Summary
ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。
Abstract
Xeno-freeおよび完全に定義された条件は、均一なヒト誘導多能性幹（hiPS）細胞の堅牢で再現性のある世代のための重要なパラメータである。フィーダー細胞または未定義マトリックス上のhiPS細胞の維持は、バッチの変動、病原性の汚染および免疫原性のリスクに影響されやすい。定義された組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスを異種非含有培地および規定培地と組み合わせて使用することにより、変動性が減少し、hiPS細胞の一貫した生成が可能になる。センダイウイルス（SeV）ベクターは、非組み込み型RNAベースのシステムであるため、組み込みベクターが有するゲノムの完全性に対する潜在的な破壊的効果に関連する懸念を回避することができる。さらに、これらのベクターは真皮線維芽細胞の再プログラミングにおいて比較的高い効率を示した。さらに、細胞の酵素的な単細胞継代は、実質的に以前の経験のないhiPS細胞の均質な維持を容易にする培養する。ここでは、再現性と使いやすさに重点を置いて広範囲に試験および開発され、線維芽細胞から定義された異種非含有ヒトhiPS細胞を生成するための堅牢で実用的な方法を提供するプロトコールについて説明します。
Introduction
Takahashi らによるhiPS細胞株の最初の誘導以来、 1、2 、hiPS細胞は、疾患モデル化、創薬、および再生医療における細胞療法を生成するための原材料として有用なツールを提供している3 。 hiPS細胞培養は、線維芽細胞フィーダー細胞4,5またはマトリゲル6および胎児ウシ血清（FBS）を含有する培地製剤との共培養に長く依存してきた。バッチ間の変動は、これらの培養条件の未定義の性質の共通の結果であり、予測不可能な変動をもたらし、これらのプロトコルの信頼性に大きく寄与する7 。 Essential 8（E8） 8および定義された細胞培養マトリックス、例えばLN-521 9のような規定された培地の開発は、高度に再現可能なプロトコールの確立および均質なhiPS細胞の堅牢な生成および維持を助けるためのものである7,8,9,10。
統合型の再プログラミング技術の開発は飛躍的な進歩を遂げています。もともと、再プログラミングは、ゲノムの完全性に破壊的な影響を与えてゲノムにランダムに組み込まれたレトロウイルスベクターに依存していました11 。再プログラミング方法の進歩には、RNAに基づくベクターの開発が含まれる。 RNAベクターは、ゲノム組換えによる意図しない組込みが不可能であるため、DNAベースの再プログラミング方法よりも有利である12 。 SeVベクターは、DNA相11を持たない一本鎖RNAを介して、外因性因子の高い一過性の発現を提供する。 SeVによって送達された再プログラミングベクター細胞の増殖の至るところで希釈され、最終的に培養から脱落して、フットプリントの自由な再プログラミング方法を提供する。その後、多能性の維持は、多能性遺伝子の内在的発現に依存する2 。
先駆的なhiPS細胞ベースの治療法が臨床試験に移行し始めているため、標準化されたバッチ、再現性、および安全性に対する要求は、 13に対処するための重要な課題です。したがって、動物起源の製品は避けるべきである。例えば、異種産物の使用は、非ヒト病原体汚染のリスクと関連している。また、動物由来の培養成分の存在下で培養された細胞は、非ヒトのシリア酸を細胞膜に取り込ませ、誘導された細胞を免疫原性にすると脅かされている14 。したがって、将来の臨床研究には、異種産物を排除する必要があります。このプロトコルはxeを適用しますhiPS細胞の維持における無細胞で規定された培養は、細胞を臨床コンプライアンスに近づける。
このプロトコルは、線維芽細胞から標準化されたhiPS細胞を生成する、一貫性があり、再現性があり、使い易い方法を記載しています。また、確立されたhiPS細胞の維持のための使いやすい培養システムを提供します。このプロトコールは、Karolinska Institutetのスウェーデン国内ヒトiPSコア施設で、300以上のhiPS細胞株を誘導するために使用されています。
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Protocol
患者物質の収集およびhiPS細胞の誘導は、2012年3月28日のストックホルム倫理審査委員会の登録番号：2012 / 208-31 / 3によって承認されています。細胞培養ステップは、特に明記しない限り、バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。細胞を扱うときは、常に無菌操作技術を実践してください。開始前に培地、プレートおよび試薬を室温に戻す。高湿度下、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。
1.皮膚生検からのヒト線維芽細胞の単離
- 培養液の調製、消化酵素、皿のコーティング、切開器具。
- 線維芽細胞培地：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）44.5mL、胎児ウシ血清（FBS）5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン（PEST）500μL（ 表1参照）を4℃で保存する。
- 1mg / mLの作用濃度で消化酵素を調製する：wei4mlのディスパーゼおよびコラーゲナーゼI型パウダーのアリコートを別の15mLチューブに入れ、4mLのDMEM / F12 + 1％PESTに溶解する。酵素溶液を0.22μmのストレーナーに通すことによって酵素溶液を滅菌する。毎回新鮮な酵素溶液を調製する。
- リン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）中の0.1％ゼラチン1mLで切開した生検当たり6ウェル組織培養プレート（または35mm組織培養皿）に1ウェルをコートする。室温で30分間インキュベートする。
- 解剖のための生検あたりの外科用ハサミと鉗子のオートクレーブ1セット。
- 生検処置
注：採取後、できるだけ早く生検材料を処理する。 PBS + 1％PEST中で4℃で48時間保存する。生検のサイズは、直径2〜4 mmで、倫理的な許可が必要です。- 生検を35mm皿に移す。生検を新しい35 mmの皿に移し、70％エタノール2 mLに生検を30秒間浸す。
- 生検を3番目に移動する35 mm皿に入れ、1％PESTを補充した滅菌ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）1 mLで洗浄する。
- 生検を第4の35mm皿に移し、新鮮に調製した0.1％ディスパーゼ溶液1mLを加える。
- 外科用はさみと鉗子を使用して、皮膚生検を1〜2mm 3個に切り、ディスパーゼ溶液を含む生検片を15mLチューブに移す。ディスパーゼを2 mL追加します。
- 35 mmディッシュを1 mLディスペース溶液ですすぎ、15 mLチューブに移す。
- 生検を4℃で一晩インキュベートする。
- 0.1％コラゲナーゼI 4mLをチューブに加え、37℃で4時間インキュベートする。
- 消化した細胞を300 xgで3分間遠心分離し、上清を吸引し、2 mlの線維芽細胞培地に消化液を再懸濁する。
- 6ウェル組織培養プレートからゼラチン溶液を除去する。残りの断片を含む細胞懸濁液を6ウェル組織培養プレート（または35μmDPBS中の0.1％ゼラチンでプレコートした。
- 3日ごとに培地を交換する。
- ヒト線維芽細胞の増殖
注：線維芽細胞は、80％コンフルエントになるとT25（25cm 2 ）組織培養フラスコに継代する準備ができています（ 図2B ）。線維芽細胞は、典型的には、7日以内に80％の集密度に達する。ただし、必要な時間は大きく変わる可能性がありますが、4週間を超えてはなりません。- 培地を吸引し、2.5mLのDPBSで1回洗浄する。
- DPBSを除去し、Trypsin-EDTA（0.05％）1 mLを添加し、37℃で5分間または細胞が丸みを帯びて剥がれ始めるまでインキュベートする。
- 必要に応じて細胞をすすぎ、細胞の適切な解離を確実にするために、2mLの線維芽細胞培地を加える。細胞溶液を15mLチューブに移し、300xgで3分間遠心分離する。
- 上清を捨て、細胞ペレットを5mLの線維芽細胞培地およびプレート線維芽細胞に再懸濁する。被覆された細胞組織培養T25フラスコ。この工程の後に線維芽細胞を増殖させる場合には、上記のように解離し、12x10 3細胞/ cm 2で播種する。
- コンフルエントな細胞が凍結する準備ができたら、再プログラミングのために拡大または平板培養する。再プログラムを開始する前に、2ラウンドの線維芽細胞を凍結する（凍結手順については次のセクションを参照）。再プログラミング効率は一般に、より低い継代線維芽細胞についてより高く、継代2〜4での細胞が最適である。しかし、このプロトコールを用いて、10代までの線維芽細胞の再プログラミングが成功した。
- 線維芽細胞の凍結融解
- 新鮮な線維芽細胞凍結培地：90％FBS + 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を調製する。 4℃に保つ（ 表1 ）。コンフルエントになると、T25組織培養フラスコを3つの冷凍庫に凍結することができる。バイアル凍結するごとに線維芽細胞凍結培地500μLを調製する。
- 細胞を凍結させるには、c細胞を血球計数器を用いて計数し、3×10 5細胞の部分を15mLチューブに移す。 3分間300 xgでチューブを回転させます。上清を吸引する。
- 細胞ペレットを500μLの4℃線維芽細胞凍結培地に再懸濁し、クライオバイアルに移す。バイアルを凍結容器に入れ、細胞を-80℃で24時間インキュベートしてから、長期間保管するために液体窒素に移す。
- 細胞を解凍するには、クライオバイアルの底部を37℃の水に浸します。液化したら、細胞懸濁液を15mLチューブに移し、5mLの線維芽細胞を加える。細胞を300 xgで3分間回転させる。
- 上清を除去し、5mLの線維芽細胞培地で細胞ペレットを再懸濁する。細胞を非被覆T25組織培養フラスコに移し、37℃でインキュベートする。
2.線維芽細胞のSeVベクターの再プログラミング
- ベクターアリコートの調製 注意：生物安全性レベル2の格納容器の下でSeVを取り扱ってください。製造元のプロトコールおよび現地ガイドライン17を参照してください。ウイルス力価はバッチごとに異なります。
- アリコートを調製する前に、メーカーのプロトコール（ 例えば 、CytoTune 2.0）に従って、5×10 4細胞に必要なベクターの量を計算する。ウイルス力価は、一般に8×10 7 ~1.5×10 8まで変動する。 5：5：3（KOS MOI = 5、hc-myc MOI = 5およびhKlf4 = MOI 3）ベクターを解凍して結合する。オートクレーブした1.5mLチューブに5×10 4細胞を再プログラミングするために計算された量を加えます。再プログラムのために線維芽細胞培地でウイルスアリコートを250μLの最終容量に希釈する。
注：各バイアルは、5×10 4線維芽細胞を有する24ウェル組織培養プレートの1つのウェルの再プログラミングに有効である。ウイルスアリコートを-80℃で保存する。
- アリコートを調製する前に、メーカーのプロトコール（ 例えば 、CytoTune 2.0）に従って、5×10 4細胞に必要なベクターの量を計算する。ウイルス力価は、一般に8×10 7 ~1.5×10 8まで変動する。 5：5：3（KOS MOI = 5、hc-myc MOI = 5およびhKlf4 = MOI 3）ベクターを解凍して結合する。オートクレーブした1.5mLチューブに5×10 4細胞を再プログラミングするために計算された量を加えます。再プログラムのために線維芽細胞培地でウイルスアリコートを250μLの最終容量に希釈する。
- SeVベクター形質導入
- 細胞を吸引する1LのDPBSで洗浄する。 DPBSを吸引し、1mLのトリプシン-EDTA（0.05％）を加える。 37℃で5分間または細胞が剥離するまでインキュベートする。
- 2mLの線維芽細胞を加え、細胞を再懸濁し、15mLのチューブに移す。 300xgで3分間遠心分離する。
- 上清を吸引し、ペレットを2mLの線維芽細胞培地に再懸濁する。
- 血球計算板を用いて線維芽細胞を計数し、24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに5×10 4細胞を播種する。細胞を37℃で一晩インキュベートする。
- 細胞培養液を吸引し、SeV溶液250μLを添加し、37℃で一晩インキュベートする。
- 新鮮な線維芽細胞培地に毎日培地を交換する。形質導入された細胞をLN-521被覆プレートに継代する前に7日間増殖させる。通行の前日にLN-521プレートを準備する。コーティング手順については、2.3.1を参照してください。
- 形質導入された線維芽細胞の再置換
- LN-521コートディッシュ：DPBS中のLN-521を最終濃度0.63μg/ cm 2に希釈する。 60 mm組織培養皿あたり2 mlのLN-521溶液をピペットで採取する。パラフィルムを使用して60 mm組織培養皿をシールする。 4℃で一晩インキュベートする。
- 取扱いを容易にするために、E8培地48.5mL、E8添加物1mLおよびPEST500μL（ 表1 ）の必須8培地（E8）アリコートを調製する。
- 形質導入の7日後に、細胞をLN-521でコーティングした60mm組織培養皿に通す。 250μLのTrypsin-EDTA（0.05％）を添加し、37℃で5分間または細胞が剥離するまでインキュベートする。線維芽細胞2mLを加え、細胞を300xgで3分間遠心分離する。
- 上清を吸引する。ペレットを2mLの線維芽細胞培地に再懸濁し、細胞を血球計数器で計数する。プレコートしたプレートからLN-521溶液を吸引し、LN-521プレコート60mmディッシュ内の5mlの線維芽細胞培地に4×10 4個の細胞を播種する。 Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632を加える。（ROCKi）を最終濃度5μMになるように添加した。 37℃で一晩インキュベートする。
- 重要なことに、翌日、培地をE8培地に交換する。毎日E8培地を交換する。 hiPS細胞コロニーは2〜3週間以内に出現する。
コロニーのピッキングとhiPS細胞の増殖
注：以下のステップは、ステレオ顕微鏡下でバイオセーフティーキャビネットの外部で行われます。ヘアネットと手技マスクの使用を推奨します。細胞培養を汚染しないように注意して作業してください。
- 採取する前日に、LN-521被覆組織培養24ウェルプレートを調製する。 LN-521をDPBS0.63μg/ cm 2で希釈する。 250μLのLN-521溶液を24ウェル組織培養プレートの1つのウェルにピペットで入れる。パラフィルムを使用してプレートをシールする。 4℃で一晩インキュベートする。
注：コロニーは、直径が1mmを超えるサイズに達するとすぐに拾います。コロニーは鋭いエッジを表示し、均一な月に成長する必要があります（ 図2D ）。 - LN-521溶液を吸引し、E8500μLを24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに加える。
- 実体顕微鏡の下でグリッドのようなパターンでメスでコロニーをより小さな断片に切断する。機械的に細胞シートを皿から掻き取り、200μLのピペットを使用してシートを準備したウェルに移す（ 図2D -2E ）。コロニーを別々のウェルに集める。
- 48時間培地を交換せずに細胞を付着させる。その後、E8培地を毎日交換する。
- コロニーが> 5mmの大きさに達したとき、酵素的に細胞を単細胞としてLN-521被覆プレートの新しいウェルに通過させる。
- 細胞培養培地を細胞から吸引し、250μLのDPBSで洗浄する。
- DPBSを吸引する。 250μLの解離試薬を添加し、37℃で3分間インキュベートする。
- 細胞が丸め始めたことを観察してください。デタッチ細胞を解離試薬で数回すすいでプレートから細胞を除去する。
- E8培地500μLを15 mLチューブに添加する。解離試薬中の細胞をチューブに移し、300xgで3分間遠心分離する。
- LN - 521プレコートされたウェルからLN - 521溶液を吸引し、500μLの室温E8培地を加える。
- 上清を吸引し、細胞ペレットを500μLのE8培地に再懸濁する。
- 血球計数器を用いて細胞を計数し、調製したLN-521プレコートウェル（1.25×10 4〜2.5×10 4細胞/ cm 2 ）中に2.5×10 4〜5×10 4細胞を播種する。細胞培養フォーマットは、意図した目的に合わせて容易にアップスケールすることができる。
- 10μMの最終濃度にROCKiを加える。 37℃で細胞をインキュベートする。
- 毎日E8培地を交換する。細胞は、通常、4〜6日後に継代する準備ができています。約90％コンフルエントである場合、上記の単一細胞として細胞を酵素的に通過させる。
注：再プログラムベクターは、hiPS細胞の増殖中に徐々に希釈され、継代12後には検出されない。継代的に再プログラミングされた細胞は、継代6-10周りで増殖を停止するか、またはそれらの特徴的な多能性幹細胞形態を失う（ 図3B ）。 - hiPS細胞の凍結融解
- 細胞を凍結するには、上記のように単一細胞として酵素的に細胞を解離させ、細胞を血球計数器で計数し、1mLのE8培地を含む15mLチューブに2.5×10 5細胞を移す。 300xgで3分間遠心分離する。上清を吸引する。
- 250μLの4℃PSCクライオメディウムに細胞ペレットを再懸濁し、クライオバイアルに移す。バイアルを凍結容器に入れ、細胞を-80℃で24時間インキュベートしてから、長期保存のために液体窒素に移す。
- 細胞を解凍するために、24ウェル組織培養のプレコートLN-521ウェルを調製するプレートを、LN-521溶液を吸引し、250μLのE8培地を添加することによって洗浄する。クライオバイアルの底部を37℃の水に浸して、小さな氷色が残るようにします。
- cryovialに250μLのE8培地を添加し、細胞懸濁液を15mLチューブに移し、1mLのE8培地を加える。細胞を300 xgで3分間回転させる。
- 上清を除去し、250μLの室温E8培地で細胞ペレットを再懸濁する。調製したウェルに細胞懸濁液を移し、1％の細胞生存補助剤または10μMのROCKiを加える。 37℃で組織培養プレートをインキュベートする。
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Representative Results
生検からhiPS細胞まで
生検から確立されたhiPS細胞までの全過程は、再プログラミングベクターがなく、特性決定の準備ができてから約16週間かかる（ 図1 ）。より詳細なタイムラインが図2Aに示されている 。線維芽細胞の培養を確立して拡張するためには、約4週間が必要である。最初のhiPS細胞コロニーは、センダイベクター導入の約3週間後に出現し始めた。最初の継代のためにコロニーを機械的に採取し、次いで単一細胞として酵素的に継代した。
ヒト線維芽細胞培養の確立
ヒト線維芽細胞培養物がコンフルエントまで増殖し、受け入れられた形態を示したとき、それらを最初に増殖させ、2回の通過（ 図2B ）。
SeVベクターを用いたヒト線維芽細胞の再プログラミング
細胞死のレベルの増加は、SeV形質導入後の日に見られ、線維芽細胞形態へのわずかな変化が観察された。最初のhiPSコロニーの出現は、形質導入後12日目から検出された（ 図2A 、2C ）。採取する準備ができているコロニーは、形質導入後約3〜4週間で予想された（ 図2A 、2D ）。このプロトコールで指定された量の細胞を播種すると、豊富なコロニーが出現した（<20）。好ましい形態を示すコロニーの選択的なピッキングが推奨される。コロニーの特徴は、平滑なコンパクト細胞の質量、均質な単層としての増殖、区別可能なindi周囲の線維芽細胞に向かって鋭いエッジを有する多次元細胞（ 図2D ）。 hiPS細胞コロニーを、メスを用いてグリッド様パターンで切断し、機械的に継代した（ 図2E ）。拾い上げたhiPSクローンを48時間放置して、培地を変更することなくプレートに付着させた。 hiPS細胞クローンは非常に均一であったが、最初の2回の継代中に再プログラムプレート由来の線維芽細胞はほとんど認められなかった（ 図2F ）。綿密な境界と大きな非コンパクトな異種細胞集団のコロニーの選別は避けるべきである（ 図2G ）。得られたhiPS細胞株は、大きな核 - 細胞質比を有する高密度の単層として増殖し、発光境界を画定した。対照的に、これらの基準を満たさない接着した非均質コロニーは、混合細胞集団の培養を避けるために廃棄した（ 図2H ）。
p "：keep-together.within-page =" 1 "> hiPS細胞クローンの検証SeVベクターが失われ、多能性状態の維持が内因性因子の発現によって促進された後に、誘導された細胞の多能性の特徴付けが行われた。 hiPS細胞の検証に進む前に、SeVベクターの発現が失われていることを確認してください。このプロトコールに続いて、SeVベクターRNAは、我々の経験によれば継代12によりもはや検出できないので、特徴付けの適切な出発点である（ 図3A ）。多能性マーカーの免疫細胞化学染色OCT4、SSEA4およびNANOGは、均一に陽性の結果をもたらすはずである（ 図3B ）。多分化能因子を発現しなかった部分的に再プログラムされた細胞を含む細胞培養物を廃棄した（ 図3C ）。内因性多能性遺伝子のmRNA発現は、リアルタイムPC R（RT-PCR）を図3Dに示す 。
多能性幹細胞は、3つの胚葉に容易に分化できるはずである。 hiPS細胞の分化能は、胚様体（EB） 18の形成によって評価した。 hiPS細胞から生成された遊離浮遊EBを図3Eに示し、EB分化の21日後の胚葉特異的マーカーのmRNA発現を図3Fに示す 。
図1：皮膚生検からhiPS細胞までのフローチャート。
プロトコルの重要なステップの概要。この図には、生検収集、線維芽細胞の単離、SeV形質導入、コロニーの採取、およびhiPS細胞のクローン増殖が含まれる。e.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2：hiPS細胞の生成における重要なステップ。
（A）タイムラインは、線維芽細胞、SeV形質導入、培地変化およびコーティングを含むプロトコールにおける重要な時点を強調する。 hiPS細胞の継代12は、特徴付け実験の開始として強調される。 （B）典型的な形態の培養におけるコンフルエント線維芽細胞の明視野像。 （C）形質導入した線維芽細胞からのhiPS細胞コロニーの出現。 （D）周囲の線維芽細胞に向かって鋭い縁を有する識別可能な個々の細胞（継代0）を優先的に示すコロニーを選別する準備ができている。 （E） hiPS細胞コロニーを格子様パターンで切断し、機械的に継代する。 （F）成長の数日後に接着したコロニー。接着したhiPS細胞は、再プログラミングプレートに由来する異常に多数の線維芽細胞によって取り囲まれている。線維芽細胞はプレートから掻き取ることができ、その後の単細胞継代（継代1）で消失する可能性が最も高い。 （G）完全に再プログラムされた細胞を連想させる形態を示すコロニー;ぎりぎりの境界線、大きな非圧縮異種細胞塊。 （H）明視野画像は、高度に異種の細胞株と比較して、早期継代を完全に再プログラムしたhiPS細胞株を例示している。スケールバーは100μmを示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：hiPS細胞の特徴付け。
（A） SeVベクター特異的マーカーのRT-PCR。継代3のhiPS細胞を、再プログラミングベクター1の陽性対照として使用する。継代12において、細胞は、ウイルス特異的マーカーであるセンダイ特異的バックボーン（SeV B）、センダイ特異的KLF4（KLF4 SeV）、センダイ特異的cMYC（cMYC SeV）、PCR対照（GAPDH）および鋳型なし（ - ） （B）継代12で完全に再プログラミングされた均一なhiPS細胞株の代表例。hiPS細胞の明視野画像は、シャープな発光エッジおよび大きな核および小さな細胞質を有するタイトな単層で細胞が増殖することを明らかにする。多能性マーカーOCT4、NANOG、SSEA4および核染色4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）の免疫細胞化学染色により、均一な陽性発現が示された。 （C）多能性マーカーNANOGの異種発現を示す細胞株。文化eは部分的に再プログラムされた細胞を含み、廃棄されるべきである。 （D）多能性マーカーの発現を示す多能性マーカーNANOG、OCT4、PCR対照（GAPDH）およびテンプレートなし（ - ）のmRNA発現のRT-PCR。 （E） hiPS細胞から生成された遊離浮遊胚様体。 （F） 21日目の胚様体分化後のRT-PCRは、誘導されたhiPS細胞が3つの胚葉に分化することができることを示す。内胚葉マーカーAFPおよびGATA4、中胚葉マーカーRUNXおよびHAND1、外胚葉マーカーNCAMおよびNESTIN、PCR対照（GAPDH）およびテンプレートなし（ - ）。スケールバーは100μmを示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコールの予想される結果は、いくつかのクローン的に誘導されたhiPS細胞株の生成が成功したことである。重要なことに、ここに記載された確立されたhiPS細胞の維持および増殖のための方法は信頼性があり、幹細胞培養の経験がほとんどない状態で実施することができる。 ROCKiとLN-521マトリックスとの酵素的単一細胞継代は、細胞を核型正常、多能性および容易に分化させることができ、コロニーに基づく継代が10,19,20を刺激することができる誘導された異種性を避けることが知られている。 ROCKi 10を添加しなくても、LN-521上で培養されたhiPS細胞は単一細胞として継代することができるが、ROCKiを添加すると、経験の少ないハンドラーにとってプロトコールが容易になり、hiPS細胞誘導に要する時間が短縮される。
再プログラミング効率はGEですこのプロトコルの問題ではありません。 SeVベクターは、線維芽細胞11に対して> 1％の比較的高い再プログラミング効率を有する。豊富なコロニー（<20）の出現が期待される。必要なコロニー数の3倍を選ぶことをお勧めします。摘み取られたクローンの一部が摘出後に付着しないことが観察されている。部分的に再プログラミングされたコロニーを補うために、余分なコロニーも必要となり得る。部分的に再プログラミングされたコロニーは、SeVベクターによる多能性遺伝子の外因性発現によって支持され、増殖することができる場合がある。 SeVベクターが希釈されると、これらの細胞は増殖および解離を停止し、通常は継代6-8付近で明らかになる。培養物の異種性もまた部分的な再プログラミングの徴候であり、異種の系統は捨てるべきである（ 図2H ）。
再プログラミングベクターおよび培養条件の最適な選択は、生成された細胞の目的。ただし、結果に影響を与えるバッチ間バラツキを避けるため、定義された条件を推奨します。再プログラミングされた細胞のゲノムの完全性を保つために、非組み込みベクター系の選択が示唆されている。 SeVベクターは、ロバスト性、比較的高い効率および必要とされる手の短い時間のために、このプロトコルで選択された。 SeVベクターは、細胞分裂中に希釈され、継代12の周りでは検出されないため、生成されたデータが外因性発現の影響を受けないことが保証される。 SeVリプログラミングは、臨床目的に意図された細胞を注意深く要求するため、すべてのベクター材料を完全に排除することは困難であることを証明しているため、臨床翻訳の障壁となる可能性があります。 mRNA媒介性の再プログラミングは、細胞療法12において意図された用途の細胞を誘導する場合に有利であり得る。しかしながら、これらの方法は、はるかに労働集約的であり、 21を使用するためにより複雑である。ここのメソッドは、線維芽細胞培養のためにスクライビングされたものも、臨床用途には不適当である。 FBSとゼラチンの両方が異種であり、定義されていないので、定義された異物を含まない製品22に切り替えることを検討してください。
どのような形態の細胞培養でも処理するには、滅菌処理技術と定期的なマイコプラズマ感染検査が推奨されます。ヒトの皮膚には、細胞が適切に取り扱われない場合に培養される条件下で増殖することができる多くの微生物が含まれる。したがって、皮膚生検の取り扱いおよび生検処理後の培養の最初の日には特別な注意を払うことが推奨される。皮膚生検からの線維芽細胞培養の確立は、実際には時間のかかるプロセスである。皮膚生検を処理した後、線維芽細胞が付着している弱い徴候が最初にあり、培養物中に予想される形態を示す少数の線維芽細胞を見つけるために少なくとも1週間待つ。線維芽細胞の樹立に必要な時間生検からのインビトロ培養は、生検のサイズ、ドナーの年齢および採取されてから生検がどのように処理されたかを含む様々な因子に依存する。最適な再プログラミング効率のために早期通過線維芽細胞を再プログラムすることが好ましい23 。
要約すると、本明細書では、非常に均一なhiPS細胞の生成のための、確立された堅牢で使いやすい方法を記載する。
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Disclosures
著者は報告する利益相反はない。
Acknowledgments
この作業は、SSF（B13-0074）とVINNOVA（2016-04134）の資金提供機関によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 mL tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 mL | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Sealing plates for storage |
References
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