Summary
İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam türetilmesi, entegre edilmeyen Sendai virüsü (SeV) vektörü aracılığıyla dermal fibroblastların yeniden programlanması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HiPS hücre bakımı ve klonal genişleme, rekombinant insan lamınin 521 (LN-521) matrisi ve Esansiyel E8 (E8) Ortamı ile kseno içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.
Abstract
Xeno içermeyen ve tam olarak tanımlanmış koşullar, homojen insan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam ve tekrar üretilebilir üretimi için kilit parametrelerdir. Besleyici hücrelerdeki hiPS hücrelerinin bakımı veya tanımlanmamış matrisler, parti varyanslarına, patojenik kontaminasyona ve immünojeniklik riskine duyarlıdır. Tanımlanmış rekombinant insan laminin 521 (LN-521) matrisinin, xeno içermeyen ve tanımlanmış ortam formülasyonları ile kombinasyon halinde kullanılması, değişkenliği azaltır ve hiPS hücrelerinin tutarlı bir şekilde oluşturulmasını sağlar. Sendai virüsü (SeV) vektörü entegre olmayan RNA tabanlı bir sistemdir, bu nedenle vektörlerin entegre edilebilen genom bütünlüğüne ilişkin potansiyel yıkıcı etkiyle ilişkili endişeleri atlamak. Dahası, bu vektörler dermal fibroblastların yeniden programlanmasında nispeten yüksek verimlilik sergilemiştir. Buna ek olarak, hücrelerin enzimatik tek hücreli pasajlanması, hiPS hücrelerinin homojen bakımını, kök hücre tecrübesine önemli bir deney yapmadan kolaylaştırırKültür yapacağız Burada, çoğaltılabilirlik ve kullanım kolaylığı üzerine yoğun bir şekilde test edilmiş ve geliştirilmiş, fibroblastlardan tanımlanmış ve xeno içermeyen insan hiPS hücreleri oluşturmak için sağlam ve pratik bir yol sağlayacak bir protokolü açıklıyoruz.
Introduction
Takasahi ve diğerleri tarafından hiPS hücre hatlarının ilk türetilmesinden beri 1 , 2 , hiPS hücreleri, hastalıkların modellenmesi, ilaç keşfi ve rejeneratif tıptaki hücre terapileri üretmek için kaynak materyal olarak yararlı bir araç sağlamıştır. HiPS hücre kültürü, uzun süredir fibroblast besleyici hücreler 4 , 5 ile veya Matrigel 6'da ve fetüs sığır serumu (FBS) içeren ortam formülasyonları ile birlikte kültür üzerine bağımlı olmuştur. Toplu iş varyansları, bu kültür koşullarının tanımlanmamış doğasının ortak bir sonucudur ve bu protokollerin güvenirliliğine büyük katkıda bulunan öngörülemeyen varyasyonlarla sonuçlanır 7 . Essential 8 (E8) 8 ve tanımlanmış hücre kültürü matrisleri, örneğin LN-521 9 gibi tanımlanmış ortamın geliştirilmesi,7 , 8 , 9 , 10 homojen hiPS hücrelerinin sağlam üretimi ve bakımında yüksek ölçüde tekrarlanabilir protokollerin kurulması ve yardımına yöneliktir.
Entegrasyonsuz yeniden programlama tekniklerinin geliştirilmesi bir adım öne çıkmıştır. Başlangıçta, yeniden programlama, genom bütünlüğü üzerinde yıkıcı etkilerle rastgele olarak genoma entegre edilmiş retroviral vektörlere dayanmaktadır 11 . Yeniden programlama metodolojilerindeki gelişmeler, RNA'ya dayalı vektörlerin geliştirilmesini içerir. Genomik rekombinasyon yoluyla istenmeyen entegrasyon mümkün olmadığından, RNA vektörlerinin DNA tabanlı yeniden programlama yöntemine göre bir avantajı vardır 12 . SeV vektörleri, bir DNA fazı 11 olmaksızın tek sarmallı RNA aracılığıyla eksojen faktörlerin yüksek ve geçici ekspresyonunu sağlar. SeV tarafından gönderilen yeniden programlama vektörleriHücre genleşmesi boyunca seyreltilir ve nihayetinde yeniden basma işleminin bas baski ücretsiz bir yolu olan kültürden dökülür. Bundan sonra pluripotensin bakımı pluripotens genlerin endojen sentezlenmesine bağlıdır 2 .
Öncü hiPS hücre bazlı tedaviler klinik araştırmalara geçmeye başladıkça, standartlaştırılmış yığınlar, tekrarlanabilirlik ve emniyet talepleri, ele alınması gereken önemli konulardır 13 . Bu nedenle, hayvansal orijinli ürünlerden kaçınılmalıdır. Örneğin, ksenogeneik ürünlerin kullanımı insanlık dışı patojen kontaminasyonu riski ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, hayvansal kökenli kültür bileşenleri mevcudiyetinde kültürlenen hücrelerin, bağışık olmayan tüy hücreleri meydana getirmek için tehdit eden hücre membranlarında insan dışı sialak asitler içerdiği gösterilmiştir ( 14) . Bu nedenle, gelecekteki tüm klinik araştırmalarda, ksenogeneik ürünleri ortadan kaldırma ihtiyacı gereklidir. Bu protokol xe'yi uygularHiPS hücrelerinin klinik uygunluğa daha yakın hareketli bakımında serbest ve tanımlanmış bir kültür.
Bu protokol, fibroblastlardan standart hiPS hücreleri üreten, tutarlı, yüksek düzeyde çoğaltılabilen ve kullanımı kolay bir yöntemi açıklamaktadır. Ayrıca, kurulu hiPS hücrelerinin bakımı için kullanıcı dostu bir kültür sistemi sunar. Bu protokol, Karolinska Institutet'deki İsveç ulusal insan iPS Çekirdek tesislerinde 300 hiPS'tan daha fazla hücre hattını türetmek için kullanılmıştır; bazı tesislerde bazı hatlar daha önce açıklanmıştır 15 , 16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hasta materyalinin toplanması ve hiPS hücrelerinin türetilmesi, 28 Mart 2012'de Stockholm, Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Kayıt numarası: 2012 / 208-31 / 3. Aksi belirtilmediği sürece hücre kültürü basamakları biyogüvenlik kabinlerinde yapılmalıdır. Hücrelerle çalışırken daima steril taşıma teknikleri uygulayın. Ortam, tabaklar ve reaktiflerin oda sıcaklığına ulaşmasına başlamadan önce izin verin. 37 ° C, yüksek nemli ortamda% 5 CO 2'de inkübe edin.
1. İnsan fibroblastlarının dermal biyopsiden izole edilmesi
- Kültür ortamı preparatları, sindirim enzimleri, bulaşıkları kaplama ve kesme aletleri.
- Fibroblast ortamı hazırlayın: 44.5 mL Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı (IMDM), 5 mL Fetal sığır serumu (FBS) ve 500 μL penisilin / streptomisin (PEST) (bkz. Tablo 1 ), 4 ° C'de saklayın.
- 1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda sindirim enzimleri hazırlayın: weiGh 4 mg dispaz ve kollajenaz tip I tozlarının ayrı 15 mL'lik tüpler içindeki alikotları ve 4 mL DMEM / F12 +% 1 PEST'de eritilir. Enzimatik çözeltiyi, 0.22 um'lik bir süzgeçten geçirerek sterilize edin. Her seferinde taze enzim solüsyonları hazırlayın.
- Fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde 1 mL% 0.1 jelatin ile disseke edilen biyopsi başına bir 6 oyuklu doku kültürü plakası (veya 35-mm doku kültürü çanağı) içinde iyice kaplayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Diseksiyon için biopsi başına bir takım cerrahi makas ve forseps otoklavlayın.
- Biyopsi kullanımı
NOT: Alınan biyopsileri olabildiğince hızlı bir şekilde işleyin. 4 ° C'de 48 saate kadar PBS +% 1 PEST'de saklayın. Biyopsi çapı 2-4 mm olmalıdır ve etik izinlere uygun olmalıdır.- Biyopsiyi 35 mm'lik bir tabağa aktarın. Biyopsiyi yeni bir 35 mm'lik tabağa aktarın ve biyopsiyi 2 mL% 70 etanol içinde 30 saniye batırın.
- Biyopsiyi üçüncü bir yere taşı35-mm bulaşık ve% 1 PEST ile takviye edilmiş 1 mL steril Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile yıkayın.
- Biyopsiyi dördüncü bir 35 mm'lik çanağa aktarın, 1 mL taze hazırlanmış% 0.1 dispase solüsyonu ilave edin.
- Cerrahi makas ve forseps kullanarak cilt biyopsisini tabakta 1 - 2 mm3 parçaya kesin ve daha sonra disperse solüsyonu içeren biyopsi parçalarını 15 mL'lik bir tüp içine aktarın. İlave 2 mL dispaz ekleyin.
- 35 mm'lik çanağı 1 mL'lik bir dispase solüsyonuyla durulayın ve 15 mL'lik tüp içine aktarın.
- Biyopsiyi gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Tüp 4 ml% 0.1 kollajenaz I ekleyin ve 37 ° C'de 4 saat inkübe edin.
- 3 dakika sindirilmiş hücreleri 300 xg santrifüj, süpernatant aspire ve fibroblast orta 2 ml sindirimi tekrar süspansiyon haline getirin.
- 6-kuyucuklu doku kültürü plakasından jelatin çözeltisini çıkarın. Kalan parçaları içeren hücre süspansiyonunu 6 oyuklu doku kültürü plakasına (veya 35-m) aktarınM doku kültürü çanağı) içinde% 0.1 jelatin ile önceden kaplanmış.
- Ortamı her üç günde değiştirin.
- İnsan fibroblastlarının genleşmesi
NOT: Fibroblastlar,% 80 birleşince T25 (25 cm2) doku kültürü şişesine aktarılmaya hazırdır ( Şekil 2B ). Fibroblastlar tipik olarak 7 gün içinde% 80 konfluene ulaşır. Bununla birlikte, gereken süre büyük oranda değişebilir, ancak 4 haftadan uzun olmamalıdır.- Ortamı aspire edin ve bir kez 2.5 mL DPBS ile yıkayın.
- DPBS'yi çıkarıp 1 mL Trypsin-EDTA (% 0.05) ilave edin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin veya hücreler yuvarlak kenarları görünene ve ayrılmaya başlayıncaya kadar.
- Gerekirse hücrelerin düzgün ayrılmasını sağlayan hücreleri durulayın 2 mL fibroblast orta ekleyin. Hücre solüsyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 dakika boyunca 300 xg'da santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve hücre topağını fibroblast ortamının 5 mL'sinde tekrar süspanse edin ve plakaya fibroblastlar yerleştirin.Kaplamalı hücre doku kültürü T25 şişesi. Bu adımdan sonra fibroblastları genişletirken, yukarıda tarif edildiği gibi ayrın ve 12 x 10 3 hücre / cm2'lik bir tohum ekleyin.
- Birleştirilen hücreler dondurulmaya hazır olduğunda, yeniden programlamak için genişletin veya plaka koyun. Herhangi bir yeniden programlamaya başlamadan önce iki tur fibroblastın dondurulması (dondurma işlemi için bir sonraki bölüme bakın). Düşük aktarımlı fibroblastlar için yeniden programlama verimliliği genellikle daha yüksektir, geçiş 2-4'teki hücreler optimaldir. Bununla birlikte, bu protokol kullanılarak 10 numaralı hatta kadar fibroblastların başarılı yeniden programlanması yapılmıştır.
- Fibroblastların dondurulması ve çözülmesi
- Yeni fibroblast dondurma ortamı hazırlayın:% 90 FBS +% 10 dimetilsülfoksit (DMSO). 4 ° C'de tutun ( Tablo 1 ). Birleştirdikten sonra, T25 doku kültürü şişesi üç cryovial içine dondurulabilir. Dondurulmuş viyal başına fibroblast dondurma ortamı 500 mcL hazırlayın.
- Hücreleri dondurmak için, c'yi ayırınAdım 1.3'te tarif edildiği gibi hücreler, bir hemositometre kullanılarak hücreleri sayar ve 3 x 105 hücre hücrelerinin kısımlarını 15 mL'lik tüplere aktarır. 3 dakika boyunca 300 xg'da tüpleri çevirin. Süpernatantı aspire.
- Hücre pelletlerini 500 μL 4 ˚C fibroblast dondurucu ortamda süspanse edin ve kriyovyallere aktarın. Şişeleri dondurucu bir kapta yerleştirin ve uzun süre saklama için sıvı nitrojene aktarmadan önce 24 saat boyunca -80 ° C'de inkübe edin.
- Hücrelerin çözülmesi için, cryovial'in alt kısmını 37 ° C su içine batırın. Sıvılaştırıldıktan sonra, hücre süspansiyonunu 15 mL tüpe aktarın ve 5 mL fibroblast ortamı ilave edin. 3 dakika 300 x g hücreleri döndürün.
- Süpernatantı çıkarın ve hücre topağını 5 mL fibroblast ortamında tekrar süspanse edin. Kaplanmamış bir T25 doku kültürü şişesi hücreleri aktarın ve 37 ° C'de inkübe edin.
2. Fibroblastların SeV Vektör Yeniden Programlanması
- Vektör alikotlarının hazırlanması DİKKAT: SeV'yi biyogüvenlik seviyesi 2 muhafazası altında tutun. Üreticinin protokolüne ve yerel yönergelerine bakın 17 . Virüs titresi gruplar arasında değişir.
- Alikotları hazırlamadan önce üreticinin protokolüne ( örn . CytoTune 2.0) göre 5 x 104 hücre için gereken vektör miktarını hesaplayın. Virüs titresi genel olarak 8 x 10 7 - 1.5 x 10 8 arasında değişir. Vektörleri 5: 5: 3 çözünür ve birleştirir (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 ve hKlf4 = MOI3). Otoklavlanmış 1.5 mL tüplere 5 x 10 4 hücre yeniden programlanması için hesaplanan miktarı ekleyin. Yeniden programlama için virüs alikolarını fibroblast ortamı ile 250 mcL nihai bir hacme kadar seyreltin.
NOT: Her flakon, 24 kuyucuklu bir doku kültürü plakasının bir kuyusunun 5 x 10 4 fibroblast ile yeniden programlanması için geçerlidir. Virüs alikotları -80 ° C'de saklayın.
- Alikotları hazırlamadan önce üreticinin protokolüne ( örn . CytoTune 2.0) göre 5 x 104 hücre için gereken vektör miktarını hesaplayın. Virüs titresi genel olarak 8 x 10 7 - 1.5 x 10 8 arasında değişir. Vektörleri 5: 5: 3 çözünür ve birleştirir (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 ve hKlf4 = MOI3). Otoklavlanmış 1.5 mL tüplere 5 x 10 4 hücre yeniden programlanması için hesaplanan miktarı ekleyin. Yeniden programlama için virüs alikolarını fibroblast ortamı ile 250 mcL nihai bir hacme kadar seyreltin.
- SEV Vektör transdüksiyonu
- Hücre cubisini aspireOrtamı alın ve 1 mL DPBS ile yıkayın. DPBS'yi aspire edin ve 1 mL Tripsin-EDTA (% 0.05) ilave edin. 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin veya hücreler ayrılıncaya kadar.
- 2 mL fibroblast ortamı ekleyin ve hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 15 mL tüpe aktarın. 3 dakika 300 xg santrifüjleyin.
- Süpernatantı aspire edin ve pelet fibroblast ortamının 2 mL'sinde tekrar süspansiyon haline getirin.
- Bir 24-kuyucuklu doku kültürü plakasının bir oyuğunda bir hemositometre ve tohum 5 x 104 hücre kullanarak fibroblastları sayın. 37 ° C'de gece boyunca hücreleri inkübe edin.
- Hücre kültürü ortamını aspire edin, SeV solüsyonundan 250 μL ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Ortamı her gün taze fibroblast ortamına değiştirin. Dönüştürülen hücrelerin, LN-521 kaplı plakalara geçmeden önce 7 gün boyunca büyümesine izin verin. Geçiş gününden önce bir gün LN-521 tabak hazırlayın. Kaplama prosedürü için 2.3.1'e bakın.
- Dönüştürülmüş fibroblastların replasmanı
- LN-521 kaplamalı bulaşıklar: DPN'de LN-521'i 0,63 μg / cm2 nihai konsantrasyonda seyreltin. 60 mm doku kültürü çanağı başına 2 mL LN-521 çözeltisini pipetleyin. Parafilm kullanarak 60 mm'lik doku kültürü çanağını mühürleyin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Kolay kullanım için Esansiyel 8 orta (E8) alikotları hazırlayın: 48.5 mL E8 orta, 1 mL E8 takviyesi ve 500 μL PEST ( Tablo 1 ).
- Transdüksiyondan 7 gün sonra, hücreleri bir LN-521 kaplı 60 mm doku kültürü çanağına geçirin. Trypsin-EDTA (% 0.05) 250 mcL ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika süreyle veya hücreler ayrılana kadar inkübe edin. 3 mL 300 x g'de 2 mL fibroblast ortamı ve santrifüj hücreleri ilave edin.
- Süpernatantı aspire. Pelleti 2 mL fibroblast ortamında süspansiyon haline getirin ve hemositometredeki hücreleri sayın. Önceden kaplanmış plakadan LN-521 solüsyonunu aspire edin ve LN-521 önceden kaplanmış 60 mm tabağa 5 ml fibroblast ortamında 4 x 104 hücre tohumlayın. Rho kinaz inhibitörü Y-27632'yi ekleyin.(ROCKi) ile 5 uM'lik bir nihai konsantrasyona getirildi. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Önemli olan, ertesi gün, orta maddeyi E8 orta maddesi olarak değiştirin. E8 ortamını her gün değiştir. HİPS hücre kolonileri 2-3 hafta içinde ortaya çıkacaktır.
3. Kolonilerin toplanması ve hiPS hücrelerinin genişlemesi
NOT: Aşağıdaki adımlar biyogüvenlik kabininin dışında stereo mikroskop altında yapılır. Saç ve prosedür maskelerinin kullanılması önerilir. Hücre kültürünü kirletmemek için dikkatle çalışın.
- Toplama işleminden önceki gün, LN-521 kaplı doku kültürü 24 gözlü plakaları hazırlayın. LN-521'i DPBS'de 0,63 μg / cm2'de seyreltin. Bir 24-iyi doku kültürü plakasının bir oyuğuna 250 uL LN-521 çözeltisi pipetleyin. Parafilm kullanan plakaları mühürleyin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: Koloniler çapı 1 mm'den büyük olduğunda toplama hazırdır. Koloniler keskin kenarları göstermeli ve homojen mon cinsinde büyümeliOlaylayıcılar ( Şekil 2D ). - LN-521 solüsyonunu aspire edin ve bir 24-iyi doku kültürü plakasının bir oyuğuna 500 uL E8 ekleyin.
- Kolonileri, stereomikroskop altında bir ızgara benzeri desenle dikenli bir maketle daha küçük parçalara ayırın. Mekanik olarak çanak hücre sayfalarını kazıyın ve hazırlanmış iyi ( Şekil 2D - 2E ) bir 200 mcL pipet kullanarak sayfaları aktarın. Kolonileri ayrı kuyu içine alın.
- Hücrelerin ortam değiştirmeden 48 saat süreyle bağlanmasına izin verin. Bundan sonra, günlük E8 orta miktarını değiştirin.
- Koloniler 5 mm'den büyük bir boyuta ulaştığında, enzimatik olarak, hücreleri, LN-521 kaplamalı plakanın yeni bir kuyusuna tekli hücreler olarak geçirirler.
- Hücre kültürü ortamı hücrelerinden aspire edin ve 250 μL DPBS ile yıkayın.
- DPBS'yi aspire. Ayrışma reaktif 250 mcL ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
- Hücrelerin yuvarlaklaşmaya başladığını gözlemleyin. ayırmakHücrelerini ayırma reaktifi ile birkaç kez durulama ile plakadan çıkartın.
- 15 mL'lik bir tüpe 500 ul'lik E8 ortamı ekleyin. Ayrışma reaktifi içindeki hücreleri 300 x g'de tüp ve santrifüje 3 dakika aktarın.
- LN-521 önceden kaplanmış kuyu LN-521 solüsyonu aspire edin ve oda sıcaklığı E8 orta 500 ul ekleyin.
- Süpernatantı aspire edin ve hücre topağını E8 orta maddesinin 500 uL'sinde tekrar süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve hazırlanmış LN-521 önceden kaplanmış kuyucuğa (1.25 x 104 - 2.5 x 104 hücre / cm2) 2.5 x 104 - 5 x 104 hücre tohumlayın. Hücre kültürü biçimi, amaçlanan amaca uygun şekilde kolayca büyütülebilir.
- 10 uM'lik bir nihai konsantrasyona ROCKi ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin.
- E8 ortamını her gün değiştir. Hücreler genellikle 4-6 gün sonra geçime hazırdır. Enzimatik olarak hücreleri, tek hücreler halinde, yukarıda anlatıldığı gibi, yaklaşık% 90 birleşimde.
Not: Yeniden programlama vektörleri, hiPS hücre genişlemesi sırasında aşamalı olarak seyreltilir ve geçiş 12'den sonra saptanmaz. Normal olarak yeniden programlanan hücreler yaygın olarak 6-10 pasaj boyunca çoğalmaya veya karakteristik pluripotent kök hücre morfolojisini kaybetmeye son verir ( Şekil 3B ). - HiPPS hücrelerinin dondurulması ve çözülmesi
- Hücreleri dondurmak için, hücreleri enzim yoluyla yukarıdaki gibi tekli hücreler olarak ayırın, hemositometredeki hücreleri sayın ve 1 mL E8 ortamı içeren 15 mL tüp içine 2.5 x 105 hücre aktarın. 300 xg'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire.
- Hücre peletini 250 μL 4 ° C PSC cryomedium içinde süspanse edin ve bir cryovial'a aktarın. Şişeyi dondurucu bir kap içine yerleştirin ve hücreleri -80 ° C'de 24 saat kuluçka almadan önce sıvı nitrojene aktarın ve sonra uzun süre depolayın.
- Hücrelerin çözülmesi için 24 kat doku kültürünün önceden kaplanmış bir LN-521 kuyusunu hazırlayınLN-521 çözeltisini aspire ederek ve 250 uL E8 ortamı ilave ederek plakaya aktarın. Kriyovyalin alt kısmını, yalnızca küçük bir buz saçağı kalana kadar 37 ° C suya batırın.
- Cryovial 250 mcL E8 Medium ekleyin ve hücre süspansiyonu bir 15-mL tüp aktarın ve 1 mL E8 orta ekleyin. 3 dakika 300 x g hücreleri döndürün.
- Süpernatantı çıkarın ve oda sıcaklığı E8 orta 250 mcL içinde hücre peletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hazırlanan kuyuya hücre süspansiyonu aktarın ve% 1 hücre canlılığı ek veya 10 uM ROCKi ekleyin. Doku kültürü plakasını 37 ° C'de inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyopside hiPS hücrelerine kadar
Biyopsiden, kurulmuş hiPS hücrelerine, vektörün yeniden programlanması ve karakterizasyona hazır olanın önündeki tüm süreç yaklaşık 16 hafta sürüyor ( Şekil 1 ). Daha detaylı zaman çizelgesi Şekil 2A'da belirtilmiştir. Fibroblast kültürlerini oluşturmak ve genişletmek için yaklaşık 4 hafta gereklidir. İlk hiPS hücre kolonileri, Sendai vektöründen yaklaşık üç hafta sonra vektör aktarımı yapmaya başladı. Koloniler ilk geçiş için mekanik olarak seçildi ve daha sonra enzimatik olarak tek hücreler olarak pasifleştirildi.
İnsan fibroblast kültürlerinin kurulması
İnsan fibroblast kültürleri, konfluent hale gelmiş ve kabul edilmiş morfoloji gösterdiğinde, önce iki pasaj için genişletilmiş ve dondurulmuşturTransdüksiyon için kaplanmadan önce ( Şekil 2B ).
SeV vektörleri kullanarak insan fibroblastlarının yeniden programlanması
SeV transdüksiyonunu takip eden günlerde artmış hücre ölümü seviyeleri bulundu ve fibroblast morfolojisinde ufak değişiklikler gözlendi. İlk hiPS kolonilerinin ortaya çıkışı transdüksiyon sonrası 12. günden itibaren tespit edildi ( Şekil 2A , 2C ). Toplama hazır olan kolonilerin , transdüksiyon sonrası yaklaşık 3-4 hafta beklenmesi bekleniyor ( Şekil 2A , 2D ). Bu protokolde belirtilen miktarlarda hücrelerin tohumlanması, kolonilerin ortaya çıkmasına neden olmuştur (<20). Uygun morfolojiyi gösteren kolonilerin seçici olarak toplanması önerilir. Koloni özellikleri, düzleştirilmiş kompakt hücre kütlesi, homojen tek tabaka halinde büyüme, ayırt edilebilen indi Çevreleyen fibroblastlara doğru keskin kenarı olan vidual hücreler ( Şekil 2D ). HiPS hücre kolonileri, bir neşter kullanılarak ve mekanik olarak pasifleştirilen ızgara benzeri bir şekilde kesildi ( Şekil 2E ). Seçilen hiPS klonları, orta değişikliğe uğramadan plakaya yapışmak için 48 saat bırakıldı. HiPS hücre klonları oldukça homojendi, ancak yeniden programlama plakasından kaynaklanan az sayıda fibroblast ilk iki geçit boyunca tolere edildi ( Şekil 2F ). Telaşlı sınırlarla kolonilerin seçilmesi ve heterojen, geniş hacimli hücre kütlesi bulunmamalıdır ( Şekil 2G ). Elde edilen hiPS hücre çizgileri, büyük çekirdek-sitoplazma oranına sahip yoğun mono tabakalar halinde büyüdü ve parlak sınırları tanımladı. Buna karşın, bu kriterleri yerine getirmeyen yapışık homojen olmayan koloni, karışık hücre popülasyonlarının kültürlerinden kaçınmak için atılmıştır ( Şekil 2H ).
P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> hiPS hücre klonlarının geçerliliğiTüretilen hücrelerin pluripotens karakterizasyonu SeV vektörü kaybolduktan ve pluripotent durumun korunması endojen faktörlerin ekspresyonu ile yönlendirildikten sonra gerçekleştirildi. HiPS hücre doğrulamasına geçmeden önce SeV vektör ifadesinin kaybolduğundan emin olun. Bu protokolün ardından SeV vektör RNA'sı tecrübelerimize göre 12 pasajı tarafından artık saptanamayacağından karakterizasyona uygun başlangıç noktası ( Şekil 3A ). Pluripotency belirteçleri OCT4, SSEA4 ve NANOG için immünositokimya boyası homojen olarak pozitif bir sonuç vermelidir ( Şekil 3B ). Pluripotens faktörlerini ifade etmeyen kısmen yeniden programlanmış hücreler içeren hücre kültürleri atılmıştır ( Şekil 3C ). Endojen pluripotansiyel genlerin mRNA ekspresyonu, gerçek zamanlı PC ile gösterilir R (RT-PCR) Şekil 3D'de .
Pluripotent kök hücreler üç germ tabakasına kolayca ayırt edebilmelidir. HiPS hücrelerinin farklılaşma potansiyeli Embriyoid cisimlerin (EB) oluşumu ile değerlendirildi 18 . HiPS hücrelerinden üretilen serbest kayan EB'ler Şekil 3E'de gösterilmiş ve EB farklılaşmasmdan 21 gün sonra germ tabakasına özgü belirteçlerin mRNA ekspresyonu Şekil 3F'de gösterilmiştir .
Şekil 1: Cilt Biyopsisinden hiPS Hücrelerine Akış Şeması.
Protokoldeki önemli adımlara genel bakış. Resimde biyopsi toplanması, fibroblastların izolasyonu, SeV transdüksiyonu, kolonilerin toplanması ve hiPS hücrelerinin klonal genişlemesi bulunur.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: hiPS Hücrelerinin Üretilmesinde Kritik Adımlar.
(A) Zaman çizelgesi, fibroblast kaplama, SeV transdüksiyonu, orta değişimler ve kaplamalar dahil protokolde önemli zaman noktalarını vurguluyor. HiPPS hücrelerinin pasajı 12, karakterizasyon deneylerinin başlangıcı olarak vurgulanır. (B) Konfluent fibroblastların tipik morfolojisiyle kültür içindeki parlak alan görüntüsü. (C) Dönüştürülmüş fibroblastlardan hiPS hücre kolonilerinin ortaya çıkışı. (D) Seçici özellikleri, düzleşmiş kompakt hücre kütlesi, çevreleyen fibroblastlara doğru keskin kenarlı ayırt edilebilen bireysel hücreleri (Pasaj 0) gösteren koloni seçmeye hazır. (E) merhabaHücre kolonileri ızgara benzeri bir modelde kesilir ve mekanik olarak pasifleştirilir . (F) Birkaç gün büyümesinden sonra koloni takıldı. Yapışmış hiPS hücreleri, yeniden programlama plakasından kaynaklanan alışılmadık derecede yüksek sayıda fibroblast ile çevrilidir. Fibroblastlar plakadan kazınabilir ve büyük olasılıkla daha sonraki tek hücreli pasajlarla kaybolur (Pasaj 1). (G) Tam olarak yeniden programlanmış hücreleri hatırlatmayan morfolojiyi gösteren sömürgeler; Telaşlı sınırlar, geniş ve sıkışık heterojen hücre kütlesi. (H) Yüksek düzeyde heterojen bir hücre hattına kıyasla, erken geçit homojen tam olarak yeniden programlanmış hiPS hücre hattını örnekleyen parlak alan görüntüsü. Ölçek çubukları 100 μm'yu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: hiPS Hücrelerinin Karakterizasyonu.
(A) SeV vektörüne özgü belirteçlerin RT-PCR'si. Geçiş 3'teki hiPS hücreleri yeniden programlama vektörleri için pozitif kontrol olarak kullanılır. Geçiş 12'de hücreler, virüs spesifik belirteçleri Sendai spesifik omurga (SeV B), Sendai spesifik KLF4 (KLF4 SeV), Sendai spesifik cMYC (cMYC SeV), PCR kontrolü (GAPDH) ve şablon (-) yokluğunda negatiftir. (B) Geçişte tam olarak yeniden programlanmış homojen hiPS hücre hattının temsili örneği. HiPS hücrelerinin parlak alan görüntüsü, hücrelerin dar radyasyon tabakalarında keskin lüminesans kenarları olan ve büyük çekirdekler ve küçük sitoplazmalarla büyüdüğünü ortaya koymaktadır. Pluripotency belirteçleri OCT4, NANOG, SSEA4 ve nükleer boyama 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) immünositokimyasal boyama, homojen pozitif ekspresyonunu gösterdi. (C) pluripotency marker NANOG için heterojen ifade sergileyen hücre hattı. KültürE kısmen yeniden programlanmış hücreler içerir ve atılmalıdır. (D) pluripotency belirteçlerinin NANOG, OCT4, PCR kontrolü (GAPDH) mRNA ekspresyonunun RT-PCR'si ve pluripotens belirteçlerinin ekspresyonunu gösteren şablon (-) yok. (E) hiPS hücrelerinden üretilen yüzen serbest embryoit cisimler. (F) 21 günlük embriyoid vücut farklılaştırmasından sonra RT-PCR, türetilen hiPS hücrelerinin üç germ tabakasına farklılaşabildiğini göstermektedir. Endodermal belirteçler AFP ve GATA4, mezodermal belirteçler RUNX ve HAND1, ektodermal işaretleyiciler NCAM ve NESTIN, PCR kontrolü (GAPDH) ve şablon yok (-). Ölçek çubukları 100 μm'yu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün beklenen sonucu birkaç klonla türetilmiş hiPS hücre hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesidir. Önemlisi, burada açıklanan hiPS hücrelerinin bakımı ve genişletilmesi için yöntem güvenilirdir ve kök hücre kültürü için az önceki deneyimle yapılabilir. ROCKi'nin LN-521 matrisiyle birlikte enzimatik tek hücreli geçişi, hücreleri karyotipik olarak normal, pluripotent olarak muhafaza ettiği bilinmektedir ve koloni bazlı geçidin 10 , 19 , 20'yi tetikleyebileceği indüklenen heterojeniteden kaçınarak kolayca ayırt edebilmektedir. LN-521 üzerinde üretilen hiPS hücreleri, ROCKi 10 ilavesi olmaksızın tek hücreli olarak pasajlanabilir, ancak ROCKI ilavesi protokolü daha az deneyimli kişiler için daha kolay hale getirir ve hiPS hücre türetmesi için gereken süreyi azaltır.
Yeniden programlama verimliliğiBu protokol ile neredeyse hiç bir sorun değil; SeV vektörleri, fibroblastlar 11 için nispeten yüksek yeniden programlama etkinliği>% 1'e sahiptir. Kolonilerin bolluğunun (<20) ortaya çıkması bekleniyor. Gerekli sömürge sayısının üç katını seçmeniz önerilir. Toplanan klonların bir kısmının toplama işleminden sonra yapışmadığı gözlenmiştir. Kısmen yeniden programlanmış kolonileri telafi etmek için ekstra kolonilere ihtiyaç duyulabilir. Kısmen yeniden programlanmış koloniler, bazı durumlarda SeV vektörleri ile pluripotens genlerin eksojen olarak eksprese edilmesiyle desteklenebilir ve büyüyebilir. SeV vektörleri seyreltildiğinde, bu hücreler yaygın olarak 6-8 pasajında görülen proliferasyon ve ayrışmayı durdururlar. Kültürün heterojenliği kısmi yeniden programlamanın bir işaretidir ve heterojen çizgiler atılmalıdır ( Şekil 2H ).
Yeniden programlama vektörü ve kültür koşullarının optimal seçimi,Üretilen hücrelerin amacı. Bununla birlikte, toplu iş aralıklarının sonuçlara etki etmesini önlemek için tanımlanmış koşullar önerilir. Entegre edilmeyen bir vektör sisteminin seçimi, yeniden programlanmış hücrelerin genetik bütünlüğünü korumak için önerilir. SeV vektörleri sağlamlık, nispeten yüksek verimlilik ve düşük el süreleri nedeniyle bu protokolde seçilmiştir. SeV vektörleri hücre bölünmeleri sırasında seyreltilir ve geçit 12 civarında saptanamaz, böylece üretilen verilerin dışsal ifade ile etkilenmemesi sağlanır. Klinik amaçlar için tasarlanmış hücrelere verilen titiz talepler nedeniyle SeV yeniden programlama, tüm vektör materyalinin tamamen dökülmesinin zor olduğunu kanıtlamak için klinik çeviri için bir engel olabilir. Hücre terapisinde amaçlanan kullanımı ile hücrelerin türetilmesi mRNA aracılı reprogramming avantajlı olabilir 12 . Ancak bu yöntemler, emek gerektiren ve kullanımı daha da karmaşıktır. Yöntem buradaFibroblast kültürü için yazılmış olan klinik uygulamalar da klinik uygulamalar için uygun değildir. Hem FBS hem de jelatin, xenogenik ve tanımlanmamış olduğundan, bunları tanımlanmış xeno içermeyen ürünlerle değiştirmeyi düşünün 22 .
Herhangi bir hücre kültürü formuyla çalışırken steril taşıma teknikleri ve düzenli mikoplazma enfeksiyon testi önerilir. İnsan derisi, hücrelerin düzgün bir şekilde işlenmemesi durumunda kültüre edildiği koşullarda gelişebilecek birçok mikroorganizma içerir. Bu nedenle, cilt biyopsilerinin işlenmesinde ve biyopsi işlemesinden sonra kültürlerin ilk günlerinde daha dikkatli olmanız önerilir. Cilt biyopsilerinden fibroblast kültürünün oluşturulması aslında zaman alan bir işlemdir. Cilt biyopsisini işledikten sonra başlangıçta fibroblast hücrelerinin yapışkanlık zayıf işaretleri olacak, bu nedenle kültürde beklenen morfolojiyi gösteren birkaç fibroblast hücresi bulmak için en az bir hafta bekleyin. Fibroblastların oluşturulması için gereken süreBiyopsi yapılan in vitro kültürler, biyopsi büyüklüğü, vericinin yaşı ve biyopsinin alınmasından beri nasıl ele alındığı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Optimal yeniden programlama etkinliği için erken geçiş fibroblastlarını yeniden programlamak tercih edilir 23 .
Özetle, burada, oldukça homojen hiPS hücreleri üretmek için kurulmuş sağlam ve kullanımı kolay bir yöntem açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rapor etmek için çıkar çatışmasına sahip değiller.
Acknowledgments
Bu çalışma SSF (B13-0074) ve VINNOVA (2016-04134) finansman ajanları tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 mL tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 mL tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 mL | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Sealing plates for storage |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
