Summary
Robust avledning av humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPS) -celler uppnåddes genom att icke-integrera Sendai-virus (SeV) -vektor-medierad omprogrammering av dermala fibroblaster uppnåddes. HiPS-cellunderhåll och klonal expansion utfördes med användning av xenofria och kemiskt definierade odlingsbetingelser med rekombinant human laminin 521 (LN-521) matris och essentiell E8 (E8) -medium.
Abstract
Xenofria och fullständigt definierade betingelser är nyckelparametrar för robust och reproducerbar generation av homogena humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPS) celler. Underhåll av hiPS-celler på matarceller eller odefinierade matriser är mottagliga för batchvariationer, patogen kontaminering och risk för immunogenicitet. Genom att utnyttja den definierade rekombinanta humana laminin 521 (LN-521) matrisen i kombination med xenofria och definierade medieformuleringar reducerar variabiliteten och möjliggör konsekvent generation av hiPS-celler. Sendai-viruset (SeV) -vektorn är ett icke-integrerande RNA-baserat system, varigenom omständigheter som förknippas med den potentiella störande effekten på genomintegritet integrationsvektorer kan ha. Vidare har dessa vektorer visat relativt hög effektivitet vid omprogrammeringen av dermala fibroblaster. Dessutom underlättar enzymatisk cellcellerpassage av celler homogent underhåll av hiPS-celler utan betydande tidigare erfarenhet av stamcellerLl kultur. Här beskrivs ett protokoll som har testats omfattande och utvecklats med fokus på reproducerbarhet och användarvänlighet, vilket ger ett robust och praktiskt sätt att generera definierade och xenofria humana hiPS-celler från fibroblaster.
Introduction
Sedan den första avledningen av hiPS-cellinjer av Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-celler har tillhandahållit ett användbart verktyg för sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och som källmaterial för att generera cellterapier i regenerativ medicin 3 . HiPS-cellodling har länge varit beroende av samkultur med fibroblastmatarceller 4 , 5 eller på Matrigel 6 och med medieformuleringar innehållande fetalt bovint serum (FBS). Batch-to-batch-variationer är en vanlig följd av de odefinierade egenskaperna hos dessa odlingsförhållanden, vilket resulterar i oförutsägbara variationer, vilket är en viktig bidragande till otillförlitligheten av dessa protokoll 7 . Utvecklingen av definierat medium, såsom essentiella 8 (E8) 8 och definierade cellodlingsmatriser, exempelvis LN-521 9 , tillåterS för upprättandet av höggradigt reproducerbara protokoll och stöd i den robusta generationen och upprätthållandet av homogena hiPS-celler 7 , 8 , 9 , 10 .
Utveckling av integrationsfri omprogrammeringsteknik har varit ett steg framåt. Ursprungligen var omprogrammeringen beroende av retrovirala vektorer som slumpmässigt integrerades i genomet med störande effekter på genomisk integritet 11 . Förskott i omprogrammeringsmetoder innefattar utveckling av RNA-baserade vektorer. RNA-vektorer har en fördel jämfört med den DNA-baserade omprogrammeringsmetoden eftersom oavsiktlig integration genom genomisk rekombination inte är möjlig 12 . SeV-vektorer tillhandahåller högt och övergående uttryck av exogena faktorer genom enkelsträngad RNA utan en DNA-fas 11 . De omprogrammerande vektorerna som levereras av SeVSpädas ut genom cellexpansion och slutligen skjulas från kulturen, vilket ger ett fotoprintsfritt sätt att omprogrammera. Därefter är underhåll av pluripoten beroende av endogent uttryck av pluripotensgenerna 2 .
Som banbrytande hiPS-cellbaserade terapier börjar inflyta i kliniska prövningar är kraven på standardiserade partier, reproducerbarhet och säkerhet viktiga frågor för att ta itu med 13 . Därför bör produkter av animaliskt ursprung undvikas. Till exempel har användningen av xenogena produkter associerats med risk för icke-humant patogenförorening. Celler som odlats i närvaro av animaliska härledda odlingskomponenter har också visat sig inkorporera icke-humana silikasyror i cellmembran som hotar att göra härledda celler immunogena 14 . Därför är behovet av att eliminera xenogena produkter nödvändigt för framtida kliniska sysslor. Detta protokoll gäller xeIngen fri och definierad kultur vid underhållet av hiPS-celler flyttar celler närmare klinisk överensstämmelse.
Detta protokoll beskriver en konsekvent, mycket reproducerbar och lättanvänd metod som genererar standardiserade hiPS-celler från fibroblaster. Det erbjuder också ett användarvänligt kultursystem för underhåll av etablerade HiPS-celler. Detta protokoll har använts för att härleda mer än 300 hiPS-cellinjer i den svenska nationella mänskliga iPS Core-anläggningen vid Karolinska Institutet, av vilka några linjer tidigare har beskrivits 15 , 16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samlingen av patientmaterial och derivat av hiPS-celler godkändes av Etikgranskningsrådet, Stockholm den 28 mars 2012, Registreringsnummer: 2012 / 208-31 / 3. Cellodlingssteg bör utföras i biosäkerhetsskåp om inte annat nämns. Använd alltid sterila hanteringstekniker när du arbetar med celler. Låt media, plattor och reagenser nå rumstemperatur innan de startas. Inkubera celler vid 37 ° C, 5% CO2 i hög luftfuktighet.
1. Isolering av humana fibroblaster från dermal biopsi
- Preparat av odlingsmedium, matsmältningsenzymer, beläggning av rätter och dissekeringsverktyg.
- Förbered Fibroblast-medium: 44,5 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 5 ml fetalt bovint serum (FBS) och 500 μL penicillin / streptomycin (PEST) (se tabell 1 ), förvaras vid 4 ° C.
- Förbered digestiva enzymer vid en arbetskoncentration på 1 mg / ml: weiGh alikvoter av 4 mg avskiljnings- och kollagenas typ I-pulver i separata 15 ml rör och lösa upp i 4 ml DMEM / F12 + 1% PEST. Sterilisera den enzymatiska lösningen genom att passera den genom en 0,22 μm sil. Beredda fria enzymlösningar varje gång.
- Coat en brunn i en 6-brunns vävnadskulturplatta (eller 35 mm vävnadskulturskål) per biopsi dissekerad med 1 ml 0,1% gelatin i fosfatbuffrad saltlösning (DPBS). Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Autoklaver en uppsättning kirurgiska saxar och tångar per biopsi för dissektion.
- Biopsi-hantering
OBS! Process biopsier så fort som möjligt efter att ha tagits. Förvara i PBS + 1% PEST i upp till 48 timmar vid 4 ° C. Biopsi bör vara 2 - 4 mm i diameter i storlek och i enlighet med etiska tillstånd.- Överför biopsi till en 35 mm skål. Flytta biopsi till en ny 35 mm skål och sänk biopsin i 2 ml 70% etanol i 30 s.
- Flytta biopsi till en tredjedel35 mm skål och tvätta med 1 ml steril Hank Balanced Salt Solution (HBSS) kompletterat med 1% PEST.
- Överför biopsi till en fjärde 35 mm skål, tillsätt 1 ml nyberedd 0,1% dispaslösning.
- Skär huden biopsi i 1 - 2 mm 3 bitar i skålen med hjälp av kirurgiska saxar och tångar och sedan överföra biopsi bitar inklusive dispas lösningen i ett 15 ml rör. Tillsätt ytterligare 2 ml dispas.
- Skölj 35 mm skålen med en 1 ml dispaslösning och överför till 15 ml röret.
- Inkubera biopsi vid 4 ° C över natten.
- Tillsätt 4 ml 0,1% kollagenas I till röret och inkubera vid 37 ° C i 4 timmar.
- Centrifugera de digererade cellerna 300 xg under 3 minuter, aspirera supernatanten och resuspendera digereringen i 2 ml fibroblastmedium.
- Ta bort gelatinlösningen från vävnadsodlingsplattan med 6 brunnar. Överför cellsuspensionen inklusive eventuella kvarvarande bitar till 6-brunns vävnadsodlingsplatta (eller 35-mM vävnadskulturskål) precoated med 0,1% gelatin i DPBS.
- Byt medium på tredje dag.
- Expansion av humana fibroblaster
OBS: Fibroblaster är klara att passera till en T25 (25 cm 2 ) vävnadsodlingskolv när 80% sammanflyttas ( Figur 2B ). Fibroblaster når vanligen 80% konfluens inom 7 dagar. Den tid som krävs kan dock variera kraftigt men bör inte vara längre än 4 veckor.- Aspirera medium och tvätta en gång med 2,5 ml DPBS.
- Ta bort DPBS och tillsätt 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%) och inkubera vid 37 ° C i 5 minuter eller tills cellerna visar avrundade kanter och börja lossna.
- Tillsätt 2 ml fibroblastmedium, skölj om nödvändigt cellerna, vilket säkerställer korrekt disassociation av celler. Överför celllösningen till ett 15 ml rör och centrifugera vid 300 xg under 3 minuter.
- Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5 ml fibroblastmedium och platta fibroblaster i enT25-kolv på cellbeläggd cellvävnadskultur. När expanderar fibroblaster efter detta steg dissocieras som beskrivet ovan och frö 12 x 10 ^ celler / cm2.
- När konfluenta celler är redo att frysas, expandera eller plåta för omprogrammering. Frys ner två omgångar fibroblast innan någon omprogrammering påbörjas (se nästa avsnitt för frysningsproceduren). Programmeringseffektivitet är generellt högre för fibroblaster med lägre passager, celler vid passage 2-4 är optimala. Emellertid har framgångsrikt omprogrammering av fibroblaster upp till passage 10 utförts med användning av detta protokoll.
- Frysning och upptining av fibroblaster
- Förbered färskt fibroblastfrysmedium: 90% FBS + 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Förvara vid 4 ° C ( Tabell 1 ). När det är konfluent, kan T25-vävnadsodlingskolven frysas in i tre cryovials. Förbered 500 μl fibroblastfrysmedium per injektionsflaska fryst.
- För att frysa celler dissocierar cElls som beskrivs i steg 1.3, räkna celler med hjälp av en hemocytometer och överför portioner av 3 x 10 5 celler till 15 ml rör. Spinrör vid 300 xg i 3 min. Aspirera supernatant.
- Resuspendera cellpellets i 500 μl 4 ˚C fibroblastfrysmedium och överföra till cryovials. Placera flaskorna i en frysbehållare och inkubera celler vid -80 ° C i 24 timmar innan de överförs till flytande kväve för långvarig lagring.
- För att tina cellerna, nedsänk ner botten av cryovialen i 37 ° C vatten. När en gång är flytande, överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör och tillsätt 5 ml fibroblastmedium. Spinceller 300 xg i 3 min.
- Ta bort supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5 ml fibroblastmedium. Överför celler till en icke-belagd T25 vävnadsodlingskolv och inkubera i 37 ° C.
2. SeV Vector Reprogramming of Fibroblasts
- Framställning av vektoralikvoter FÖRSIKTIGT: Hantera SeV under biosäkerhetsnivå 2-inneslutning. Se tillverkarens protokoll och lokala riktlinjer 17 . Virustiter varierar mellan satser.
- Innan beredning alikvoter beräkna mängden vektor som behövs för 5 x 10 4 celler enligt tillverkarens protokoll ( t.ex. CytoTune 2.0). Virustitern varierar i allmänhet från 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Tina och kombinera vektorer 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 och hKlf4 = MOI 3). Dela den mängd som beräknats för omprogrammeringen av 5 x 10 ^ celler i autoklaverade 1,5 ml rör. Fortynda virusalikvoter med fibroblastmedium till en slutlig volym av 250 pl för omprogrammering.
OBS! Varje injektionsflaska gäller för omprogrammering av en brunn i en 24-brunns vävnadskulturplatta med 5 x 10 4 fibroblaster. Förvara virusalikvoter vid -80 ° C.
- Innan beredning alikvoter beräkna mängden vektor som behövs för 5 x 10 4 celler enligt tillverkarens protokoll ( t.ex. CytoTune 2.0). Virustitern varierar i allmänhet från 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Tina och kombinera vektorer 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 och hKlf4 = MOI 3). Dela den mängd som beräknats för omprogrammeringen av 5 x 10 ^ celler i autoklaverade 1,5 ml rör. Fortynda virusalikvoter med fibroblastmedium till en slutlig volym av 250 pl för omprogrammering.
- SeV Vector transduktion
- Aspiratcell cuMedium och tvättas med 1 ml DPBS. Aspirera DPBS och tillsätt 1 ml trypsin-EDTA (0,05%). Inkubera vid 37 ° C i 5 minuter eller tills cellerna lossnar.
- Tillsätt 2 ml fibroblastmedium och resuspendera cellerna och överföra till ett 15 ml rör. Centrifugera 300 xg i 3 min.
- Aspirera supernatanten och resuspendera pelleten i 2 ml fibroblastmedium.
- Räkna fibroblaster med hjälp av en hemocytometer och frö 5 x 104 celler i en brunn i en 24-brunns vävnadsodlingsplatta. Inkubera celler vid 37 ° C över natten.
- Aspirationscell odlingsmedium, tillsätt 250 xl av SeV-lösningen och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Byt medium dagligen till färskt fibroblastmedium. Låt transducerade celler växa i 7 dagar innan de passeras till LN-521-belagda plattor. Förbered LN-521 plattor dagen före passage. Se 2.3.1 för beläggningsproceduren.
- Replatering av transducerade fibroblaster
- Framställning av LN-521 belagda rätter: Späd LN-521 i DPBS till en slutlig koncentration av 0,63 μg / cm2. Pipettera 2 ml av LN-521-lösningen per 60 mm vävnadskulturskål. Tät 60-mm vävnadskulturskålen med parafilm. Inkubera över natten vid 4 ° C.
- Förbered viktiga 8 medium (E8) alikvoter för lättare hantering: 48,5 ml E8-medium, 1 ml E8-tillskott och 500 | il PEST ( Tabell 1 ).
- 7 dagar efter transduktion passerar cellerna till en LN-521-belagd 60 mm vävnadskulturskål. Tillsätt 250 μL trypsin-EDTA (0,05%) och inkubera vid 37 ° C under 5 minuter eller tills cellerna har lossnat. Tillsätt 2 ml fibroblast-medium och centrifugceller i 3 minuter vid 300 x g.
- Aspirera supernatanten. Resuspendera pelleten i 2 ml fibroblastmedium och räkna celler i en hemocytometer. Aspirera LN-521-lösning från den förhärdade plattan och frö 4 x 10 4 celler i 5 ml fibroblastmedium i LN-521-förhärdad 60 mm skål. Tillsätt Rho-kinashämmare Y-27632(ROCKi) till en slutlig koncentration av 5 | im. Inkubera i 37 ° C över natten.
- Viktigt, nästa dag, byt medium till E8-medium. Byt E8-medium dagligen. HiPS-cellkolonier kommer att dyka upp inom 2 - 3 veckor.
3. Plockning av kolonier och expansion av hiPS-celler
OBS! Följande steg utförs utanför biosäkerhetskåpan under ett stereomikroskop. Användning av hårnät och procedursmask rekommenderas. Arbeta noggrant, för att inte förorena cellodlingen.
- Förbered LN-521-belagda vävnadsodling 24-brunnsplattor dagen före plockning. Späd LN-521 i DPBS 0,63 μg / cm2. Pipettera 250 μl av LN-521-lösningen i en brunn i en vävnadsodlingsplatta med 24 brunnar. Tätningsplattor med parafilm. Inkubera över natten vid 4 ° C.
OBS! Kolonierna är redo att plockas när de når en storlek> 1 mm i diameter. Kolonier bör visa skarpa kanter och växa i homogen monOlayers ( Figur 2D ). - Aspirera LN-521-lösningen och sätt 500 μL E8 i en brunn i en vävnadskulturplatta med 24 brunnar.
- Klipp kolonier i mindre bitar med en skalpell i ett galler som ett mönster under ett stereomikroskop. Skrapa cellskivorna mekaniskt från skålen och överför arken med en 200 μL pipett till den beredda brunnen ( Figur 2D -2E ). Välj kolonier i separata brunnar.
- Låt celler bifoga utan att byta medium i 48 timmar. Därefter byt E8-medium dagligen.
- När kolonierna har nått en storlek av> 5 mm, passerar enzymatiskt celler som enskilda celler till en ny brunn av en LN-521-belagd platta.
- Aspirera cellodlingsmediet från celler och tvätta med 250 pl DPBS.
- Aspirera DPBS. Tillsätt 250 μl dissociationsreagens och inkubera i 3 minuter vid 37 ° C.
- Observera att cellerna har börjat runda upp. LösgöraCeller från plattan genom att skölja cellerna med dissociationsreagens några gånger.
- Tillsätt 500 μl E8-medium till ett 15 ml rör. Överför cellerna i dissociationsreagenset till röret och centrifugera i 3 minuter vid 300 x g.
- Aspirera LN-521-lösningen från LN-521 för-belagd brunn och tillsätt 500 μL rumstemperatur E8-medium.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 500 | il E8-medium.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och frö 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 celler i den beredda LN-521 förbehandlade brunnen (1,25 x 10 4 - 2,5 x 10 4 celler / cm 2 ). Cellkulturformat kan enkelt uppskalas för att passa det avsedda ändamålet.
- Tillsätt ROCKi till en slutlig koncentration av 10 μM. Inkubera celler vid 37 ° C.
- Byt E8-medium dagligen. Celler är vanligtvis redo att passera efter 4 - 6 dagar. Enzymatiskt passerar celler som enskilda celler som beskrivits ovan när de är omkring 90% konfluenta.
OBS: Omprogrammeringsvektorerna späds gradvis under hiPS-cellexpansion och kan inte detekteras efter passage 12. Cellar som är opartiskt omprogrammerade upphör ofta att proliferera runt passage 6-10 eller förlora sin karakteristiska pluripotenta stamcellsmorfologi ( Figur 3B ). - Frysning och upptining av hiPS-celler
- För att frysa celler, dissocierar enzymatiskt celler som enskilda celler som beskrivits ovan, räknar cellerna i en hemocytometer och överför 2,5 x 10 5 celler till ett 15 ml rör innehållande 1 ml E8-medium. Centrifugera vid 300 xg under 3 min. Aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 250 | il 4 ° C PSC-kryomedium och överföra till en cryovial. Placera flaskan i en frysbehållare och inkubera celler vid -80 ° C i 24 timmar innan de överförs till flytande kväve för långvarig lagring.
- För att tina celler, bereda en förbelagd LN-521 brunn i en 24-brunns vävnadskulturPlattan genom att aspirera LN-521-lösningen och tillsätta 250 | il E8-medium. Dunk botten av cryovialen i 37 ° C vatten tills endast en liten isblod kvarstår.
- Tillsätt 250 μl E8-medium till cryovialen och överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör och tillsätt 1 ml E8-medium. Spinceller 300 xg i 3 min.
- Ta bort supernatanten och resuspendera cellpelleten i 250 μl rumstemperatur E8-medium. Överför cellsuspensionen till den beredda brunnen och tillsätt av 1% celllevbarhetstillägg eller 10 μM ROCKi. Inkuber vävnadsodlingsplattan vid 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Från biopsi till hiPS-celler
Hela processen från biopsi till etablerade hiPS-celler, avlägsna omprogrammeringsvektor och redo för karaktärisering, tar ungefär 16 veckor ( Figur 1 ). En mer detaljerad tidslinje anges i figur 2A . Cirka 4 veckor behövs för att etablera och expandera fibroblastkulturer. De första hiPS-cellkolonierna började uppstå omkring tre veckor efter Sendai-vektortransduktion. Kolonier plockades mekaniskt för första passagen och passerade sedan enzymatiskt som enskilda celler.
Etablering av humana fibroblastkulturer
När de mänskliga fibroblastkulturerna hade vuxit till konfluens och visade accepterad morfologi förstärktes de först och frystes för två passagerS innan de pläteras för transduktion ( Figur 2B ).
Omprogrammering av humana fibroblaster med användning av SeV-vektorer
Ökad nivå av celldöd hittades i dagarna efter SeV-transduktion och små förändringar i fibroblastmorfologi observerades. Uppkomsten av de första hiPS-kolonierna detekterades från dag 12 efter transduktion ( Figur 2A , 2C ). Kolonier som är redo att plockas förväntades omkring tre till 4 veckor efter transduktion ( Figur 2A , 2D ). Seedceller i de mängder som anges i detta protokoll resulterade i ett överflöd av kolonier som växte fram (<20). Selektiv plockning av kolonier som visar gynnsam morfologi rekommenderas. Kolonien har föredragna inkluderade plana kompakta celler, tillväxt som homogena monolager, särskiljbar indi Viduala celler med skarp kant mot omgivande fibroblaster ( Figur 2D ). HiPS-cellkolonierna skars i ett gallerliknande mönster med användning av en skalpell och mekaniskt passagen ( Figur 2E ). Plockade hiPS-kloner lämnades i 48 timmar för att vidhäfta plattan utan mediumförändring. HiPS-cellkloner var mycket homogena, men få fibroblaster som härrör från omprogrammeringsplattan tolererades under de två första passagerna ( Figur 2F ). Plockning av kolonier med noga gränser och stor okompakt heterogen cellmassa bör undvikas ( figur 2G ). Erhållna hiPS-cellinjer växte som täta monolager med stort kärna-till-cytoplasmförhållande och hade definierat luminescerande gränser. I motsats härtill kasserade vidhäftande icke-homogena kolonier som inte uppfyllde dessa kriterier ( Figur 2H ) för att undvika kulturer av blandade cellpopulationer.
P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Validering av hiPS-cellklonerPluripotenskarakterisering av härledda celler utfördes efter det att SeV-vektorn förlorades och upprätthållandet av pluripotenta tillståndet drivs av uttrycket av endogena faktorer. Innan du fortsätter med hiPS-cellvalidering, se till att SeV-vektoruttrycket har gått vilse. Efter detta protokoll är SeV-vektor-RNA inte längre detekterbart genom passage 12 enligt vår erfarenhet, vilket är en lämplig utgångspunkt för karakterisering ( Figur 3A ). Immunocytokemi färgning för pluripotensmarkörer OCT4, SSEA4 och NANOG bör ge ett homogent positivt resultat ( Figur 3B ). Cellkulturer innehållande delvis omprogrammerade celler som inte uttryckte pluripotensfaktorer kassades ( Figur 3C ). MRNA-uttryck av endogena pluripotensgener visas av realtids-PC R (RT-PCR) i Figur 3D .
Pluripotenta stamceller bör lätt kunna skilja sig i de tre bakterielagren. HiPS-cellens differentieringspotential bedömdes genom bildning av embryoidkroppar (EB) 18 . Fria flytande EBs genererade från hiPS-celler visas i Figur 3E och mRNA-uttryck av kimskiktspecifika markörer efter 21 dagar av EB-differentiering representeras i Figur 3F .
Figur 1: Flödesschema från hudbiopsi till hiPS-celler.
Översikt över nyckelstegen i protokollet. Illustrationen innefattar biopsi-insamling, isolering av fibroblaster, SeV-transduktion, plockning av kolonier och klonal expansion av hiPS-celler.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kritiska steg vid generering av hiPS-celler.
(A) Tidslinje som markerar viktiga tidpunkter i protokollet inklusive fibroblastplating, SeV-transduktion, mediumförändringar och beläggningar. Passage 12 av hiPS-celler markeras som början av karaktäriseringsexperiment. (B) Ljusfältbild av konfluenta fibroblaster i kultur med typisk morfologi. (C) Uppkomst av hiPS-cellkolonier från transducerade fibroblaster. (D) Klar för att välja koloni som visar förmånsfunktioner, utplattad kompakt cellmassa, urskiljbara individuella celler med skarpa kanter mot omgivande fibroblaster (Passage 0). (E) hiPSCellkolonier skärs i ett gallerliknande mönster och passerar mekaniskt . (F) Adhered koloni efter några dagar av tillväxt. De vidhäftande hiPS-cellerna omges av ett ovanligt stort antal fibroblaster som härrör från omprogrammeringsplattan. Fibroblasterna kan skrapas av plattan och kommer sannolikt att försvinnas med efterföljande enskilda celler passager (Passage 1). (G) Kolonier som visar morfologi inte påminner om helt omprogrammerade celler; Krångliga gränser, stor okompakt heterogen cellmassa. (H) Ljusfältbild som exemplifierar en tidig passage homogen fullständigt omprogrammerad hiPS-celllinje jämfört med en starkt heterogen celllinje. Skalstänger indikerar 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av hiPS-celler.
(A) RT-PCR av SeV-vektorspecifika markörer. HiPS-celler vid passage 3 används som positiv kontroll för omprogrammeringsvektorerna l. Vid passage 12 är celler negativa för uttryck av virusspecifika markörer Sendai-specifik ryggrad (SeV B), Sendai-specifik KLF4 (KLF4 SeV), Sendai-specifik cMYC (cMYC SeV), PCR-kontroll (GAPDH) och ingen mall (-). (B) Representativt exempel på fullständigt omprogrammerad homogen hiPS celllinje vid passage 12. Ljusfältbild av hiPS-celler avslöjar celler växer i täta monolager med skarpa luminescerande kanter och med stora kärnor och liten cytoplasma. Immunocytokemifärgning av pluripotensmarkörer OCT4, NANOG, SSEA4 och kärnfärgning 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) som demonstrerar homogent positivt uttryck. (C) Cellinje uppvisar heterogent uttryck för pluripotensmarkör NANOG. KulturenE innehåller delvis omprogrammerade celler och bör kasseras. (D) RT-PCR av mRNA-uttryck av pluripotensmarkörer NANOG, OCT4, PCR-kontroll (GAPDH) och ingen mall (-) som indikerar uttrycket av pluripotensmarkörer. (E) Fritt flytande embryoidkroppar genererade från hiPS-celler. (F) RT-PCR efter 21 dygn med embryoidkroppsdifferentiering visar att härledda hiPS-celler kan differentiera de tre bakterielagren. Endodermala markörer AFP och GATA4, mesodermala markörer RUNX och HAND1, ektodermala markörer NCAM och NESTIN, PCR-kontroll (GAPDH) och ingen mall (-). Skalstänger indikerar 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det förväntade resultatet av detta protokoll är den framgångsrika generationen av flera klonalt härledda hiPS-cellinjer. Viktigt är att metoden för underhåll och expansion av etablerade hiPS-celler som beskrivs här är pålitlig och kan utföras med liten tidigare erfarenhet av stamcellerkulturen. Enzymatisk enkelcellspassaging med ROCKi tillsammans med LN-521-matrisen är känd för att upprätthålla cellerna som karyotypiskt normala, pluripotenta och lätt kan differentiera samtidigt som man undviker inducerad heterogenitet att kolonibaserad passage kan stimulera 10 , 19 , 20 . HiPS-celler som odlas på LN-521 kan passeras som enskilda celler utan tillsats av ROCKi 10 , men tillägget av ROCKi gör protokollet enklare för mindre erfarna hanterare och reducerar den tid som krävs för hiPS-cellderivation.
Programmeringseffektivitet är geNerall inte ett problem med detta protokoll; SeV-vektorer har relativt hög omprogrammeringseffektivitet> 1% för fibroblaster 11 . Framväxten av koloniernas överflöd (<20) förväntas. Det rekommenderas att välja tre gånger antalet kolonier som behövs. Det har observerats att en del av plockade kloner misslyckas att vidhäftas efter plockning. Extra kolonier kan också behövas för att kompensera för delvis omprogrammerade kolonier. Delvis omprogrammerade kolonier är i vissa fall kapabla att vidhäfta och växa under stöd av exogent uttryck av pluripotensgener av SeV-vektorerna. När SeV-vektorerna utspädes upphör dessa celler att proliferera och dissociera, vanligtvis uppenbara kring passage 6-8. Heterogeniteten hos kulturen är också ett tecken på partiell omprogrammering och heterogena linjer bör kasseras ( Figur 2H ).
Det optimala valet av omprogrammerande vektor- och kulturförhållanden är beroende avSyftet med de celler som alstras. För att undvika att parti-till-sats-variationer påverkar resultat, rekommenderas definierade villkor. Valet av ett icke-integrerande vektorsystem föreslås för att bevara genomisk integritet hos omprogrammerade celler. SeV-vektorer valdes i detta protokoll på grund av robustheten, relativt hög effektivitet och låga händer i tid. SeV-vektorerna utspädes under celldelningar och är inte detekterbara runt passage 12, vilket säkerställer att genererad data inte påverkas av exogent uttryck. På grund av de noggranna kraven på celler avsedda för kliniska ändamål kan SeV omprogrammering vara ett hinder för klinisk översättning eftersom det är svårt att bevisa fullständig avgivning av allt vektormaterial. MRNA-medierad omprogrammering kan vara fördelaktig om härledande celler med avsedd användning i cellterapier 12 . Dessa metoder är emellertid mycket mer arbetsintensiva och mer komplicerade att använda 21 . Metoden här deSkriven för fibroblastkultur är inte heller lämplig för kliniska tillämpningar. Eftersom både FBS och gelatin är xenogena och odefinierade, överväga att byta dessa till definierade xenofria produkter 22 .
Steril hanteringsteknik och vanlig mykoplasminfektionstest rekommenderas under arbetet med någon form av cellodling. Mänsklig hud innehåller många mikroorganismer som kan frodas under de förhållanden som cellerna odlas i om de inte hanteras korrekt. Det rekommenderas därför att vara extra vaksam i hanteringen av hudbiopsier och under de första dagarna av kulturen efter biopsibehandling. Inrättandet av fibroblastkulturen från hudbiopsier är faktiskt en tidskrävande process. Efter behandling av hudbiopsi kommer initialt att vara svaga tecken på fibroblastceller vidhäfta, så vänta minst en vecka för att hitta några fibroblastceller som visar förväntad morfologi i kulturen. Den tid som behövs för etableringen av fibroblasterIn vitro-kulturer från biopsier är beroende av en mängd olika faktorer, inklusive storlek på biopsi, ålder av givare och hur biopsin har hanterats sedan den togs. Det är föredraget att omprogrammera tidiga passagefibroblaster för optimal omprogrammeringseffektivitet 23 .
Sammanfattningsvis beskriver vi här en etablerad, robust och lättanvänd metod för generering av höghomogena hiPS-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att rapportera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av SSF (B13-0074) och VINNOVA (2016-04134) finansieringsagenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 mL tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 mL | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Sealing plates for storage |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
