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Developmental Biology

लाइमिनिन 521 मैट्रिक्स का उपयोग करने वाले मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का एकीकरण फ्री डेरीवेशन

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56146
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

Summary

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (एचईपीएस) कोशिकाओं के मजबूत व्युत्पन्न त्वचीय फाइब्रोब्लैस्ट्स के गैर-एकीकृत सेंडाइ वायरस (सीएवी) वेक्टर मध्यस्थताग्रस्त reprogramming का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। एचईपीएस कोशिका के रखरखाव और क्लोनल विस्तार को पुन: संयोजक मानव लैमिनिन 521 (एलएन -521) मैट्रिक्स और आवश्यक ई 8 (ई 8) मध्यम के साथ एक्सो मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति शर्तों का उपयोग किया गया था।

Abstract

एक्सो-फ्री और पूरी तरह से परिभाषित स्थितियां समरूप इंसान प्रेरित प्लूइपोटेंट स्टेम (एचपीएस) कोशिकाओं के मजबूत और प्रजनन योग्य पीढ़ी के प्रमुख पैरामीटर हैं। फीडर कोशिकाओं या अपरिभाषित मैट्रिक्स पर हायपीएस कोशिकाओं के रखरखाव बैच के भिन्नता, रोगजनक प्रदूषण और प्रतिरक्षा प्रत्यारोपण के जोखिम के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। परिभाषित पुनः संयोजक मानव लैमिनिन 521 (एलएन -521) मैट्रिक्स का उपयोग एक्सनो-फ्री और परिभाषित मीडिया फॉर्म्युलेशन के साथ में परिवर्तनशीलता को कम करता है और हायपीएस कोशिकाओं की लगातार पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। सेंडाइ वायरस (एसईवी) वेक्टर एक गैर-एकीकृत आरएनए आधारित प्रणाली है, इस प्रकार जीनोम अखंडता समेकन करने वाले वैक्टर पर संभावित विघटनकारी प्रभाव से जुड़े चिंताओं को खारिज कर सकते हैं। इसके अलावा, इन वैक्टर ने त्वचीय तंतुकोशिकाओं के पुनर्प्रक्रमण में अपेक्षाकृत उच्च दक्षता का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, कोशिकाओं के एंजाइमेटिक एकल कोशिका उत्कीर्णन ने स्टेम सीए के पर्याप्त अनुभव के बिना एचपीएस कोशिकाओं के सजातीय रखरखाव की सुविधा प्रदान कीसंस्कृति होगी यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है और प्रजननशीलता और उपयोग में आसानी पर ध्यान देने के साथ विकसित किया गया है, जिससे फाइब्रोब्लैस्ट्स से परिभाषित और एक्सनो-मुक्त मानव एचपीएस कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत और व्यावहारिक तरीका प्रदान किया गया है।

Introduction

ताकाहाशी एट अल द्वारा हायपीएस सेल लाइनों की पहली व्युत्पत्ति के बाद से 1 , 2 , हायपीएस कोशिकाओं ने बीमारी मॉडलिंग, दवा की खोज के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान किया है और पुनर्योजी औषधि 3 में सेल थेरेपी बनाने के लिए स्रोत सामग्री के रूप में। हायपीएस कोशिका संस्कृति लंबे समय तक फाइब्रोब्लास्ट फीडर कोशिकाओं 4 , 5 या मैटिगल 6 पर और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) वाले मीडिया फॉर्मूलेशन के साथ सह-संस्कृति पर निर्भर रही है। बैच-टू-बैच वेरिएंस इन संस्कृति शर्तों की अपरिभाषित प्रकृति का एक सामान्य परिणाम है, जिसके परिणामस्वरूप अप्रत्याशित रूप से भिन्नताएं होती हैं, जो इन प्रोटोकॉल 7 की अविश्वसनीयता के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता है। परिभाषित माध्यम जैसे कि आवश्यक 8 (ई 8 ) 8 और परिभाषित सेल संस्कृति मैट्रिक्स उदाहरण के लिए एलएन -521 9 , की अनुमति देंउच्च प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए और समृद्ध हायपीएस कोशिकाओं 7 , 8 , 9 , 10 की मजबूत पीढ़ी और रखरखाव में सहायता।

एकीकरण के मुक्त पुनर्रोग्राम तकनीक का विकास एक छलांग आगे है। मूल रूप से, रिप्रोग्रैमिगिंग रेट्रोवायरल वैक्टर पर निर्भर था जो जीनोमिक अखंडता 11 पर विघटनकारी प्रभावों के साथ जीनोम में बेतरतीब ढंग से एकीकृत हुआ था। रिप्रोग्रागमिंग पद्धतियों में अग्रिमों में आरएनए आधारित वैक्टर के विकास शामिल हैं। आरएनए वैक्टर के पास डीएनए आधारित रिप्रोग्रामिंग विधि पर एक फायदा है क्योंकि जीनोमिक पुनर्संयोजन के जरिए अनपेक्षित एकीकरण 12 संभव नहीं है। एसईवी वैक्टर डीएनए चरण 11 के बिना अकेले फंसे हुए आरएनए के माध्यम से बहिर्जात कारकों के उच्च और क्षणिक अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं सेव द्वारा वितरित पुनःप्रोग्रामाकरण वैक्टरसेल के विस्तार के दौरान पतला हो जाता है और अंततः संस्कृति से बहाल हो जाता है जिससे कि पुनर्रोग्रामिंग के एक पैरों के छद्म मुक्त तरीका उपलब्ध हो सके। इसके बाद, प्लुरिपोटेंसी का रखरखाव प्लुरिपोटेंसी जीन के अंतर्जात अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है 2 ।

जैसा कि अग्रणी एचईपीएस सेल आधारित चिकित्सा नैदानिक ​​परीक्षणों में बढ़ने की शुरुआत कर रहे हैं, मानकीकृत बैचों की मांग, पुनरुत्पादन और सुरक्षा 13 को संबोधित करने के लिए आवश्यक मुद्दों हैं। इसलिए, पशु उत्पत्ति के उत्पादों से बचा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ज़ीनोजेनिक उत्पादों का उपयोग गैर-हानिकारक रोगजन संदूषण के जोखिम से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, पशु व्युत्पन्न संस्कृति घटकों की उपस्थिति में सुसंस्कृत कोशिकाओं को गैर-विषम सिएलिक एसिड को कोशिका झिल्ली में शामिल करने के लिए दिखाया गया है जो व्युत्पन्न कोशिकाओं immunogenic 14 को प्रस्तुत करने की धमकी देता है। इसलिए, किसी भी भविष्य के क्लिनिकल व्यवसायों के लिए एक्सनोजेनिक उत्पादों को खत्म करने की आवश्यकता जरूरी है। यह प्रोटोकॉल Xe लागू करता हैएचपीपीएस कोशिकाओं के रखरखाव में कोई मुक्त और परिभाषित संस्कृति कोशिकाओं को नैदानिक ​​अनुपालन के करीब लेती है।

यह प्रोटोकॉल एक सुसंगत, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और आसानी से उपयोग करने वाली विधि का वर्णन करता है जो फाइब्रोब्लैस्ट से मानकीकृत हाईपीएस कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। यह स्थापित hiPS कोशिकाओं के रखरखाव के लिए उपयोगकर्ता-अनुकूल संस्कृति प्रणाली भी प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग Karolinska Institutet में स्वीडिश राष्ट्रीय मानव आईपीएस कोर सुविधा में 300 से अधिक hiPS सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए किया गया है, जिनमें से कुछ पंक्तियों को पहले 15 , 16 का वर्णन किया गया है।

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Protocol

मरीज की सामग्री और हायपीएस कोशिकाओं के संग्रह का संग्रह एथिक्स रिव्यू बोर्ड, स्टॉकहोम, 28 मार्च 2012, पंजीकरण संख्या: 2012 / 208-31 / 3 द्वारा अनुमोदित किया गया है। सेल संस्कृति कदम जैव सुरक्षा अलमारियाँ में किया जाना चाहिए जब तक अन्यथा उल्लेख नहीं किया। कोशिकाओं के साथ काम करते समय हमेशा बाँझ हैंडलिंग तकनीक का अभ्यास करें। शुरू होने से पहले कमरे, कमरे तक पहुंचने के लिए मीडिया, प्लेट और अभिकर्मकों को अनुमति दें 37 ᵒ सी में कोशिकाओं सेते हैं, उच्च आर्द्रता में 5% सीओ 2 ।

1. त्वचीय बायोप्सी से मानव फाइब्रॉलास्ट्स का अलगाव

  1. संस्कृति माध्यम की तैयारी, पाचन एंजाइम, व्यंजन और विदारक उपकरण के कोटिंग।
    1. फिब्रोब्लास्ट माध्यम तैयार करें: 44.5 एमएल इसाकोव के संशोधित डल्बेकेडो के माध्यम (आईएमडीएम), 5 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 500 μL पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेस्ट) ( तालिका 1 देखें), 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 1 मिलीग्राम / एमएल के कामकाज एकाग्रता में पाचन एंजाइम तैयार करें: वीडीएमईएम / एफ 12 + 1% पेस्ट के 4 मिलीलीटर में अलग-अलग 15-एमएल ट्यूबों में 4 मिलीग्राम डिस्पैस और कोलेजनज़ प्रकार I पाउडर के घन-पुष्पोत्पादक और भंग। एक 0.22 सुक्ष्ममापी झरनी के माध्यम से इसे पारित करके एंजाइमी समाधान का जीर्णोद्धार करें। हर बार ताजा एंजाइम समाधान तैयार करें।
    3. बायोप्सी के अनुसार 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट (या 35 मिमी टिशू कल्चर डिश) में कोट एक अच्छी तरह से 1 एमएल के फॉस्फेट बफ़ेड खारा (डीपीबीएस) में 0.1% जिलेटिन के साथ विच्छेदित है। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते
    4. विच्छेदन के लिए शल्यचिकित्सा कैंची का एक सेट और बायोप्सी के लिए संदंश आटोक्लेव करें।
  2. बायोप्सी हैंडलिंग
    नोट: लिया जाने के बाद जितनी जल्दी हो सके बायोप्सी की प्रक्रिया करें। पीबीएस + 1% पेस्ट में 48 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस तक स्टोर करें बायोप्सी आकार में व्यास में 2 - 4 मिमी और नैतिक परमिट के अनुसार होना चाहिए।
    1. 35 मिमी डिश में बायोप्सी स्थानांतरण। बायोप्सी को 35 मिमी के एक नए डिश में ले जाएं और 30 एस के लिए 2 एमएल 70% एथेनॉल में बायोप्सी को डुबो दें।
    2. बायोप्सी को एक तिहाई ले जाएं35 मिमी डिश और 1 एमएएल बाँझ हांक के बैलेंस्ड नमक समाधान (एचबीएसएस) से 1% की पेस्ट के साथ पूरक।
    3. बायोप्सी को चौथा 35-मिमी डिश में स्थानांतरित करें, ताज़ा तैयार 0.1% डिस्पोज समाधान के 1 एमएल जोड़ें।
    4. शल्य कैंची और संदंश का उपयोग करके डिश में 1 - 2 मिमी 3 टुकड़ों में त्वचा बायोप्सी काट लें और फिर 15 मिलीलीटर ट्यूब में डिस्प्रेस समाधान सहित बायोप्सी के टुकड़े को स्थानांतरित करें। अतिरिक्त 2 एमएल का प्रेषण जोड़ें।
    5. एक एमएल dispase समाधान के साथ 35 मिमी पकवान कुल्ला और 15 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
    6. बायोप्सी को 4 डिग्री सेल्सियस से रात में सेते हैं।
    7. ट्यूब में 4 मिलीलीटर 0.1% कोलेजेनेस I जोड़ें और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेवन करें।
    8. पचाने वाली कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए 300 xg अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला महाप्राणण और फाइब्रोब्लास्ट मध्यम के 2 एमएल में पचाने के लिए पुन: resuspend।
    9. 6-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट से जिलेटिन समाधान निकालें सेल-निलंबन को किसी भी शेष टुकड़े को 6-अच्छी टिशू कल्चर प्लेट (या 35-मीएम टिशू कल्चर डिश) डीपीबीएस में 0.1% जिलेटिन के साथ precoated।
    10. हर तीसरे दिन माध्यम बदलें
  3. मानव फाइब्रोब्लैस्ट्स का विस्तार
    नोट: Fibroblasts एक T25 (25 सेमी 2 ) टिशू कल्चर फ्लास्क को पारित होने के लिए तैयार हैं जब 80% संगम ( चित्रा 2 बी )। आमतौर पर 7 दिनों के भीतर फाइब्रॉलास्ट्स 80% तक पहुंच जाती हैं। हालांकि, आवश्यक समय बहुत भिन्न हो सकता है लेकिन 4 सप्ताह से अधिक नहीं होना चाहिए।
    1. मध्यम इच्छाशक्ति और डीपीबीएस के 2.5 एमएल के साथ एक बार धोएं।
    2. डीपीबीएस निकालें और ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.05%) के 1 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से कम या जब तक सेल गोल किनारों को प्रदर्शित न करें और अलग करना शुरू करें।
    3. आवश्यक होने पर 2 एमएल फाइब्रोब्लास्ट मध्यम जोड़ें, कोशिकाओं को उचित विघटन सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को कुल्ला। 3 मिनट के लिए 300 मिलीग्राम पर 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र के सेल समाधान को स्थानांतरित करें
    4. सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और सेल गोली को 5 एमएल के फाइब्रोब्लास्ट मध्यम और प्लेट फाइब्रोब्लास्ट्स में बदलेंपर-लेपित सेल टिशू कल्चर टी -25 फ्लास्क इस चरण के बाद फाइब्रोब्लैस्ट्स का विस्तार करते समय, ऊपर वर्णित के रूप में अलग करें और 12 x 10 3 कोशिकाओं / सेमी 2 के बीज को अलग करें।
    5. एक बार संगम कोशिकाओं को जमे हुए, विस्तार या प्लेट के लिए reprogramming के लिए तैयार हैं। किसी भी रिप्रोग्रैगमेटिंग को शुरू करने से पहले फ़िरोबलाब्लास्ट के दो राउंड को रुक दें (ठंड की प्रक्रिया के लिए अगले अनुभाग देखें)। रेप्रोग्रामिंग की दक्षता आमतौर पर कम दूरी के फाइब्रोब्लास्टों के लिए होती है, बीतने पर कोशिकाओं 2 - 4 इष्टतम हैं हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर 10 बीतने तक फाइब्रोब्लैस्ट्स के सफल पुनर्रोग्राममैटमेंट का आयोजन किया गया है।
  4. तंतुओं के ठंड और विगलन
    1. ताजा फाइब्रोब्लास्ट फ्रीजिंग माध्यम तैयार करें: 90% एफबीएस + 10% डाईमेथाइलसल्फॉक्साइड (डीएमएसओ)। 4 डिग्री सेल्सियस ( टेबल 1 ) पर रखें एक बार मिला हुआ, टी 25 टिशू कल्चर फ्लास्क को तीन cryovials में जमे हुए जा सकते हैं। फॉब्रोब्लास्ट फ्रीज़िंग माध्यम प्रति 500 ​​ग्राम फोम के 500 μL तैयार करें।
    2. कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए, सी को अलग करनाचरण 1.3 में वर्णित ells, एक हेमोसिटामीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें और 3 x 10 5 कोशिकाओं को 15-एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 300 xg पर स्पिन ट्यूब सतह पर तैरनेवाला Aspirate
    3. 4 ˚सी फाइब्रोब्लास्ट फ्रीजिंग माध्यम के 500 μL में क्रोनिक सेल छल्ले और क्रोनियल में स्थानांतरण। फ्रीज़िंग कंटेनर में शीशियों को रखें और कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस से 24 घंटे तक ले जाएं और उन्हें दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करने से पहले।
    4. कोशिकाओं को पिघलना, 37 डिग्री सेल्सियस पानी में cryovial के नीचे हिस्से को जलाने के लिए। द्रवीभूत होने के बाद, सेल-निलंबन को 15-एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और फाइब्रोब्लास्ट मध्यम के 5 एमएल जोड़ें। 3 मिनट के लिए 300 xg स्पिन कोशिकाओं
    5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल गोली 5 मिलीलीटर के फाइब्रोब्लास्ट मध्यम में बदलें। कोशिकाओं को गैर-लेपित T25 टिशू कल्चर फ्लास्क में ट्रांसफर करें और 37 डिग्री सेल्सियस में सेवन करें।

2. फाइब्रोब्लस्टों के एसईवी वेक्टर पुन: प्रोग्रामिंग

  1. वेक्टर अल्कोट्स की तैयारी सावधानी: जैव सुरक्षा स्तर 2 की रोकथाम के तहत एसईवी को संभाल लें। निर्माता के प्रोटोकॉल और स्थानीय दिशानिर्देश 17 को देखें बैच के बीच व्हायरस टिटर भिन्न होता है
    1. निर्माता की प्रोटोकॉल ( जैसे , CytoTune 2.0) के अनुसार, 5 x 10 4 कोशिकाओं के लिए आवश्यक वेक्टर की मात्रा की गणना करने से पहले अलिक्ट्स तैयार करने से पहले। विषाणु सामान्यतः 8 x 10 7 - 1.5 x 10 8 से भिन्न होता है पिघलना और वेक्टर्स 5: 5: 3 (कोस MOI = 5, एचसी-माइक MOI = 5 और एचकेएलएफ 4 = एमओआई 3) को संयोजित करें। 5 x 10 4 कोशिकाओं के पुनःप्रोग्राफिकिंग के लिए गणना की गई राशि को ऑटोकल्वड 1.5 एमएल ट्यूब में विभाजित किया गया। रिप्रोग्रागम के लिए 250 μL के अंतिम मात्रा में फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के साथ वायरस अल्कोहट को पतला करें।
      नोट: प्रत्येक शीशी 5 x 10 4 फाइब्रोब्लैस्ट के साथ एक 24-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के एक कूल के रिप्रोग्रामिंग के लिए मान्य है। -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरस अल्कोहल स्टोर करें
  2. सेवी वेक्टर पारगमन
    1. Aspirate सेल घनएलटीचर मध्यम और डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ धो लें। डीपीबीएस की तरक्की करें और ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.05%) के 1 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस से 5 मिनट तक सेते हैं या जब तक सेल अलग नहीं होते हैं।
    2. फाइब्रोब्लास्ट मध्यम के 2 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से खोलें और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण करें। 3 मिनट के लिए 300 xg अपकेंद्रित्र
    3. सतह पर तैरनेवाला महाप्राणु को गोली मारो और 2 एमएल फाइब्रोब्लास्ट मध्यम में गोली को फिर से खोलें।
    4. एक 24-ऊतक टिशू कल्चर प्लेट के एक कुंड में हेमोसाइटेटोमीटर और बीज 5 x 10 4 कोशिकाओं का उपयोग करके फाइब्रोब्लास्ट्स का गिनो। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात्रि में कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. सेल संस्कृति माध्यम की लहर, सेव समाधान के 250 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सेवन करें।
    6. मध्यम दैनिक ताजा फाइब्रोब्लास्ट माध्यम को बदलें। एलएन-521 लेपित प्लेटों को पारित होने से पहले ट्रांसडुस्ड सेल को 7 दिनों के लिए बढ़ने दें। पारित होने से पहले दिन एलएन -521 प्लेटें तैयार करें। कोटिंग प्रक्रिया के लिए 2.3.1 को देखें।
  3. ट्रांसडुस्ड फाइब्रोब्लास्ट्स की प्रतिलिपि
    1. एलएन-521 लेपित व्यंजन: डीएनबीबीएस में एलएएन -521 को 0.63 माइक्रोग्राम / सेमी 2 की अंतिम एकाग्रता में पतला करें। प्रति 60 एमएम टिशू कल्चर डिश के एलएन -521 समाधान के पिपेट 2 एमएल Parafilm का उपयोग कर 60 मिमी टिशू कल्चर डिश सील। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं
    2. आसान हैंडलिंग के लिए आवश्यक 8 मध्यम (ई 8) अलियंत्रकों को तैयार करें: 48.5 एमएल का ई 8 मध्यम, 1 एमएल का ई 8 पूरक और 500 μL की पीईएस ( तालिका 1 )।
    3. पारगमन के 7 दिन बाद, एलएन-521 लेपित 60 मिमी टिशू कल्चर डिश के लिए कोशिकाओं को पारित करें। ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.05%) के 250 μL जोड़ें और 5 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर या कोशिकाओं को अलग होने तक सेवन करें। 300 मी ग्रा में 3 मिनट के लिए फाइब्रोब्लास्ट मध्यम और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं के 2 एमएल जोड़ें
    4. सतह पर तैरनेवाला Aspirate हेमोसाइटेटोमीटर में 2 मिलीलीटर फाइब्रोब्लास्ट मध्यम और गिनती कोशिकाओं में गोली resuspend। एलएन -521 में 60 एमएम डिश प्रीकोएटेड में फाइब्रोब्लास्ट माध्यम के 5 मिलीलीटर में प्रीकोटेड प्लेट और बीड 4 x 10 4 कोशिकाओं से एलएन -521 समाधान का आकांक्षा करना। Rho-kinase अवरोध करनेवाला Y-27632 जोड़ें(रोक्की) 5 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता में। 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं।
    5. महत्वपूर्ण बात, अगले दिन, मध्यम माध्यम से ई 8 मध्यम बदलें। E8 मध्यम दैनिक बदलें। हायपीएस सेल कालोनियों 2-3 सप्ताह के भीतर उभर आएगी।

3. कॉलोनियों को चुनना और एचपीएस कोशिकाओं के विस्तार

नोट: स्टीयरियो माइक्रोस्कोप के तहत जैव सुरक्षा कैबिनेट के बाहर निम्नलिखित कदम उठाए गए हैं। हेयरनेट और प्रोसेसिंग मुखौटे के उपयोग की सिफारिश की जाती है। सेल संस्कृति को दूषित न करें।

  1. चुनने से पहले एलएन -521 लेपित टिशू कल्चर 24-अच्छी प्लेटें तैयार करें। डीपीबीएस में एलएन -521 को 0.63 ग्राम / सेमी 2 पतला 24-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के एक कुएं में एलएन -521 समाधान के 250 μL पिपेट पैराफिल का उपयोग कर प्लेटें सील करें 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं
    नोट: जब वे एक आकार> 1 मिमी व्यास तक पहुंच जाते हैं तो कॉलोनियों को चुनने के लिए तैयार हैं। कालोनियों को तेज किनारों को प्रदर्शित करना चाहिए और सजातीय मोनो में बढ़ना चाहिएओलेयर ( चित्रा 2 डी )
  2. एलएन -521 समाधान की आकांक्षा और एक 24-अच्छी टिशू कल्चर प्लेट के एक कुएं में 500 μL ई 8 को जोड़ना
  3. एक सेरेमोरिक्रोस्कोप के तहत एक ग्रिड की तरह स्केलपेल के साथ छोटे टुकड़ों में कॉलोनियों को काटें। यंत्रवत् रूप से डिश से सेल शीट परिमार्जन और एक 200 μL विंदुक का उपयोग तैयार शीट ( चित्रा 2 डी -2 ई ) से चादरें स्थानांतरित करें। कॉलोनियों को अलग-अलग कुएं में लें
  4. 48 घंटे के लिए माध्यम बदलते बिना कोशिकाओं को संलग्न करने दें। इसके बाद, E8 मध्यम दैनिक बदलें।
  5. जब कालोनियां> 5 मिमी के आकार तक पहुंच गए हैं, एंजाइमेटिक रूप से एक एलएएन -521 लेपित प्लेट के एक नए कुएं के रूप में एकल कक्षों के रूप में कोशिकाएं।
  6. सेल संस्कृति माध्यम की कोशिकाओं से महाप्राणण करें और 250 μL डीपीबीएस से धो लें।
  7. डीपीबीएस की तरक्की करें हदबंदी अभिकर्मक के 250 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. ध्यान दें कि कोशिकाओं को गोल करना शुरू हो गया है अलग करनाहदबंदी के साथ कोशिकाओं rinsing द्वारा प्लेट से कोशिकाओं कई बार अभिकर्मक
  9. 15 एमएल ट्यूब में 500 μL का ई 8 मध्यम जोड़ें। 300 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए ट्यूब और अपकेंद्रित्र के पृथक्करण अभिकर्मक में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें
  10. एलएन -521 के एलएन -521 समाधान को अच्छी तरह से प्रक्साइड से लुभायें और 500 μL कमरे के तापमान E8 मध्यम जोड़ें।
  11. सतह पर तैरनेवाला महाद्वीप और 500 μL ई 8 मध्यम में सेल गोली resuspend।
  12. एक हेमोसिटामीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें और 2.5 x 10 4 - 5 x 10 4 कोशिकाओं को तैयार एलएन -521 प्रीकोएट में अच्छी तरह से (1.25 x 10 4 - 2.5 x 10 4 कोशिकाओं / सेमी 2 )। सेल संस्कृति प्रारूप को आसानी से अपेक्षित उद्देश्य के अनुरूप बढ़ाया जा सकता है।
  13. रॉकिया को 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता में जोड़ें 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं
  14. E8 मध्यम दैनिक बदलें। सेल आमतौर पर 4-6 दिनों के बाद पारित होने के लिए तैयार होते हैं। उत्कीर्ण रूप से पारित कोशिकाओं के रूप में एकल कोशिकाओं के रूप में ऊपर वर्णित है जब लगभग 90% मिला हुआ है।
    नोट: रिप्रोग्राग्रेटिंग वैक्टर एचईपीएस कोशिका विस्तार के दौरान धीरे-धीरे पतला हो गए हैं और बीतने के बाद detectable नहीं है 12. कोशिकाओं जो निष्प्रभावी रूप से reprogrammed आम तौर पर बीतने 6-10 के आसपास पैदा करने के लिए या उनकी विशेषता pluripotent स्टेम कोशिका आकृति विज्ञान ( चित्रा 3 बी ) खो देते हैं।
  15. एचपीएस कोशिकाओं को ठंड और विगलन
    1. कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए, कोशिकाओं को ऊपर से बताए गए कोशिकाओं के रूप में कोशिकाएं अलग-अलग कर दें, एक हेमोसाइटोमीटर में कोशिकाओं की गिनती करें और 2.5 एम 10 कोशिकाओं को 1 एमएल के ई 8 मध्यम युक्त 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 300 मिनट में 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला Aspirate
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पीएससी क्रायोमेडिअम के 250 μL में Resuspend सेल गोली और एक cryovial हस्तांतरण। फ्रीजिंग कंटेनर में शीशी को रखें और 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस से पहले कोशिकाओं को लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करने से पहले रखें।
    3. कोशिकाओं को पिघलना करने के लिए, 24-अच्छी तरह से टिशू कल्चर के एक प्रीकोटेड एलएन -521 अच्छी तरह से तैयार करेंएलएन -521 समाधान की महत्वाकांक्षा के साथ प्लेट और 250 μL का E8 मध्यम जोड़ने 37 डिग्री सेल्सियस पानी में cryovial के नीचे हिस्से को केवल एक छोटे हिमखंड के ऊपर छोड़ दें।
    4. ईओ 8 के माध्यम से 250 μL को cryovial जोड़ें और सेल-निलंबन को 15-एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1 एमएल का ई 8 मध्यम जोड़ें। 3 मिनट के लिए 300 xg स्पिन कोशिकाओं
    5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और कमरे के तापमान E8 मध्यम के 250 μL में सेल गोली resuspend। सेल के निलंबन को तैयार अच्छी तरह से स्थानांतरित करें और 1% सेल व्यवहार्यता पूरक या 10 माइक्रोन रॉकिया जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर टिशू कल्चर प्लेट को सेते

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Representative Results

बायोप्सी से एचपीएस कोशिकाओं तक

बायोप्सी से स्थापित की गई हायपीएस कोशिकाओं की पूरी प्रक्रिया, पुनःप्रोग्रा्रामिंग वेक्टर के स्पष्ट और लक्षण वर्णन के लिए तैयार, लगभग 16 सप्ताह ( चित्रा 1 ) लेती है। चित्रा 2 ए में एक अधिक विस्तृत समयरेखा निर्दिष्ट की गई है फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की स्थापना और विस्तार करने के लिए लगभग 4 सप्ताह की आवश्यकता है पहली एचईपीएस सेल कालोनियों को तीन सप्ताह के बाद सेंडाइ वेक्टर ट्रांसडक्शन के बारे में उभरना शुरू हो गया। कालोनियों को पहले मार्ग के लिए यंत्रवत् चुना गया और फिर एंजाइमेटिक रूप से एकल कोशिकाओं के रूप में पारित किया गया।

मानव फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की स्थापना

जब मानव फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों को सामंजस्य से उगाया जाता था और स्वीकार किए जाते हैं आकारिकी प्रदर्शित किया जाता है, तो वे पहली बार विस्तारित हो जाते हैं और दो मार्गों के लिए जमे हुए होते हैंपूर्व पारगमन ( चित्रा 2 बी ) के लिए चढ़ाया जाने से पहले।

सेवी वैक्टर का उपयोग करते हुए मानव फाइब्रोब्लास्ट के पुन: प्रोग्रामिंग

कोशिका मृत्यु के स्तर में वृद्धि सेव ट्रांसडक्शन के बाद के दिनों में पाया गया और फाइब्रोब्लास्ट आकारिकी में मामूली परिवर्तन देखा गया। पहले हायपीएस कॉलोनियों का उदय दिन 12 के बाद के पारगमन ( चित्रा 2 ए , 2 सी ) से मिला था। चुनने के लिए तैयार कालोनियों के बारे में तीन से 4 सप्ताह बाद के पारगमन ( चित्रा 2 ए , 2 डी ) के बारे में उम्मीद थी। इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट राशि में सीडिंग कोशिकाओं के परिणामस्वरूप उभरते उपनिवेशों (<20) के प्रचुरता में हुई अनुकूल आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने वाले कालोनियों के चयन का अनुशंसित है। कॉलोनी में पसंदीदा सुविधाओं में शामिल कॉम्पैक्ट कोशिकाएं चपटे, समरूप मोनोलायर के रूप में विकास, अलग-अलग इंडी आसपास के फाइब्रोब्लस्ट्स ( चित्रा 2 डी ) की तरफ तेज धार वाली विडुअल कोशिकाएं हायप्स सेल कालोनियों को एक स्केलपेल और यंत्रवत् मार्ग से गुजरने वाली एक ग्रिड जैसी पैटर्न में कटौती की गई थी ( चित्रा 2 ई )। खरीदी गई एचपीएस क्लोन को प्लेट में बदलने के लिए 48 घंटे तक छोड़ दिया गया था बिना मध्यम बदलाव के। हायप्स सेल क्लोन अत्यधिक समरूप थे, हालांकि पहले दो अंश ( चित्रा 2 एफ ) के दौरान रिप्रोग्रामैमेटिंग प्लेट से उत्पन्न कुछ फाइब्रॉलास्ट्स को सहन किया गया था। उधमपुर सीमाओं और बड़े असहनीय विषम कोशिका द्रव्यमान के साथ कालोनियों को चुनना ( चित्रा 2 जी ) से बचा जाना चाहिए। एचपीएस सेल लाइनों को बड़े नाभिक-से-साइटोप्लाज्म अनुपात के साथ घने मोनोलायर्स के रूप में उगाया गया था और उन्होंने ल्यूमिनेशस की सीमाओं को परिभाषित किया था। इसके विपरीत, मिश्रित सेल आबादी की संस्कृतियों से बचने के लिए इन मानदंडों को पूरा नहीं करने वाले गैर-समरूप उपनिवेशों का पालन किया गया ( चित्रा 2 एच )।

P "fo: रख-एक साथ। Inwith-page =" 1 "> हायपीएस सेल क्लोन का सत्यापन

सीवी वेक्टर खो जाने के बाद व्युत्पन्न कोशिकाओं का प्लुरिपोटेंसी लक्षण वर्णन किया गया था और प्लूपीपोटेंट राज्य का रखरखाव अंतर्जात कारकों की अभिव्यक्ति से प्रेरित था। हायपीएस सेल सत्यापन के साथ आगे बढ़ने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि सेव वेक्टर अभिव्यक्ति खो गई है। इस प्रोटोकॉल के बाद, एसएवी वेक्टर आरएनए अब हमारे अनुभव के अनुसार 12 बीतने से नहीं खोजा गया है, इस प्रकार लक्षण वर्णन का एक उपयुक्त शुरुआती बिंदु ( चित्रा 3 ए ) प्लूटोपेन्सी मार्करों के लिए इम्युनोकायटेक्मेस्ट्री स्टैनिंग ओसीटी 4, एसएसईए 4 और नैनोजी को एक समरूप सकारात्मक परिणाम ( चित्रा 3 बी ) देना चाहिए। सेल संस्कृतियों जिसमें आंशिक रूप से पुनर्निर्मित कोशिकाएं होती हैं, जो कि प्लुरिपोटेंसी कारकों को व्यक्त नहीं करती थीं को छोड़ दिया गया था ( चित्रा 3C )। अंतर्जात pluripotency जीनों की एमआरएनए अभिव्यक्ति वास्तविक समय पीसी द्वारा दिखाया गया है चित्रा 3 डी में आर (आरटी-पीसीआर)

प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को आसानी से तीन रोगाणु परतों में अंतर करने में सक्षम होना चाहिए। हायपीएस कोशिकाओं भेदभाव की क्षमता का मूल्यांकन भ्रूण निकायों (ईबी) 18 के गठन से किया गया था। हायपीएस कोशिकाओं से उत्पन्न नि: शुल्क फ्लोटिंग ईबीएस चित्रा 3 ई और एमआरएनए एक्सप्रेशन ऑफ जीर लेयर विशिष्ट मार्करों में दिखाए गए हैं, क्योंकि ईबी भेदभाव के 21 दिनों के बाद चित्रा 3 एफ में दर्शाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1: त्वचा बायोप्सी से एचएचपीएस कोशिकाओं के प्रवाह चार्ट।
प्रोटोकॉल में प्रमुख चरणों का अवलोकन चित्रण में बायोप्सी संग्रह, फाइब्रोब्लास्ट्स का अलगाव, सेव ट्रांसडकेशन, कॉलोनियों को चुनना और एचपीएस कोशिकाओं के क्लोनल विस्तार शामिल हैं।E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: हायपीएस कोशिकाओं के निर्माण में महत्वपूर्ण कदम।
(ए) फाइब्रोब्लास्ट चढ़ाना, सेवी पारगमन, मध्यम परिवर्तन और कोटिंग्स सहित प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण समय बिंदुओं को उजागर करने वाली समयरेखा एचपीपीएस कोशिकाओं का मार्ग 12 लक्षण वर्णन प्रयोगों की शुरुआत के रूप में उजागर किया गया है। (बी) ठेठ आकारिकी के साथ संस्कृति में मिला हुआ फाइब्रोब्लैस्ट की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। (सी) ट्रांसपाइस्ड फाइब्रोब्लास्ट से एचपीएस सेल कॉलोनियों का उत्थान। (डी) कॉलिनी को तरजीही विशेषताओं को प्रदर्शित करने के लिए तैयार, कॉम्पैक्ट सेल द्रव्यमान को चपटे, आसपास के फाइब्रोब्लास्टों (मार्ग 0) की तरफ तेज किनारों के साथ अलग-अलग कोशिकाएं। (ई) हायपीएससेल कालोनियों को एक ग्रिड-समान पैटर्न में काट दिया जाता है और यंत्रवत् पारित किया जाता है । (एफ) वृद्धि के कुछ दिनों के बाद आबाद कॉलोनी अनुमोदित एचईपीएस कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग प्लेट से उत्पन्न होने वाले असामान्य रूप से उच्च संख्या वाले फाइब्रॉलास्ट्स से घिरा हुआ है। फाइब्रोब्लास्ट को प्लेट के स्क्रैप किया जा सकता है और बाद के एकल कोशिकाओं के मार्ग (मार्ग 1) के साथ सबसे अधिक संभावना गायब हो जाएगी। (जी) पूरी तरह से reprogrammed कोशिकाओं की याद ताजा नहीं आकारिकी प्रदर्शित कालोनियों; उधमस्थ सीमाओं, बड़े uncompact विषम कोशिका द्रव्यमान (एच) एक उच्च विषम सेल लाइन की तुलना में पूरी तरह से reprogrammed hiPS सेल लाइन एक प्रारंभिक बीतने के उदाहरण (एच) उज्ज्वल क्षेत्र छवि। स्केल बार 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन चित्रा 3: हायपीएस कोशिकाओं के लक्षण वर्णन
(ए) एसटीवी वेक्टर विशिष्ट मार्करों के आरटी-पीसीआर उत्परिवर्तित 3 पर एचईपीएस कोशिकाओं को पुनर्रोग्रामणिंग वैक्टरल के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। बीतने पर 12 कोशिकाओं वायरस विशिष्ट मार्करों सेंडाइ विशिष्ट रीढ़ (सेवी बी), सेंडाइ विशिष्ट केएलएफ 4 (केएलएफ 4 एसईवी), सेंडाइ विशिष्ट सीएमवाईसी (सीएमवाईसी सेवी), पीसीआर नियंत्रण (जीएपीडीएच) और कोई टेम्पलेट (-) नहीं की अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक हैं। (बी) पारगमन पर पूरी तरह से reprogrammed सजातीय हायपीएस सेल लाइन का प्रतिनिधि उदाहरण 12. हायपीएस कोशिकाओं की उज्ज्वल क्षेत्र की छवि से पता चलता है कि कोशिकाओं तंग मोनोलायरे में तेज ल्यूमिनेसिंग किनारों के साथ बढ़ती हैं और बड़े नाभिक और छोटे साइटोप्लाज्म के साथ। पारिस्थितिकी चिह्नों के ओसीटी 4, नैनोग, एसएसईए 4 और परमाणु धुंधला 4 ', 6-डायरीडिनो-2-फेनिलंडोल (डीएपीआई) की एकरूपता सकारात्मक अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हुए इम्योनोसाइटोकेमिस्ट्री धुंधला हो जाना (सी) सेल लाइन, प्लुरिपोटेंसी मार्कर नैनोग के लिए विषम अभिव्यक्ति का प्रदर्शन। सांस्कृतिकई में आंशिक रूप से रिप्रोग्रॉम्ड कोशिकाएं शामिल हैं और उन्हें छोड़ा जाना चाहिए। (डी) प्लानिपोटेंसी मार्करों की एमआरएनए अभिव्यक्ति के आरटी-पीसीआर, नैनोग, ओसीटी 4, पीसीआर नियंत्रण (जीएपीडीएच) और कोई टेम्पलेट (-), प्लूरीपीटेंसी मार्कर की अभिव्यक्ति का संकेत नहीं है। (ई) हायपीएस कोशिकाओं से उत्पन्न नि: शुल्क फ्लोटिंग भ्रूण निकाय। (एफ) आरटी-पीसीआर के 21 दिनों के भ्रूण शरीर भेदभाव शो के बाद से उत्पन्न हायपीएस कोशिकाओं तीन रोगाणु परतों के लिए भेद करने में सक्षम हैं। एन्डोडर्मल मार्केटर्स एएफपी और जीएटीए 4, एमएसोडर्माल मार्कर आरएनएक्स और एचडी 1, एक्टोडर्मल मार्कर एनसीएएम और नेस्टिन, पीसीआर नियंत्रण (जीएपीडीएच) और कोई टेम्पलेट (-) नहीं है। स्केल बार 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का अपेक्षित परिणाम कई क्लोनली व्युत्पन्न हायपीएस सेल लाइनों की सफल पीढ़ी है। महत्वपूर्ण रूप से, यहां वर्णित स्थापित hiPS कोशिकाओं के रखरखाव और विस्तार के लिए विधि विश्वसनीय है और स्टेम सेल संस्कृति के कुछ पहले अनुभव के साथ किया जा सकता है। रोक्की के साथ एलजी -521 मैट्रिक्स के साथ एंजाइमेटिक सिंगल सेल पेसिजिंग को कोशिकीय रूप से सामान्य, प्लुपीप्रोटेंट और आसानी से सक्षम होने के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए जाना जाता है जबकि प्रेरित विविधता से बचने के लिए कॉलोनी आधारित उत्प्रवासन 10 , 1 9 , 20 को उत्तेजित कर सकता है। एलओएन -521 पर संवर्धित एचईपीएस कोशिकाओं को रॉकिया 10 के अलावा बिना एकल कक्षों के रूप में पास किया जा सकता है, रॉकिया के अलावा कम अनुभवी संचालकों के लिए प्रोटोकॉल को आसान बनाते हैं और हायपीएस सेल व्युत्पत्ति के लिए आवश्यक समय कम कर देता है।

पुन: प्रोग्रामिंग दक्षता जीई हैइस प्रोटोकॉल के साथ एक मुद्दा नहीं है; सेवी वैक्टर अपेक्षाकृत उच्च रिप्रोग्रामिंग क्षमता है- 1% फाइब्रॉब्लस्ट 11 के लिए कॉलोनियों (<20) की बहुतायत के उदय की उम्मीद है इसके लिए आवश्यक कालोनियों की संख्या में तीन गुणा लेने की सिफारिश की गई है। यह देखा गया है कि चुने गए क्लोनों का एक हिस्सा चुनने के बाद का पालन करने में विफल रहता है। आंशिक रूप से पुनर्निर्मित कालोनियों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त कॉलोनियों की भी आवश्यकता हो सकती है। आंशिक रूप से पुनर्निर्मित कालोनियां कुछ मामलों में हैं जो सीवी वैक्टर द्वारा पुलिपोटेंसी जीन के एक्सोजेन्सिव अभिव्यक्ति का समर्थन करते हैं। जैसे सेवी वैक्टर पतला हो जाते हैं, ये कोशिकाएं फैलाना और अलग हो जाती हैं, आम तौर पर 6-8 के पार के आसपास स्पष्ट होती हैं। संस्कृति की विविधता भी आंशिक reprogramming का संकेत है और विषम लाइनों को खारिज किया जाना चाहिए ( चित्रा 2 एच )।

रिप्रोग्रागमिंग वेक्टर और संस्कृति की स्थिति का इष्टतम विकल्प इस पर निर्भर हैउत्पन्न कोशिकाओं का उद्देश्य हालांकि, परिणामों को प्रभावित करने वाले बैच-टू-बैच संस्करणों से बचने के लिए, परिभाषित स्थितियों की सिफारिश की जाती है। एक गैर-समेकनशील वेक्टर तंत्र की पसंद का सुझाव है कि पुनप्रोग्रामित कोशिकाओं की जीनोमिक अखंडता को संरक्षित किया जाए। आवश्यक समय पर मजबूती, अपेक्षाकृत उच्च दक्षता और कम हाथ की वजह से इस प्रोटोकॉल में सेवी वैक्टर का चयन किया गया था। सेल डिवीजनों के दौरान सेव वैक्टर को पतला किया जाता है और 12 बीतने के आसपास का पता नहीं लगाया जाता है, इस प्रकार यह सुनिश्चित करता है कि जनरेटेड डेटा एक्सजेन्सिव अभिव्यक्ति से प्रभावित नहीं है। क्लिनिक प्रयोजनों के लिए तैयार कोशिकाओं पर सावधानीपूर्वक मांगों की वजह से, सभी वेक्टर सामग्री के पूरे शेडिंग को साबित करने के बाद सेवी रिप्रोग्रामिंग नैदानिक ​​अनुवाद के लिए एक बाधा हो सकती है। सेल उपचार 12 में इरादा उपयोग के साथ कोशिकाओं को प्राप्त अगर mRNA मध्यस्थता reprogramming लाभप्रद हो सकता है इन विधियों में 21 श्रम गहन और अधिक जटिल हैं, लेकिन 21 का उपयोग करने के लिए। यहां विधिफाइब्रोब्लास्ट संस्कृति के लिए लिखा हुआ भी नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए अनुपयुक्त है। चूंकि दोनों एफबीएस और जिलेटिन एक्सऑोजेनिक और अपरिभाषित हैं, इन्हें परिभाषित एक्सनो-फ्री उत्पादों 22 पर स्विच करने पर विचार करें।

सेल संस्कृति के किसी भी रूप में काम करते समय बाँझ हैंडलिंग तकनीक और नियमित माइकोप्लाज्मा संक्रमण परीक्षण की सिफारिश की जाती है। मानव त्वचा में कई सूक्ष्मजीव होते हैं जो परिस्थितियों में कामयाब हो सकते हैं यदि ठीक ढंग से नियंत्रित नहीं किए जाने पर कोशिकाओं में सुसंस्कृत होते हैं। इसलिए बायोप्सी की त्वचा को संभालने में अतिरिक्त सतर्क रहने की सिफारिश की गई है और बायोप्सी प्रोसेसिंग के बाद संस्कृति के पहले दिनों के दौरान। त्वचा बायोप्सी से फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की स्थापना वास्तव में, एक समय लेने वाली प्रक्रिया है त्वचा बायोप्सी को संसाधित करने के बाद, शुरू में फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के कमज़ोर लक्षणों का पालन करना होगा, इस प्रकार संस्कृति में अपेक्षित आकारिकी प्रदर्शित करने वाले कुछ फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को खोजने के लिए कम से कम एक सप्ताह प्रतीक्षा करें। फाइब्रोब्लास्ट्स की स्थापना के लिए आवश्यक समयबायोप्सी से इन विट्रो संस्कृतियों में विभिन्न प्रकार के कारकों पर निर्भर है, जिसमें बायोप्सी का आकार, दाता की उम्र और बायोप्सी को संभालने के बाद से इसे कैसे संभाला गया है। इष्टतम रिप्रोग्रागमिंग दक्षता 23 के लिए शुरुआती बीतने वाले फाइब्रोब्लास्टों को पुनःप्रसार करना पसंद किया जाता है।

संक्षेप में, हम यहां अत्यधिक समरूप एचईपीएस कोशिकाओं के निर्माण के लिए एक स्थापित मजबूत और आसानी से उपयोग की विधि का वर्णन करते हैं।

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Disclosures

लेखकों को रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई विरोध नहीं है

Acknowledgments

यह काम एसएसएफ़ (बी 13 -0074) और विनोवा (2016-04134) फंडिंग एजेंटों द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 125 मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल रेप्रोग्रामिंग सेंडाइ वायरस वेक्टर फाइब्रोब्लास्ट्स एक्सो-फ्री केमिकली डिफाइन्ड रीकॉंबिनेंट मानव लैमिनिन 521
लाइमिनिन 521 मैट्रिक्स का उपयोग करने वाले मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का एकीकरण फ्री डेरीवेशन
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Uhlin, E., Marin Navarro, A.,… More

Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

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