogrammeringsmetoder omfatter udvikling af RNA-baserede vektorer. RNA-vektorer har en fordel i forhold til den DNA-baserede omprogrammeringsmetode, idet utilsigtet integration via genomisk rekombination ikke er mulig 12 . SeV-vektorer tilvejebringer høj og forbigående ekspression af exogene faktorer gennem enkeltstrenget RNA uden en DNA-fase 11 . De omprogrammerende vektorer leveret af SeVFortyndes gennem celleudvidelse og til sidst udstødes fra kulturen, der giver en fotoprintfri måde at omprogrammere. Derefter er vedligeholdelse af pluripoten afhængig af endogen ekspression af pluripotensgenerne 2 .
Som pionerende hiPS-cellebaserede terapier begynder at bevæge sig ind i kliniske forsøg, er kravene til standardiserede batches, reproducerbarhed og sikkerhed væsentlige spørgsmål for at behandle 13 . Derfor bør produkter af animalsk oprindelse undgås. For eksempel har brugen af xenogene produkter været forbundet med risiko for ikke-humant patogenforurening. Celler, der er dyrket i nærværelse af dyreafledte kulturkomponenter, har også vist sig at inkorporere ikke-humane siliaki-syrer i cellemembraner, som truer med at gøre afledte celler immunogene 14 . Derfor er behovet for at fjerne xenogene produkter nødvendigt for fremtidige kliniske sysler. Denne protokol gælder xeIngen fri og defineret kultur i vedligeholdelsen af hiPS celler flytter celler tættere på klinisk overholdelse.
Denne protokol beskriver en konsistent, meget reproducerbar og nem at bruge metode, der genererer standardiserede hiPS-celler fra fibroblaster. Det giver også et brugervenligt kultursystem til vedligeholdelse af etablerede hiPS-celler. Denne protokol er blevet brugt til at udlede mere end 300 hiPS cellelinjer i den svenske nationale menneskelige iPS Core-facilitet ved Karolinska Institutet, hvoraf nogle linjer tidligere er beskrevet 15 , 16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Indsamlingen af patientmateriale og afledning af hiPS-celler er godkendt af Etisk Review Board, Stockholm, 28. marts 2012, Registreringsnummer: 2012 / 208-31 / 3. Cellekulturstrin bør udføres i biosikkerhedskapsler, medmindre andet er nævnt. Brug altid sterile håndteringsteknikker, når du arbejder med celler. Lad medier, plader og reagenser nå stuetemperatur, før de startes. Inkuber celler ved 37 ° C, 5% CO2 i høj luftfugtighed.
1. Isolering af humane fibroblaster fra dermal biopsi
- Forberedelser af kulturmedium, fordøjelsesenzymer, belægning af retter og dissekeringsværktøjer.
- Forbered Fibroblast Medium: 44,5 mL Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMDM), 5 mL Fetal bovint serum (FBS) og 500 μL Penicillin / Streptomycin (PEST) (se Tabel 1 ), opbevares ved 4 ° C.
- Forbered fordøjelsesenzymer ved en arbejdskoncentration på 1 mg / ml: weiGh alikvoter af 4 mg dispase- og collagenase type I pulver i separate 15 ml rør og opløse i 4 ml DMEM / F12 + 1% PEST. Steriliser den enzymatiske opløsning ved at passere den gennem en 0,22 μm sil. Forbered frisk enzymopløsninger hver gang.
- Coat en brønd i en 6-brønd vævskulturplade (eller 35 mm vævskulturskål) pr. Biopsi dissekeret med 1 ml 0,1% gelatine i phosphatpufret saltopløsning (DPBS). Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Autoklaver et sæt kirurgiske saks og tænger pr. Biopsi til dissektion.
- Biopsi håndtering
BEMÆRK: Behandle biopsier hurtigst muligt efter at være taget. Opbevares i PBS + 1% PEST i op til 48 timer ved 4 ° C. Biopsi bør være 2 - 4 mm i diameter i størrelse og i overensstemmelse med etiske tilladelser.- Overfør biopsi til en 35 mm skål. Flyt biopsien til en ny 35 mm skål og nedsænk biopsien i 2 ml 70% ethanol i 30 s.
- Flyt biopsien til en tredjedel35 mm skål og vask med 1 ml steril Hank Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med 1% PEST.
- Overfør biopsi til en fjerde 35 mm skål, tilsæt 1 ml frisklavet 0,1% dispasopløsning.
- Skær huden biopsi i 1 - 2 mm 3 stykker i skålen ved hjælp af kirurgiske saks og tang og derefter overføre biopsi stykker herunder dispase opløsning i et 15 ml rør. Tilsæt yderligere 2 ml dispase.
- Skyl 35 mm skålen med en 1 ml dispasopløsning og overfør til 15 ml rør.
- Inkubér biopsien ved 4 ° C natten over.
- Tilsæt 4 ml 0,1% kollagenase I til røret og inkuber ved 37 ° C i 4 timer.
- Centrifuger de fordøjede celler 300 xg i 3 minutter, aspirer supernatanten og resuspender fordøjelsen i 2 ml fibroblastmedium.
- Fjern gelatineopløsningen fra 6-brønds vævskulturpladen. Overfør cellesuspensionen inklusive eventuelle resterende stykker til 6-brønds vævskulturplade (eller 35-mM vævskulturskål) præcoeret med 0,1% gelatine i DPBS.
- Skift mellemlang hver tredje dag.
- Udvidelse af humane fibroblaster
BEMÆRK: Fibroblaster er klar til at blive passeret til en T25 (25 cm 2 ) vævskulturflaske, når 80% konfluent ( Figur 2B ). Fibroblaster når typisk 80% konfluens inden for 7 dage. Den nødvendige tid kan dog variere meget, men bør ikke være længere end 4 uger.- Aspirationsmedium og vask en gang med 2,5 ml DPBS.
- Fjern DPBS og tilsæt 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%) og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter eller indtil cellerne viser afrundede kanter og begynder at løsne.
- Tilsæt 2 ml fibroblastmedium, hvis nødvendigt skyll cellerne, der sikrer korrekt disassociering af celler. Overfør celleopløsningen til et 15 ml rør og centrifuge ved 300 xg i 3 minutter.
- Kassér supernatant og resuspender cellepellet i 5 ml fibroblastmedium og pladefibroblaster i enT25-kolbe på en overtrukket cellevævskultur. Ved ekspansion af fibroblaster efter dette trin dissocieres som beskrevet ovenfor og frø 12 x 10 3 celler / cm2.
- Når konfluente celler er klar til at blive frosset, skal du udvide eller pladen til omprogrammering. Fryse ned to runder fibroblast før nogen omprogrammering er startet (se næste afsnit for fryseprocedure). Omprogrammeringseffektivitet er generelt højere for nedre passagefibroblaster, celler ved passage 2-4 er optimale. Imidlertid er vellykket omprogrammering af fibroblaster op til passage 10 blevet udført under anvendelse af denne protokol.
- Frysning og optøning af fibroblaster
- Forbered friskfibroblastfrysemedium: 90% FBS + 10% dimethylsulfoxid (DMSO). Opbevares ved 4 ° C ( tabel 1 ). Når det er sammenfaldende, kan T25 vævskulturkolbe fryses i tre kryogener. Forbered 500 μl fibroblastfrysemedium pr. Hætteglas frosset.
- For at fryse celler, dissocierer cElls som beskrevet i Trin 1.3, tæller celler ved anvendelse af et hæmocytometer og overfør portioner af 3 x 10 5 celler til 15 ml rør. Spin rør ved 300 xg i 3 min. Aspirer supernatant.
- Resuspender cellepellets i 500 μl 4 ˚C fibroblastfrysemedium og overfør til cryovials. Anbring hætteglassene i en frysebeholder og inkuber celler ved -80 ° C i 24 timer, før de overføres til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
- For at tine cellerne, nedsænk den nedre del af cryovialet i 37 ° C vand. Når først væskefibre er overført, overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør og tilsæt 5 ml fibroblastmedium. Spinceller 300 xg i 3 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml fibroblastmedium. Overfør celler til en ikke-overtrukket T25 vævskulturflaske og inkuber i 37 ° C.
2. SeV Vector Reprogrammering af fibroblaster
- Fremstilling af vektoralikvoter FORSIGTIG: Håndter SeV under biosikkerhedsniveau 2 indeslutning. Se producentens protokol og lokale retningslinjer 17 . Virustiter varierer mellem partier.
- Før beregning af alikvoter beregnes mængden af vektor, der er nødvendig for 5 x 10 4 celler ifølge producentens protokol ( f.eks . CytoTune 2.0). Virustiteren varierer generelt fra 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Optøn og kombiner vektorer 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 og hKlf4 = MOI 3). Del mængden beregnet til omprogrammeringen af 5 x 10 4 celler i autoklaverede 1,5 ml rør. Fortynd virus alikvoter med fibroblast medium til et slutvolumen på 250 μl til omprogrammering.
BEMÆRK: Hvert hætteglas er gyldigt til omprogrammering af en brønd i en 24-brønd vævskulturplade med 5 x 104 fibroblaster. Gem virusalikvoter ved -80 ° C.
- Før beregning af alikvoter beregnes mængden af vektor, der er nødvendig for 5 x 10 4 celler ifølge producentens protokol ( f.eks . CytoTune 2.0). Virustiteren varierer generelt fra 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Optøn og kombiner vektorer 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 og hKlf4 = MOI 3). Del mængden beregnet til omprogrammeringen af 5 x 10 4 celler i autoklaverede 1,5 ml rør. Fortynd virus alikvoter med fibroblast medium til et slutvolumen på 250 μl til omprogrammering.
- SeV Vector transduktion
- Aspiratcelle cuMedium og vask med 1 ml DPBS. Aspirer DPBS og tilsæt 1 ml trypsin-EDTA (0,05%). Inkuber ved 37 ° C i 5 minutter eller indtil cellerne løsnes.
- Tilsæt 2 ml fibroblastmedium og resuspender cellerne og overfør til et 15 ml rør. Centrifug 300 xg i 3 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml fibroblastmedium.
- Tæl fibroblaster ved at anvende en hæmocytometer og frø 5 x 104 celler i en brønd i en 24-brønd vævskulturplade. Inkubér celler ved 37 ° C natten over.
- Aspiratcellekulturmedium tilsættes 250 μl af SeV-opløsningen og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Skift mellem dagligt til frisk fibroblastmedium. Tillad transducerede celler at vokse i 7 dage, før de passerer til LN-521 coatede plader. Forbered LN-521 plader dagen før passage. Se 2.3.1 for belægningsprocedure.
- Replatering af transducerede fibroblaster
- Fremstilling af LN-521 overtrukne retter: Fortynd LN-521 i DPBS til en slutkoncentration på 0,63 μg / cm2. Pipetter 2 ml af LN-521-opløsningen pr. 60 mm vævskulturskål. Tæt 60 mm vævskulturskålen ved hjælp af parafilm. Inkubér natten over ved 4 ° C.
- Forbered essentielle 8 medium (E8) alikvoter til lettere håndtering: 48,5 ml E8 medium, 1 ml E8 supplement og 500 μL PEST ( tabel 1 ).
- 7 dage efter transduktion passerer cellerne til en LN-521 coatet 60 mm vævskulturskål. Tilsæt 250 μL trypsin-EDTA (0,05%) og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter eller indtil cellerne har løsnet. Tilsæt 2 ml fibroblastmedium og centrifugeceller i 3 minutter ved 300 x g.
- Aspirer supernatanten. Resuspender pellet i 2 ml fibroblast medium og tælle celler i et hæmocytometer. Aspirer LN-521-opløsning fra den for-belagte plade og frø 4 x 10 4 celler i 5 ml fibroblastmedium i LN-521 precoated 60 mm skål. Tilsæt Rho-kinaseinhibitor Y-27632(ROCKi) til en slutkoncentration på 5 μM. Inkubér i 37 ° C natten over.
- Vigtigt, næste dag, skift mellem medium til E8 medium. Skift E8 medium dagligt. HiPS celle kolonier vil dukke op inden for 2 - 3 uger.
3. Plukning af kolonier og udvidelse af hiPS-celler
BEMÆRK: Følgende trin udføres uden for biosikkerhedskabinet under et stereomikroskop. Brugen af hårnet og procedure masker anbefales. Arbejd forsigtigt med ikke at forurense cellekulturen.
- Forbered LN-521 coatet vævskultur 24-brøndsplader dagen før plukning. Fortynd LN-521 i DPBS 0,63 μg / cm2. Pipetter 250 μL af LN-521 opløsningen i en brønd i en 24-brønd vævskulturplade. Tætningsplader ved brug af parafilm. Inkubér natten over ved 4 ° C.
BEMÆRK: Kolonier er klar til at blive plukket, når de når en størrelse> 1 mm i diameter. Kolonier skal vise skarpe kanter og vokse i homogen monOlayere ( figur 2D ). - Aspirere LN-521-opløsningen og tilsæt 500 μl E8 i en brønd i en 24-brønd vævskulturplade.
- Skær kolonier i mindre stykker med en skalpel i et gitter som mønster under et stereomikroskop. Skrab cellarkene mekanisk ud af skålen og overfør arkene ved hjælp af en 200 μL pipette til den forberedte brønd ( Figur 2D -2E ). Vælg kolonier i separate brønde.
- Tillad, at cellerne vedhæftes uden at ændre medium i 48 timer. Derefter ændres E8-medium dagligt.
- Når kolonierne har nået en størrelse på> 5 mm, passerer enzymatisk celler som enkeltceller til en ny brønd af en LN-521-belagt plade.
- Aspirere celledyrkningsmediet fra celler og vask med 250 μl DPBS.
- Aspirer DPBS. Tilsæt 250 μl dissociationsreagens og inkuber i 3 minutter ved 37 ° C.
- Vær opmærksom på, at cellerne er begyndt at runde op. LøsriveCeller fra pladen ved at skylle cellerne med dissociationsreagens et par gange.
- Tilsæt 500 μl E8 medium til et 15 ml rør. Overfør cellerne i dissociationsreagenset til røret og centrifuger i 3 minutter ved 300 x g.
- Aspirér LN-521-opløsningen fra LN-521-forcoatet brønd og tilsæt 500 μL rumtemperatur E8-medium.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 500 μl E8-medium.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og frø 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 celler i den præparerede LN-521 præcoated brønd (1,25 x 104-4,5 x 104 celler / cm2). Cellkulturformat kan let opskaleres for at passe til det tilsigtede formål.
- Tilsæt ROCKi til en slutkoncentration på 10 μM. Inkuber celler ved 37 ° C.
- Skift E8 medium dagligt. Celler er normalt klar til passage efter 4 - 6 dage. Enzymatisk passage af celler som enkeltceller som beskrevet ovenfor, når ca. 90% sammenflydende.
BEMÆRK: Reprogrammeringsvektorerne fortyndes gradvist under hiPS-celleudvidelse og kan ikke påvises efter passage 12. Celler, der er upartisk omprogrammeret, ophører ofte med at proliferere omkring passage 6-10 eller miste deres karakteristiske pluripotente stamcellemorfologi ( figur 3B ). - Frysning og optøning af hiPS-celler
- For at fryse celler, dissocierer enzymatisk celler som enkeltceller som beskrevet ovenfor, tæller celler i et hæmocytometer og overfører 2,5 x 10 5 celler til et 15 ml rør indeholdende 1 ml E8-medium. Centrifuge ved 300 xg i 3 min. Aspirer supernatanten.
- Resuspender cellepellet i 250 μl 4 ° C PSC-cryomedium og overfør til en cryovial. Anbring hætteglasset i en frysebeholder og inkuber celler ved -80 ° C i 24 timer, før de overføres til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
- Til optøning af celler fremstilles en præcoated LN-521 brønd i en 24-brønds vævskulturPlade ved at aspirere LN-521-opløsningen og tilsætte 250 μl E8-medium. Neddyb den nedre del af cryovialet i 37 ° C vand, indtil kun en lille krydderi forbliver.
- Tilsæt 250 μl E8 Medium til cryovialet og overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør og tilsæt 1 ml E8-medium. Spinceller 300 xg i 3 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepellet i 250 μl rumtemperatur E8 medium. Overfør cellesuspensionen til den tilberedte brønd og tilsæt 1% celle levedygtighed supplement eller 10 μM ROCKi. Inkuber vævskulturpladen ved 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fra biopsi til hiPS-celler
Hele processen fra biopsi til etablerede hiPS-celler, fjernet fra omprogrammeringsvektor og klar til karakterisering, tager cirka 16 uger ( figur 1 ). En mere detaljeret tidslinje er angivet i figur 2A . Ca. 4 uger er nødvendige for at etablere og udvide fibroblast kulturer. De første hiPS celle kolonier begyndte at dukke op omkring tre uger efter Sendai vektor transduktion. Kolonier blev plukket mekanisk til den første passage og passerede derefter enzymatisk som enkeltceller.
Etablering af humane fibroblastkulturer
Når de humane fibroblastkulturer var vokset til konfluens og viste accepteret morfologi, blev de først udvidet og frosset for to passagerEs, før de bliver plettet for transduktion ( figur 2B ).
Omprogrammering af humane fibroblaster under anvendelse af SeV-vektorer
Forøgede niveauer af celledød blev fundet i dagene efter SeV-transduktion, og der blev observeret små ændringer i fibroblastmorfologi. Fremkaldelse af de første hiPS kolonier blev detekteret fra dag 12 efter transduktion ( Figur 2A , 2C ). Kolonier, der var klar til at blive plukket, blev forventet omkring tre til 4 uger efter transduktion ( figur 2A , 2D ). Seedceller i de mængder, der er specificeret i denne protokol, resulterede i en overflod af kolonier, der opstod (<20). Selektiv udvælgelse af kolonier, der udviser den gunstige morfologi, anbefales. Kolonien har foretrukne inkluderede fladede kompakte celler masse, vækst som homogene monolag, særskilt indi Viduelle celler med skarp kant mod omgivende fibroblaster ( figur 2D ). HiPS-cellekolonierne blev skåret i et gitterlignende mønster ved anvendelse af en skalpel og mekanisk passageret ( figur 2E ). Plukede hiPS-kloner blev efterladt i 48 timer for at klæbe til pladen uden medium ændring. HiPS-cellekloner var yderst homogene, men få fibroblaster stammer fra omprogrammeringspladen blev tolereret under de to første passager ( figur 2F ). Plukning af kolonier med besværlige grænser og stor ukompakt heterogen cellemasse bør undgås ( figur 2G ). Opnådde hiPS-cellelinjer voksede som tætte monolag, med stort kerne-til-cytoplasmaforhold og havde defineret lysende grænser. I modsætning hertil blev adhærerede ikke-homogene kolonier, der ikke opfyldte disse kriterier, kasseret ( figur 2H ) for at undgå kulturer af blandede cellepopulationer.
P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Validering af hiPS-celleklonerPluripotens karakterisering af afledte celler blev udført, efter at SeV-vektoren var gået tabt, og vedligeholdelsen af pluripotente tilstand blev drevet af ekspressionen af endogene faktorer. Før du fortsætter med hiPS-cellevalidering, skal du sørge for, at SeV-vektorudtrykket er tabt. Efter denne protokol er SeV-vektor-RNA ikke længere detekterbart ved passage 12 ifølge vores erfaring, og dermed et egnet udgangspunkt for karakterisering ( figur 3A ). Immunocytokemi farvning for pluripotensmarkører OCT4, SSEA4 og NANOG bør give et homogent positivt resultat ( figur 3B ). Cellekulturer indeholdende delvis omprogrammerede celler, der ikke udtrykte pluripotensfaktorer, blev kasseret ( figur 3C ). MRNA-ekspression af endogene pluripotensgener er vist ved realtid-pc R (RT-PCR) i figur 3D .
Pluripotente stamceller bør let kunne differentiere i de tre kimlag. HiPS-celler differentieringspotentiale blev vurderet ved dannelse af embryoidlegemer (EB) 18 . Frie flydende EB'er genereret fra hiPS-celler er vist i figur 3E, og mRNA-ekspression af kimlagsspecifikke markører efter 21 dages EB-differentiering er repræsenteret i figur 3F .
Figur 1: Flowdiagram fra hudbiopsi til hiPS-celler.
Oversigt over de vigtigste trin i protokollen. Illustrationen omfatter biopsiopsamling, isolering af fibroblaster, SeV-transduktion, plukning af kolonier og klonal ekspansion af hiPS-celler.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kritiske trin i genereringen af hiPS-celler.
(A) Tidslinje fremhæver vigtige tidspunkter i protokollen, herunder fibroblastplating, SeV-transduktion, mediumændringer og belægninger. Passage 12 af hiPS-celler fremhæves som starten på karakteriseringsforsøg. (B) Lysfeltbillede af konfluente fibroblaster i kultur med typisk morfologi. (C) Fremkaldelse af hiPS-cellekolonier fra transducerede fibroblaster. (D) Klar til at vælge koloni med præferencefunktioner, flad kompakt cellemasse, skelnelige individuelle celler med skarpe kanter mod omgivende fibroblaster (Passage 0). (E) hiPSCellekolonier skæres i et gitterlignende mønster og passerer mekanisk . (F) Adhered koloni efter et par dage med vækst. De adhærerede hiPS-celler er omgivet af et usædvanligt højt antal fibroblaster stammer fra omprogrammeringspladen. Fibroblasterne kan skrabes af pladen og vil sandsynligvis forsvinde med efterfølgende enkeltceller passager (Passage 1). (G) Kolonier, der viser morfologi, der ikke minder om fuldt omprogrammerede celler; Nøjeregnende grænser, stor ukompakt heterogen cellemasse. (H) Brightfeltbillede, der eksemplificerer en tidlig passagehomogent fuldt omprogrammeret hiPS-cellelinie sammenlignet med en stærkt heterogen cellelinie. Skalestænger angiver 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af hiPS-celler.
(A) RT-PCR af SeV-vektorspecifikke markører. HiPS-celler ved passage 3 anvendes som positiv kontrol for de omprogrammerende vektorer1. Ved passage 12 er celler negative for ekspression af virusspecifikke markører Sendai-specifikke rygrad (SeV B), Sendai-specifikke KLF4 (KLF4 SeV), Sendai-specifikke cMYC (cMYC SeV), PCR-kontrol (GAPDH) og ingen skabelon (-). (B) Repræsentativt eksempel på fuldt omprogrammeret homogen hiPS cellelinie ved passage 12. Bright field image af hiPS celler afslører celler vokser i stramme monolayers med skarpe luminescerende kanter og med store kerner og lille cytoplasma. Immunocytokemisk farvning af pluripotensmarkører OCT4, NANOG, SSEA4 og nuklear farvning 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), der demonstrerer homogen positiv ekspression. (C) Cellelinie udviser heterogen ekspression for pluripotensmarkør NANOG. KulturenE indeholder delvis omprogrammerede celler og skal kasseres. (D) RT-PCR af mRNA-ekspression af pluripotensmarkører NANOG, OCT4, PCR-kontrol (GAPDH) og ingen skabelon (-), der angiver ekspression af pluripotensmarkører. (E) Frie flydende embryoidlegemer dannet fra hiPS-celler. (F) RT-PCR efter 21 dages embryoid kropsdifferentiering viser, at afledte hiPS-celler er i stand til differentiering af de tre kimlag. Endodermale markører AFP og GATA4, mesodermale markører RUNX og HAND1, ektodermale markører NCAM og NESTIN, PCR-kontrol (GAPDH) og ingen skabelon (-). Skalestænger angiver 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det forventede resultat af denne protokol er den vellykkede generering af flere klonalt afledte hiPS-cellelinier. Det er vigtigt, at metoden til vedligeholdelse og udvidelse af etablerede hiPS-celler her beskrevet er pålidelig og kan udføres med lidt tidligere erfaring med stamcellekultur. Enzymatisk enkeltcellepassaging med ROCKi sammen med LN-521-matrixen er kendt for at bevare cellerne som karyotypisk normale, pluripotente og let i stand til at differentiere samtidig med at man undgår induceret heterogenitet, at kolonibaseret passage kan stimulere 10 , 19 , 20 . HiPS-celler dyrket på LN-521 kan passeres som enkeltceller uden tilføjelse af ROCKi 10 , men tilføjelsen af ROCKi gør protokollen lettere for mindre erfarne håndtere og reducerer den tid, der kræves for hiPS-celle-afledning.
Omprogrammeringseffektivitet er geNært ikke et problem med denne protokol; SeV-vektorer har relativt høj omprogrammeringseffektivitet> 1% for fibroblaster 11 . Fremkomsten af en overflod af kolonier (<20) forventes. Det anbefales at vælge tre gange antallet af kolonier, der er nødvendige. Det er blevet observeret, at en del af plukket kloner ikke klæber efter plukning. Ekstra kolonier kan også være nødvendige for at kompensere for delvist omprogrammerede kolonier. Delvist omprogrammerede kolonier er i nogle tilfælde i stand til at klæbe og vokse understøttet af eksogen ekspression af pluripotensgener af SeV-vektorerne. Da SeV-vektorerne fortyndes, ophører disse celler med at proliferere og dissociere, sædvanligvis tilsyneladende omkring passage 6-8. Heterogeniteten af kulturen er også et tegn på delvis omprogrammering, og heterogene linjer bør kasseres ( figur 2H ).
Det optimale valg af omprogrammering af vektor- og kulturbetingelser afhænger afFormålet med de dannede celler. For at undgå batch-batch-afvigelser, der påvirker resultaterne, anbefales det dog at definere bestemte betingelser. Valget af et ikke-integrerende vektorsystem er foreslået for at bevare genomiske integritet af omprogrammerede celler. SeV-vektorer blev valgt i denne protokol på grund af robustheden, forholdsvis høj effektivitet og lave krav til tiden. SeV-vektorerne fortyndes under celleafdelinger og er ikke detekterbare omkring passage 12 og sikrer således, at genererede data ikke påvirkes af eksogen ekspression. På grund af de omhyggelige krav til celler beregnet til kliniske formål kan SeV-omprogrammering være en barriere for klinisk oversættelse, da det er vanskeligt at afvise fuldstændig afgivelse af alt vektormateriale. MRNA-medieret omprogrammering kan være fordelagtig, hvis der udledes celler med tilsigtet anvendelse i celleterapier 12 . Disse metoder er imidlertid langt mere arbejdskrævende og mere komplicerede at bruge 21 . Metoden her deScribed for fibroblast kultur er også uegnet til kliniske anvendelser. Da både FBS og gelatine er xenogene og udefinerede, overvej at skifte disse til definerede xenofrie produkter 22 .
Sterile håndteringsteknikker og regelmæssig mycoplasmainfektionstest anbefales under arbejdet med enhver form for cellekultur. Menneskehud indeholder mange mikroorganismer, der kan trives under de betingelser, cellerne dyrkes i, hvis de ikke håndteres korrekt. Det anbefales derfor at være ekstra opmærksom på håndteringen af hudbiopsier og i de første dage af kulturen efter biopsi behandling. Oprettelsen af fibroblastkultur fra hudbiopsier er faktisk en tidskrævende proces. Efter behandling af hudbiopsi vil der i starten være svage tegn på fibroblastceller vedhæftning. Vent således mindst en uge for at finde nogle få fibroblastceller, der viser forventet morfologi i kulturen. Den tid, der er nødvendig for etablering af fibroblasterIn vitro kulturer fra biopsier er afhængige af en række faktorer, herunder størrelse af biopsi, donorens alder og hvordan biopsien er blevet håndteret siden den blev taget. Det foretrækkes at omprogrammere tidlige passagefibroblaster for optimal omprogrammeringseffektivitet 23 .
Sammenfattende beskriver vi her en etableret robust og nem at bruge metode til generering af højt homogene hiPS celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at rapportere.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af SSF (B13-0074) og VINNOVA (2016-04134) finansieringsagenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 mL tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 mL | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Sealing plates for storage |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
