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Biochemistry

ठहराव की बहुतायत और चार्ज करने के स्तर के हस्तांतरण RNAs में ई कोलाई

Published: August 22, 2017 doi: 10.3791/56212
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Copenhagen

Summary

यहाँ हम सीधे हस्तांतरण शाही सेना के स्तर के साथ-साथ हस्तांतरण आरएनए, या किसी अन्य लघु आरएनए के सापेक्ष स्तर की तुलना करने के लिए एक तरीका है, स्पाइक के अलावा के आधार पर विभिन्न नमूनों के साथ-साथ स्थानांतरण आरएनए चार्ज स्तरों को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत एक संदर्भ जीन व्यक्त कोशिकाओं ।

Abstract

स्थानांतरण आरएनए (tRNA) किसी भी जीव में शोधों की मशीनरी का एक अनिवार्य हिस्सा है । tRNAs बाँध और अनुवाद ribosome करने के लिए अमीनो एसिड हस्तांतरण. अलग tRNAs के सापेक्ष स्तर, और कुल tRNA के लिए aminoacylated tRNA के अनुपात, चार्ज स्तर के रूप में जाना जाता है, सटीकता और अनुवाद की गति निर्धारित करने में महत्वपूर्ण कारक हैं । इसलिए, बहुतायत और tRNAs के स्तर चार्ज महत्वपूर्ण चर को मापने जब प्रोटीन संश्लेषण का अध्ययन कर रहे हैं, विभिंन तनाव की स्थिति के तहत उदाहरण के लिए । यहां, हम कटाई tRNA के लिए एक विधि का वर्णन और सीधे दोनों रिश्तेदार बहुतायत और ई कोलाईमें विशिष्ट tRNA प्रजातियों के निरपेक्ष चार्ज स्तर को मापने । tRNA को इस तरह से काटा जाता है कि tRNA और उसके अमीनो अम्ल के बीच labile बंधन को संरक्षित रखा जाता है । आरएनए तो जेल ट्रो और उत्तरी सोख्ता, जो आरोप लगाया और uncharged tRNAs की जुदाई में परिणाम के अधीन है । विभिन्न नमूनों में विशिष्ट tRNAs का स्तर सामान्यीकरण के लिए स्पाइक-इन कक्षों के अतिरिक्त होने के कारण तुलना की जा सकती है. आरएनए शुद्धि करने से पहले, हम ई. कोलाई कोशिकाओं है कि प्रत्येक नमूने के लिए दुर्लभ tRNAselC reproducing के 5% जोड़ें । इसके बाद एक नमूने में ब्याज की tRNA प्रजातियों की मात्रा को एक ही नमूने में tRNAselC की मात्रा को सामान्यीकृत कर लिया जाता है । स्पाइक के अलावा-इन कोशिकाओं में आरएनए शुद्धि से पहले, यह भी नमूने के बीच सेल lysis दक्षता में किसी भी मतभेद के लिए खातों कि शुद्ध स्पाइक के अलावा अधिक लाभ है RNAs में ।

Introduction

निंनलिखित में, हम विशिष्ट tRNAs को बढ़ाता है और उत्तरी सोख्ता द्वारा उनके चार्ज स्तरों को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि एक पहली Varshney एट अल द्वारा विकसित की तकनीक पर आधारित है । 1. trichloroacetic एसिड (टीसीए) में कोशिकाओं की कटाई और आरएनए शुद्धि भर में 0 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों रखने के द्वारा, tRNA और एमिनो एसिड के बीच एस्टर बांड2,3,4संरक्षित है । Aminoacylated tRNAs जेल ट्रो और उत्तरी सोख्ता द्वारा अपने nonacylated समकक्षों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जेल में Aminoacylated tRNA की कमी गतिशीलता के कारण, covalently बाउंड अमीनो एसिड की वजह से5. इसके अतिरिक्त, हम tRNA मात्रा में स्पाइक-इन कोशिकाओं के अलावा शायद ही कभी इस्तेमाल किया tRNAselC 4का उपयोग करके सामांय के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।

tRNAs जीवाणु कोशिका में सबसे प्रचुर मात्रा में अणुओं और अनुवाद मशीनरी का एक बिल्कुल महत्वपूर्ण हिस्सा हैं । tRNAs अमीनो एसिड बाँध और अनुवाद ribosomes करने के लिए उन्हें हस्तांतरण. अमीनो अम्ल की बाइंडिंग को tRNAs (aminoacylation या चार्जिंग) को aminoacyl tRNA synthetases द्वारा सुकर बनाया जाता है. विभिंन आरोप लगाया tRNAs के सापेक्ष बहुतायत प्रोटीन संश्लेषण की निष्ठा को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि cognate के प्रतिनिधित्व एक दी दूत आरएनए (mRNA) codon के लिए आरोप लगाया tRNA संभावना बढ़ जाती है कि एक के पास-cognate tRNA होगा ग़लती से ribosome6पर बढ़ती पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के लिए अपने एमिनो एसिड उद्धार । शुल्क tRNA के महत्व को एक tRNA के चार्ज स्तरों में एक गंभीर गिरावट के लिए ई. कोलाई सेल की व्यापक प्रतिक्रिया में परिलक्षित होता है; कड़े जवाब । कड़े जवाब के दौरान tRNAs के संश्लेषण, राइबोसोमल RNAs और सबसे mRNAs विशिष्ट एमिनो एसिड के साथ जुड़े mRNAs की प्रतिलेखन के पक्ष में कम है और तनाव से बचने, और कोशिकाओं की वृद्धि दर नाटकीय रूप से कम है7 . इसके अलावा, हमारे द्वारा हाल ही में काम और दूसरों को पता चला है कि ई. कोलाई सक्रिय रूप से प्रतिक्रिया में अपने tRNA के बहुमत को नीचा दिखा दिया है कि सीमा अनुवाद4,8, सुझाव है कि tRNA स्तर के समायोजन हो सकता है ऐसे तनावों से मुकाबला करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, tRNA बहुतायत और चार्ज स्तरों के विश्वसनीय माप पूरी तरह से बैक्टीरियल तनाव प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा ।

ई. कोलाई आमतौर पर संयोजक प्रोटीन और प्रजातियों के बीच codon उपयोग में अंतर के कारण व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इष्टतम अभिव्यक्ति एक समस्या अक्सर9का सामना करना पड़ा है । यह अतिरिक्त tRNAs की अभिव्यक्ति से दरकिनार किया जा सकता है संयोजक mRNA10अनुवाद की जरूरत है । ऐसे उपभेदों में tRNA चार्ज स्तरों की माप समस्या निवारण के प्रयासों का मार्गदर्शन और मदद का अनुकूलन प्रोटीन अभिव्यक्ति सकता है ।

इस विधि भी "का निर्वहन" का पता लगाने में सक्षम बनाता है; एक tRNA अणु एक गैर cognate एमिनो एसिड के साथ aminoacylated । अलग एमिनो एसिड द्वारा Aminoacylation एक tRNA polyacrylamide जैल1,11के माध्यम से थोड़ा अलग वेग के साथ स्थानांतरित करने के लिए कारण हो सकता है । कुछ मामलों में, विधि भी अन्यथा समान tRNAs पर विभिन्न संशोधन पैटर्न भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता3.

tRNA चार्ज स्तरों की जांच के लिए एक और स्थापित जैव रासायनिक प्रक्रिया periodate ऑक्सीकरण है । विधि अवलोकन कि aminoacylated tRNA periodate ऑक्सीकरण और uncharged tRNA से सुरक्षित नहीं है पर निर्भर करता है । tRNA के रिचार्जिंग periodate ऑक्सीकरण उपचार के बाद काटा आरएनए के चार्ज स्तरों का अनुमान लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, कई tRNAs के रिचार्जिंग इस प्रकार कुछ अशुद्धि12उपलब्ध कराने के उपचार से प्रभावित होना दिखाया गया है । विधि यहां प्रस्तुत उपायों शुद्ध आरएनए से सीधे चार्ज, इस प्रकार रासायनिक या एंजाइमी प्रतिक्रियाओं से किसी भी पूर्वाग्रह को छोड़कर । इस विधि की एक सीमा है कि केवल एक tRNA प्रजातियों एक समय में पता चला है, इसलिए हालांकि एक ही उत्तरी दाग छीन लिया जा सकता है और कई tRNAs के लिए फिर से जांच की, यह समय लेने वाली है और कुछ हद तक tRNAs पर डेटा इकट्ठा करने के लिए श्रमसाध्य है ।

एक दूसरे के लिए नमूनों को सामान्य करने का एक विश्वसनीय तरीका है जहां लक्ष्य विभिन्न नमूनों में एक अणु के सापेक्ष स्तर की तुलना करने के लिए है अध्ययन में महत्वपूर्ण है. यहां हम आरएनए के लिए एक सामान्यता प्रक्रिया का परिचय देते हैं जहां दुर्लभ tRNAselC को व्यक्त करने वाले ई. कोलाई कोशिकाओं की एक छोटी सी aliquot को आरएनए शुद्धि से पहले सभी प्रायोगिक नमूनों में स्पाइक के रूप में जोड़ा जाता है । इस विधि जब प्रयोगात्मक सेटअप ऐसी है कि कोई अंतर्जात आरएनए सभी नमूनों में एक ही सेलुलर एकाग्रता पर उपस्थित होने के लिए भरोसा किया जा सकता है जब tRNAs की जांच लेकिन आरएनए के किसी भी प्रजाति के रिश्तेदार ठहराव के लिए उपयोगी है । उदाहरण के लिए, एक "गृह व्यवस्था" आरएनए की तरह राइबोसोमल आरएनए का स्तर अक्सर एक अंतर्जात संदर्भ के रूप में विभिन्न नमूनों के बीच एक और आरएनए के सापेक्ष मात्रा13की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. लेकिन इस छोटे से उपयोग की है अगर संदर्भ आरएनए के सेलुलर एकाग्रता नमूनों के बीच बदलता है, राइबोसोमल आरएनए के लिए मामला हो सकता है के रूप में अगर नमूना एक तनाव प्रतिक्रिया के दौरान होता है15,16,17 या दौरान स्थिर चरण17में प्रवेश । कील-आरएनए शुद्धि करने से पहले प्रयोगात्मक नमूनों को स्पाइक में कोशिकाओं के अलावा नमूना सेटअप के स्वतंत्र सामान्यीकरण का एक ठोस और सही तरीका प्रदान करता है. मानकीकरण का एक अन्य तरीका आरएनए शुद्धि के बाद प्रयोगात्मक नमूनों को RNAs में एक या अधिक स्पाइक के अलावा है. हालांकि, इस विधि के नमूनों के बीच आरएनए वसूली में किसी भी अंतर के लिए खाता नहीं है ।

ई. कोलाई कोशिकाओं का प्रयोग जो संदर्भ आरएनए को स्पाइक-इन कोशिकाओं के रूप में व्यक्त करता है ( चित्रा 1) ई. कोलाई पर एक प्रयोग में यह दोष है कि यह exogenous ई. कोलाई कुल आरएनए की एक छोटी राशि के अतिरिक्त परिणाम है नमूने. हम प्रयोगात्मक नमूनों के साथ समानांतर में कोशिकाओं में केवल स्पाइक युक्त नमूने का विश्लेषण करके इस इसके अलावा के लिए सही ( चित्रा 2में उत्तरी दाग देखें, लेन लेबल "selC"). प्रस्तुत प्रोटोकॉल ई. कोलाई K-12 के लिए विकसित की है, लेकिन सबसे जीवाणु प्रजातियों के लिए लागू होने की संभावना है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. बैक्टीरियल संस्कृतियों की तैयारी ।

  1. एक संस्कृति के साथ Erlenmeyer कुप्पी में सभी संस्कृतियों बढ़ने/सबसे अधिक 1/6 पर की कुप्पी मात्रा अनुपात । एक ठेठ प्रयोगात्मक सेटअप में, ३७.० & #176 पर संस्कृतियों बढ़ती है; सी और morpholinepropanesulfonic एसिड में १६० rpm पर मिलाते हुए (MOPS) मिनिमल मीडियम < सुप वर्ग = "xref" > 18 पसंदीदा कार्बन स्रोत के साथ पूरक, उदाहरण के लिए ०.२% ग्लूकोज, के लिए कम से कम 10 लगातार पीढ़ियों से पहले आरएनए हार्वेस्ट.
    2. आरएनए हार्वेस्ट से पहले दिन
  2. , इस तरह से है कि यह वांछित आयुध डिपो ४३६ इच्छित समय पर अगले दिन पर पहुंच जाएगा में MOPS ंयूनतम माध्यम में वांछित तनाव के एक बड़ा संस्कृति पतला । वृद्धि हुई संस्कृति की मात्रा की गणना सूत्र द्वारा टीका के लिए उपयोग करने के लिए:
    < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56212/56212eq1.jpg"/>
    नोट: इथे, ओडी नये अर्थो को चाही ओडी ४३६ गर्मी के बाद, वी नई पतला संस्कृति की मात्रा का अर्थ है, आयुध डिपो पुराने का अर्थ है कि आयुध डिपो ४३६ से बाहर हो गई संस्कृति के पतला , जी अर्थ पीढ़ियों की संख्या में वृद्धि होगी संस्कृति, से कमजोर पड़ने के समय (t 1 ) समय के बाद यह दिन की जरूरत है (टी 2 ) और के रूप में गणना की जा सकती है: समय अंतर (मिनट में) टी 1 और टी 2 पीढ़ी समय (मिनट में) द्वारा विभाजित के बीच । सैंपलिंग के समय स्थिर-राज्य वृद्धि सुनिश्चित करना, G होना चाहिए & #8805; 10; वी ओल्ड ने आउट-उगी संस्कृति की मात्रा को ध्यान में रखें जिसे ताजा माध्यम को हस्तांतरित किया जाना चाहिए । यह समीकरण एक सन्निकटन है जो किसी भी अंतराल चरण के लिए खाता नहीं है; एक घटना अक्सर ताजा मीडिया में एक बाहर विकसित संस्कृति के कमजोर पड़ने के बाद मनाया ।
    1. वृद्धि की स्थिति प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर भिन्न होगी, लेकिन tRNA स्तर में सेल-टू-सेल भिन्नता को सीमित करने के लिए और परिणामों की reproducibility को बढ़ाने के लिए, (अनुशंसित) नमूने से पहले राज्य को स्थिर करने के लिए संस्कृतियों के बढ़ने < सुप वर्ग = "xref" > 19 .
< p class = "jove_title" > 2. स्पाइक-इन कक्षों को तैयार करना

< p class = "jove_content" > नोट: द ई. कोलाई तनाव MAS1074, जो selC जीन एन्कोडिंग tRNA selC के नियंत्रण के तहत एक isopropyl & #946;-d -1-thiogalactopyranoside (IPTG)- inducible प्रमोटर स्पाइक के रूप में प्रयोग किया जाता है-तनाव में ।

  1. MAS1074 के एक आयुध डिपो ४३६ में ०.०५ के MOPS ंयूनतम मध्यम १०० & #181; g/एमएल एम्पीसिलीन और ०.२% ग्लूकोज के साथ पूरक के लिए एक ऊंचा संस्कृति पतला । ३७ पर संस्कृति बढ़ती & #176; ग मिलाते हुए १६० आरपीएम पर.
    नोट: एक वैकल्पिक संदर्भ दबाव के उपयोग के लिए चर्चा देखें ।
  2. पर आयुध डिपो ४३६ ~ ०.१, 1 मिमी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG जोड़ने के लिए tRNA selC की अभिव्यक्ति प्रेरित । ४३६ ~ ०.५ (विकास के ~ 3-4 एच) और एक बर्फ स्नान करने के लिए संस्कृति कुप्पी ले जाने के लिए संस्कृति हो जाना । कील-सेल संस्कृति में बर्फ पर रखें जब तक आरएनए शुद्धि के लिए सभी नमूनों को काटा गया है ।
< p class = "jove_title" > 3. प्रयोगात्मक नमूनों की फसल.

  1. प्री-वार्म (३७ & #176; ग) एक छाया हुआ १०० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी (या इसी तरह) 4 मिलीलीटर 10% (डब्ल्यू/वी) trichloroacetic एसिड (टीसीए) एक नमूना के लिए यह एक गर्म पानी में रखकर स्नान से युक्त ।
    नोट: सावधानी , ताप, हाइड्रोजन क्लोराइड और क्लोरोफॉर्म सहित विषाक्त और संक्षारक धुएं के उत्पादन पर टीसीए मिटता है । पानी में समाधान एक मजबूत एसिड है; यह अड्डों के साथ हिंसक प्रतिक्रिया करता है और कई धातुओं के लिए संक्षारक है । इस तरल.
    2. का उपयोग करते समय उचित एहतियात बरतना चाहिए ।
  2. तुरंत पहले सेल हार्वेस्ट करने के लिए, माप और आयुध डिपो ४३६ संस्कृति के .
  3. कोशिकाओं की कटाई करने के लिए, 4 मिलीलीटर संस्कृति का हस्तांतरण करने के लिए एक पूर्व की गर्म कुप्पी जिसमें टीसीए.
  4. मिश्रण से कुप्पी तक हाथ से घूमता हुआ 5 एस के लिए नमूना मिक्स करें । टीसीए के साथ मिश्रण तुरंत सभी एंजाइमी गतिविधियों को अक्षम करता है और इस तरह tRNAs के चार्ज स्तरों को बरकरार रखता है.
    नोट: यदि एक से अधिक नमूने एकत्र किए जाने हैं, तो सभी नमूनों को एकत्र किए जाने तक, बर्फ पर टीसीए में काटा गया नमूने रखें.
< p class = "jove_title" > 4. इसके अलावा स्पाइक-इन कोशिकाओं में

< p class = "jove_content" > नोट: स्पाइक-इन कक्षों की तैयारी चरण 2 में बताई गई है ।

  1. जब आरएनए तैयार करने के लिए सभी नमूने एकत्र किए गए हैं, तो प्रत्येक नमूने के लिए 5% स्पाइक-इन सेल (ओडी पर आधारित) जोड़ें ।
    नोट: स्पाइक-कोशिका में आवश्यक संस्कृति की मात्रा सूत्र द्वारा परिकलित की जाती है:
    < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56212/56212eq2.jpg"/>
    जहां वी स्पाइक स्पाइक की मात्रा में कोशिका संस्कृति की जरूरत का अर्थ है, वी exp (टीसीए) के बिना कटाई प्रयोगात्मक कोशिका संस्कृति की मात्रा को नोट करें, आयुध डिपो exp ने टीसीए में फसल के समय प्रयोगात्मक कोशिका संस्कृति के आयुध डिपो ४३६ का अर्थ होता है । ओडी स्पाइक स्पाइक-इन सेल कल्चर के ओडी ४३६ का अर्थ है । विभिन्न ODs में कई नमूनों काटा जाता है, तो स्पाइक-इन कोशिकाओं में जोड़ा मात्रा प्रत्येक नमूने के लिए ऊपर के सूत्र के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए ।
  2. की आरएनए प्रजातियों के लिए स्पाइक-इन कोशिकाओं से योगदान का अंदाजा लगाने के लिए, 4 एमएल टीसीए के साथ 4 मिलीलीटर स्पाइक कोशिकाओं में मिश्रण से केवल स्पाइक-इन कक्षों युक्त एक नमूना तैयार करें । अन्य नमूनों के लिए के रूप में एक ही रास्ते में इस नमूने से आरएनए तैयार करें.
  3. वैकल्पिक रूप से, केवल प्रयोगात्मक नमूना युक्त एक और कुप्पी ले, स्पाइक में कोशिकाओं के बिना, और यह tRNA selC स्तर के लिए प्रयोगात्मक नमूना के योगदान का अंदाजा लगाने के लिए शामिल हैं; अंतर्जात tRNA के selC के स्तर ई. कोलाई K-12 are negligibly कम.
< p class = "jove_title" > 5. आरएनए की तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: आरएनए तैयारी प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है मूलतः है कि Varshney एट अल द्वारा वर्णित है. < सुप वर्ग = "xref" > १ ; शुद्धि के दौरान aminoacylated tRNAs के deacylation से बचने के लिए यह आवश्यक है कि नमूनों को अम्लीय पीएच पर रखें और 0 & #176 पर शुद्धि के दौरान सी; उपयोग साफ बाँझ ट्यूबों/नमूने और समाधान पकड़ करने के लिए, और ultrapure के साथ सभी समाधान तैयार (१८.२ M & #937; & #183; सेमी प्रतिरोधकता) पाणी.

  1. एक बर्फ ठंडा केंद्रापसारक ट्यूब में प्रत्येक नमूने के 8 मिलीलीटर डालना । ९,५०० पर 10 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक x g पर 4 & #176; C. पूरी तरह से निकालें supernatant और ०.३ मिलीलीटर ठंड ०.३ एम सोडियम एसीटेट, पीएच ४.५ और 10 मिमी EDTA में reसस्पैंड ।
  2. एक कोल्ड १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए प्रत्येक नमूने हस्तांतरण और एक ही बफर के साथ ०.३ मिलीलीटर phenol equilibrated जोड़ें ।
    नोट: सावधानी , phenol विषाक्त धुएं का उत्पादन और त्वचा के लिए अत्यधिक संक्षारक है ।
  3. भंवर प्रत्येक नमूने के लिए 10x 15 एस के साथ एक भंवर के बीच कम से कम 1 मिनट । बीच में नमूने रखने के लिए 0 & #176; ग. लगातार ठहरावों का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूने ठंडे रहते हैं ।
    4. 15 मिनट के लिए
  4. केंद्रापसारक नमूने पर २०,००० x g पर 4 & #176; C. स्थानांतरण जल चरण (ऊपरी चरण) के लिए नई १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों । पहले की तरह ०.३ मिलीलीटर कोल्ड phenol और भंवर 4x 15 एस जोड़ें ।
    5. 10 मिनट के लिए
  5. केंद्रापसारक पर २०,००० x g पर 4 & #176; C. स्थानांतरण जल चरण नए, शीत १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों युक्त २.५ गुना ९६% इथेनॉल की मात्रा (~ ७५० & #181; L) । 1 ज पर-20 & #176; c या रात भर पर-८० & #176; c.
    6. के लिए ट्यूबों की मशीन द्वारा आरएनए 30 मिनट के लिए
  6. केंद्रापसारक नमूने पर २०,००० x g पर 4 & #176; C. supernatant त्यागें और ध्यान से आरएनए गोली परेशान बिना 1 मिलीलीटर ठंड ७०% इथेनॉल जोड़ें । धीरे एक बार पलटना इथेनॉल के साथ ट्यूबों के अंदर धोने के लिए ।
    नोट: गोली इस कदम पर देखना मुश्किल हो सकता है ।
    7. 10 मिनट के लिए
  7. केंद्रापसारक पर २०,००० x g पर 4 & #176; C. पूरी तरह से हटाने के supernatant और हवा सूखी गोली जब तक कोई इथेनॉल छोड़ दिया है । 20 में जोरदार भंवर ने गोली से किया सस्पेंड & #181; एल कोल्ड १० एमएम सोडियम एसीटेट पीएच ४.५ व 1 एमएम EDTA.
    नोट: नहीं ओवर-सूखी गोली के रूप में इसे reसस्पेंड करने के लिए मुश्किल हो जाएगा ।
  8. वैकल्पिक, २६० एनएम पर अवशोषक को मापने के द्वारा आरएनए की एकाग्रता का आकलन ।
  9. वैकल्पिक रूप से, agarose जेल द्वारा शुद्ध आरएनए की गुणवत्ता का आकलन ट्रो < सुप वर्ग = "xref" > २० .
  10. Store samples at-८० & #176; C.
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
< p वर्ग= "jove_title" > 6. रासायनिक deacylated नियंत्रण नमूना की तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: उत्तरी दाग पर अपने deacylated समकक्ष से aminoacylated tRNA के बैंड को अलग करने के लिए, एक रासायनिक deacylated aliquot क्षारीय उपचार द्वारा तैयार किया जाता है । अधिकांश प्रयोजनों के लिए, यह प्रत्येक उत्तरी दाग के लिए एक एकल नमूना deacylate करने के लिए पर्याप्त है ।

  1. गल आरएनए का नमूना बर्फ पर । एक नई ट्यूब के लिए आरएनए नमूना के एक 4 & #181; L aliquot स्थानांतरण. Add ४६ & #181; L Tris-HCl pH ९.०. ३७ & #176 पर 2 ज के लिए मशीन; C.
  2. add 15 & #181; ०.३ एम सोडियम एसीटेट के पीएच ४.५ पर एल और बाद में ९६% इथेनॉल के १२५ & #181; l जोड़ें । हाला आरएनए at-20 & #176; ग फॉर 1 ज.
    3. 30 मिनट के लिए
  3. केंद्रापसारक पर २०,००० x g पर 4 & #176; C. पूरी तरह से निकालें supernatant और 4 में reसस्पैंड & #181; L शीत 10 मिमी सोडियम एसीटेट पीएच ४.५ और 1 मिमी EDTA.
    नोट: यदि नमूना पर संग्रहित किया जाता है, तो प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है-८० & #176; C.
< p class = "jove_title" > 7. जेल ट्रो और उत्तरी सोख्ता

  1. Mix 4 & #181; l नमूना (अनुपचारित या रासायनिक deacylated) के साथ 6 & #181; l लदान बफर (०.१ मीटर सोडियम एसीटेट (पीएच ५.०), 8 एम यूरिया, ०.०५% bromophenol नीला, और ०.०५% xylene cyanol).
    नोट: केवल स्पाइक-इन कक्षों वाले नमूने को शामिल करना याद रखें, रासायनिक रूप से deacylated नमूना (और स्पाइक-इन कक्षों के बिना नमूना, यदि एक तैयार किया गया हो).
  2. एक ०.४ मिमी मोटी ६.५% polyacrylamide जेल (19:1 acrylam-आईडीई: bisacrylamide) से ०.१ एम सोडियम एसीटेट बफर (पीएच ५.०) में 8 मीटर यूरिया युक्त पर नमूने लोड । tRNA प्रजातियों की उचित जुदाई के लिए ६० सेमी लंबे जैल का प्रयोग करें ।
    3. 4 & #176 पर 10 वी/सेमी जेल में ट्रो द्वारा आरएनए अलग
  3. , जब तक bromophenol ब्लू जेल (~ 20 एच) के नीचे पहुंचता है ।
  4. xylene cyanol डाई और bromophenol नीले रंग की ओर 20 सेमी नीचे से क्षेत्र सोख्ता के लिए प्रयोग किया जाता है (दो रंजक के बीच की दूरी 25-30 सेमी होना चाहिए) । सावधानी से दो गिलास प्लेटें अलग, ताकि जेल उनमें से एक पर रहता है । फिल्टर कागज की एक पतली टुकड़ा वांछित सोख्ता क्षेत्र के आकार को काट दिया है और जेल है कि सोख्ता के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के भाग के शीर्ष पर रखा गया है । जेल है कि फिल्टर कागज से कवर नहीं कर रहे है के भागों काट रहे है और खारिज कर दिया । & #160; ध्यान से जेल टुकड़ा कांच की थाली से दूर उठाने के लिए फिल्टर कागज का उपयोग करें ।
    नोट: बड़ी जेल बहुत नाजुक है तो देखभाल के साथ संभाल ।
  5. एक सकारात्मक आरोप लगाया नायलॉन झिल्ली (जैसे Hybond N + झिल्ली) जेल के शीर्ष पर रखा गया है और यह ९० मिनट के लिए ४० mm electroblotted-Tris (पीएच ८.१), 2 मिमी एसीटेट के रूप में स्थानांतरण बफर का उपयोग कर 20 वी पर EDTA है ।
  6. Crosslink (०.१२ J/सेमी 2 ) का उपयोग कर झिल्ली को आरएनए.
    नोट: झिल्ली अब कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 8. जांचों का डिजाइन व सत्यापन

< p class = "jove_content" > नोट: सावधान डिजाइन और उत्तरी दाग जांच के सत्यापन के लिए विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने और अंय आरएनए प्रजातियों के साथ अवांछित पार संकरण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।

  1. जांच के रूप में लघु सिंथेटिक oligonucleotides का उपयोग करें । एक तरीका है कि यह ब्याज की tRNA के अनुक्रम का सबसे अनूठा भाग के पूरक है में जांच अनुक्रम डिजाइन-यह अक्सर anticodon पाश है ।
    नोट: विभिन्न जीवों से अनुमानित tRNA अनुक्रम की एक सूची में पाया जा सकता है जीनोमिक tRNA डाटाबेस (GtRNAdb) < सुप क्लास = "xref" > 21 .
  2. 55-65 के पिघलने तापमान की भविष्यवाणी प्राप्त करने के लिए अनुक्रम की लंबाई समायोजित करें & #176; ग.
  3. विस्फोट (बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण) प्रयोग में प्रयुक्त बैक्टीरियल तनाव के जीनोम अनुक्रम के खिलाफ चुना अनुक्रम, सत्यापित करने के लिए कि अनुक्रम चयनित tRNA के लिए अद्वितीय है, के रूप में वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > २२ .
    नोट: तालिका 1 सूचियों ई. कोलाई K12 के कई विभिन्न tRNAs के लिए जांच दृश्यों का सुझाव दिया । यदि जांच हित के tRNA के लिए विशिष्ट है, केवल दो बैंड उत्तरी दाग पर दिखाई दे रहे है (चार्ज और uncharged tRNA) और deacylated नमूना (uncharged tRNA) के साथ लेन में केवल एक बैंड दिखाई दे रहा है । यदि दो से अधिक बैंड मौजूद है या जांच विशिष्टता के आगे सत्यापन वांछित है, चर्चा देखें ।
< p class = "jove_title" > 9. संकरण उत्तरी ब्लाटर

< p class = "jove_content" > नोट: निम्न चरणों में, झिल्ली क्रमिक रूप से एक संदर्भ के लिए विशिष्ट जांच सहित वांछित विशिष्ट tRNAs, के पूरक जांच के साथ संकर है tRNA selC .

  1. एक संकरण ट्यूब में झिल्ली जगह और 6 मिलीलीटर संकरण समाधान जोड़ें (०.९ एम NaCl, ०.०५ M णः 2 पो 4 (pH ७.७), 5 mM EDTA, ०.५% (w/v) एसडीएस, १०० mg/मिली-कतरनी और विकृत मछली शुक्राणु डीएनए और 5x Denhardt & #39; s समाधान (100x Denhardt & #39; s समाधान = 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, 2% polyvinylpyrrolidone ४०, और 2% Ficoll)).
  2. पूर्व-संकरण पर 1 ज घूर्णन के लिए बफर में झिल्ली ४२ & #176; ग. जोड़ 30 pmol रेडियोधर्मी oligo-डीएनए जांच 5 & #39;-end- ३२ P के साथ लेबल (Sambrook एट अल. द्वारा वर्णित के रूप में तैयार < सुप वर्ग = "xref" > 23 )
    नोट: सावधानी, ३२ पी से उच्च ऊर्जा बीटा उत्सर्जन एक पर्याप्त त्वचा और नेत्र खुराक खतरा मौजूद कर सकते हैं । ३२ P. रेडियोधर्मी अपशिष्ट का उपयोग करते समय उचित एहतियाती कार्रवाई की जानी चाहिए उचित संस्थागत सुरक्षा प्रोटोकॉल के अनुसार का निपटारा किया जाना चाहिए ।
  3. रात भर झिल्ली के साथ जांच मशीन ४२ पर घूर्णन & #176; C. जांच निकालें डिस्पोजेबल का उपयोग कर 10 मिलीलीटर पिपेट.
    नोट: यदि एक फ्रीजर जांच में संग्रहित किया जा सकता है ।
    4. संकरण ट्यूब में
  4. , जल्दी ही ०.३ मीटर NaCl, 30 मिमी सोडियम साइट्रेट, ०.१% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस के कमरे के तापमान पर ५० मिलीलीटर में झिल्ली धो लो ।
    नोट: यह पहली धोने बहुत असीम जांच शामिल है और उच्च रेडियोधर्मी के रूप में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
  5. दोहराएँ चरण ९.४ एक बार, तो एक फ्लैट प्लास्टिक कंटेनर या एक ढक्कन सहित ट्रे के लिए झिल्ली ले जाएँ. धोने समाधान के साथ झिल्ली को कवर (०.३ एम NaCl, 30 मिमी सोडियम साइट्रेट, ०.१% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस) और यह कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  6. धुलाई समाधान बदलने के लिए और शोर अनुपात करने के लिए एक संतोषजनक संकेत जब तक धुलाई जारी (अक्सर धुलाई समाधान के 3-4 परिवर्तन) प्राप्त किया गया है । एक Geiger-M & #252 का उपयोग करें; ller ट्यूब कैसे शोर झिल्ली के एक खाली क्षेत्र से विकिरण को मापने के अनुपात में परिवर्तन का संकेत करने के लिए और यह क्षेत्र जहां जांच विशेष रूप से tRNA के लिए संकरित है की तुलना करने के लिए ।
  7. क्रम में करने के लिए जोखिम के बाद झिल्ली से जांच पट्टी करने में सक्षम हो, सुनिश्चित करें कि (महत्वपूर्ण) झिल्ली बाहर अलग करना प्रक्रिया से पहले सूखी नहीं है । एक पतली प्लास्टिक की थैली में झिल्ली प्लेस या यह कसकर प्लास्टिक लपेटो का उपयोग कर लपेटो और इसे सील हवा टेप या वेल्डिंग द्वारा तंग हो । सीलबंद झिल्ली को phosphorimaging स्क्रीन पर रखें ।
    नोट: phosphorimaging स्क्रीन पर आवश्यक जोखिम समय जांच की विशिष्ट गतिविधि के द्वारा निर्धारित किया जाता है, आरएनए की राशि जांच के लिएआर, और जांच के संकरण दक्षता, और बहुत भिंन हो सकते हैं; कुछ मिनटों से लेकर कई दिनों तक. अनुभव के साथ, विकिरण की तीव्रता Geiger साथ झिल्ली पर पता चला-M & #252; ller ट्यूब आवश्यक जोखिम समय का एक अच्छा संकेत देता है. विश्वसनीय ठहराव के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि स्क्रीन उजागर नहीं है ।
  8. स्कैन phosphorimaging स्क्रीन एक लेज़र स्कैनर का उपयोग कर और फ़ाइल को बचाने में & #34;. gel & #34; स्वरूप.
    नोट: एक उच्च सिग्नल शोर अनुपात के लिए विश्वसनीय ठहराव के लिए आवश्यक है । एक tRNA के लिए जांच दो बैंड में परिणाम चाहिए; एक युक्त aminoacylated tRNA (धीमी प्रवास) और एक युक्त deacylated tRNA (तेज प्रवास). See < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ .
< p class = "jove_title" > 10. झिल्ली अलग करना

< p class = "jove_content" > नोट: इससे पहले कि झिल्ली को एक और tRNA के लिए जांचा जा सके, पिछली जांच को पहले झिल्ली को अलग करके हटाया जाना चाहिए ।

  1. गर्मी पर्याप्त अलग करना बफर (15 मिमी NaCl, १.५ मिमी सोडियम साइट्रेट, ०.१% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस) झिल्ली को कवर करने के लिए और यह झिल्ली पर डाल दिया । यह कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
  2. दोहराएँ चरण १०.१ जब तक कोई विकिरण के साथ एक Geiger पता लगाया जा सकता-M & #252; ller ट्यूब; झिल्ली अब खंड 9 में वर्णित चरणों के बाद फिर से संकरी जा सकती है ।
< p class = "jove_title" > 11. बढ़ाता tRNA और स्तरों चार्ज

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में. gel फ़ाइल लोड ( सामग्री की मेज देखें) । इस तरह से नमूना गलियों में से प्रत्येक के साथ एक ऊर्ध्वाधर लाइन ड्रा है कि यह लेन की चौड़ाई के सबसे spans लेकिन बैंड के किनारों जहां संकेत असमान हो सकता है, जैसा कि < मजबूत वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्रा 3 ए .
  2. टयूब पर क्लिक करके प्रत्येक लेन से गिना जाता है & #34; Analysis & #34;-& #62; & #34; ग्राफ & #34 बनाएं; । मैन्युअल रूप से प्रत्येक लेन से चार्ज किए गए और uncharged tRNA का प्रतिनिधित्व करने वाली दो चोटियों को परिभाषित करें, जैसा कि < सबल वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्र बी .
    3. क्लिक करके प्रत्येक चोटी से
  3. प्राप्त गिनती & #34; Analysis & #34;-& #62; & #34; क्षेत्र रिपोर्ट & #34;, और प्रत्येक दो चोटियों के अंतर्गत क्षेत्र रिकॉर्ड करें ।
  4. जब ब्लाटर की जांच की गई है tRNA के लिए selC और ब्याज की कम से एक tRNA, tRNA tRNA selC के हित के के स्तरों को सामान्य करना.
    1. प्रत्येक लेन में स्पाइक से उद्भव tRNA के अनुपात की गणना और समीकरण का उपयोग कर कि लेन में कुल संकेत से घटाना:
      < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56212/56212eq3.jpg"/>
      नोट: यहां, नमुना tRNA = एक झिल्ली की एक लेन से प्राप्त संकेत वांछित tRNA के लिए जांच की; नमुना selC = इसी झिल्ली की एक ही लेन से प्राप्त संकेत tRNA selC के लिए जांच की; Ref tRNA = संकेत केवल स्पाइक से युक्त लेन से प्राप्त एक ही झिल्ली की कोशिका आरएनए में वांछित tRNA के लिए जांच की; रेफरी selC = केवल स्पाइक युक्त लेन से प्राप्त संकेत एक ही झिल्ली की कोशिका आरएनए में tRNA selC के लिए जांच की.
    2. को सामान्य करने के लिए, एक ही लेन से tRNA selC संकेत द्वारा प्रत्येक लेन से सही tRNA मान विभाजित.
      नोट: नमूना कक्षों से tRNA selC संकेत में योगदान नगण्य है (See < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ , लेन त्यसपछि & #34;-selC & #34;).
  5. दोनों चोटियों से संकेत की राशि के साथ चार्ज tRNA का प्रतिनिधित्व चोटी के संकेत बांटकर प्रत्येक लेन के लिए tRNA चार्ज स्तर की गणना (चार्ज + uncharged).

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Representative Results

प्रक्रिया का उपयोग यहां वर्णित है, बहुतायत और तीन tRNAs के स्तर को चार्ज करने से पहले और एमिनो एसिड भुखमरी के दौरान ई. कोलाई K-12 में मापा गया ।

arginine auxotroph तनाव NF9154 (अपने अर्घ था mtl supE44) MOPS कम से ंयूनतम मध्यम ०.४% ग्लिसरॉल, ५० µ जी/एमएल threonine, leucine, arginine, और 5 µ जी/एमएल histidine के साथ पूरक के लिए हो गया था पर मिलाते हुए ३७ ° c पर झटकों १६० आरपीएम. Arginine भुखमरी संस्कृति के निस्पंदन और ताजा MOPS माध्यम में resuspension के रूप में ऊपर लेकिन Arginine के बिना द्वारा शुरू की गई थी । arginine भुखमरी के दौरान, प्रोटीन संश्लेषण दृढ़ता से कम है, लेकिन मौजूदा प्रोटीन के कारोबार द्वारा जारी arginine का उपयोग कर एक निम्न स्तर पर जारी है. चित्रा 4में दर्शाई गई समय बिंदुओं पर नमूनों को काटा गया । सभी नमूनों को टीसीए में काटा गया था के बाद, tRNAselCको व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में MAS1074 स्पाइक के 5%, चित्र 1में सचित्र रूप में प्रत्येक नमूने में जोड़ा गया था । आरएनए नमूनों से शुद्ध, ट्रो द्वारा अलग किया गया था, और प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक झिल्ली पर blotted. झिल्ली tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNAhisR, और tRNAselC, के लिए जांच की गई के रूप में चित्रा 2में देखा । प्रत्येक लेन से विकिरण संकेत चार जांच में से प्रत्येक के लिए मात्रा था के रूप में चित्रा 3में सचित्र, और सही और सामान्यीकृत के रूप में धारा 11 में वर्णित है । परिणाम चित्रा 4में प्रस्तुत कर रहे हैं । चित्रा 4a से पता चलता है कि सभी परीक्षण tRNA प्रजातियों के स्तर तेजी से एमिनो एसिड भुखमरी के दौरान कमी, के रूप में हाल ही में4की सूचना दी । चित्रा 4B से पता चलता है कि tRNA चार्ज स्तरों अपेक्षा के अनुरूप व्यवहार: arginine स्वीकार tRNA के आरोपी अंश तेजी से वृद्धि मध्यम से arginine को हटाने पर गिरता है, जबकि अन्य tRNAs के चार्ज स्तर पर थोड़ा वृद्धि भुखमरी क्योंकि आरोप लगाया tRNAs जमा जब ribosomes में निर्वहन की दर प्रोटीन संश्लेषण के लिए सब्सट्रेट की कमी के कारण कम हो जाती है4. इसके अलावा भुखमरी की अवधि में, आरोपी tRNA अंश tRNA पूल (चित्र 4a) के बहुमत के क्षरण के कारण लगभग पूर्व भुखमरी के स्तर को घटाता है, पर शेष tRNAs के निर्वहन की एक बड़ी दर में परिणाम ribosomes । इसके विपरीत, tRNAargVYZQ के चार्ज किए गए अंश कम दो कारणों से बढ़ जाते हैं; 1) कड़े प्रतिक्रिया के सक्रियकरण का मतलब है कि mRNA, आरोपित नहीं tRNAarg, अनुवाद के लिए सीमित कारक हो जाता है और 2) tRNAarg के कुल पूल कम (चित्र 4a) तो कुल tRNAarg का एक बड़ा अंश है arginine की इसी छोटी राशि से शुल्क लिया जा सकता है. इस प्रयोग को दर्शाता है कि कैसे tRNA बहुतायत और tRNA चार्ज स्तरों के एक साथ माप कोशिका के अंदर प्रोटीन संश्लेषण के लिए शर्तों के बारे में उच्च गुणवत्ता की जानकारी प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्र 1. के अलावा स्पाइक में कोशिकाओं के नमूनों के लिए. इस उदाहरण में, ई. कोलाई NF915 की एक संस्कृति से नमूने से पहले और एमिनो एसिड भुखमरी के दौरान एक समय श्रृंखला में काटा जाता है । NF915 के विकास वक्र का एक योजनाबद्ध दिखाया गया है, जहां नीले डॉट्स नमूना फसल के अंक संकेत मिलता है । Y-अक्षों लॉग स्केल हैं । प्रायोगिक संस्कृति (ओं) के नमूनों के रूप में खंड 3 में वर्णित काटा जाता है । एक योजनाबद्ध स्पाइक की वृद्धि वक्र-तनाव MAS1074 में भी दिखाया गया है, नमूना फसल के बिंदु के साथ एक नीली बिंदी के रूप में संकेत दिया. इस आंकड़े के बिंदु को स्पष्ट करना है कि सभी प्रायोगिक ( ई. कोलाई NF915 इस उदाहरण में) के नमूने) एक ही संदर्भ संस्कृति से स्पाइक की कोशिकाओं में aliquot प्राप्त करते हैं । प्रत्येक नमूने के लिए, 5% स्पाइक में कोशिकाओं प्रयोगात्मक कोशिकाओं के लिए जोड़ रहे हैं, सेल संस्कृतियों के आयुध डिपो के आधार पर गणना (4 अनुभाग देखें). बाद में, आरएनए सभी नमूनों से शुद्ध और उत्तरी दाग के लिए इस्तेमाल किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. फास्फोरस एक उत्तरी ब्लाट के imager स्कैन संकेत tRNAs के लिए जांच की । झिल्ली से पहले और arginine भुखमरी (मिनट) की प्रेरण के बाद संकेत दिया समय अंक पर काटा ई. कोलाई तनाव NF915 से आरएनए शामिल हैं । इसके अतिरिक्त, झिल्ली जहां स्पाइक में कोशिकाओं (-selC दा और-selC) छोड़ दिया गया है नमूनों की दो लेन शामिल हैं, और केवल (selC) स्पाइक-इन कक्षों से आरएनए युक्त एक लेन । -selC दा सैंपल में केमिकल deacylated tRNA होता है । आरोपित और uncharged tRNA प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करने वाले दो बैंड स्पष्ट रूप से अलग हो जाते हैं । बिना जोड़ा स्पाइक-इन गलियों में tRNAselC से नगण्य संकेत नोट करें । इसी झिल्ली को क्रमिक छीन लिया गया और बाईं ओर संकेत tRNAs के लिए फिर से जांच की गई । ऊपरी दाग में बॉक्सिंग क्षेत्र ब्लाटर के उस हिस्से का संकेत देता है, जो बाद में tRNA की जांच के लिए दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. उत्तरी ब्लाटर का ठहराव. tRNA बहुतायत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा जाता है । (क) चित्रा २ में देखी गई उत्तरी दाग से एक एकल लेन tRNAargVYZQके लिए जांची गई. ऊपरी और निचले तीर aminoacylated tRNA और deacylated tRNA, क्रमशः संकेत मिलता है । लाल लेन के साथ समानांतर चल लाइनें जोड़ रहे है और ठहराव के लिए क्षेत्र को परिभाषित करते थे । (B) में देखी गई दो टूटी हुई लाल रेखाओं के भीतर संकेत का ठहराव (a) एक ग्राफ़ के रूप में दर्शाया गया है, जहां क्षैतिज अक्ष (A) (पिक्सेल में) में रेखा के ऊपर से दूरी को इंगित करता है, और अनुलंब अक्ष संकेत की तीव्रता (गणना में) दिखाता है । दो चोटियों aminoacylated tRNA और deacylated tRNA, क्रमशः से उद्भव संकेत युक्त, मैन्युअल रूप से परिभाषित कर रहे हैं. आगे विश्लेषण के लिए निर्यात किया जाता है जो डेटा दो चोटियों में से प्रत्येक के तहत क्षेत्र के लिए इसी मूल्य है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. प्रतिनिधि परिणाम: tRNA बहुतायत के ठहराव एकarginine भुखमरी के दौरान डी चार्ज स्तरों । चित्रा 2में दिखाए गए उत्तरी ब्लाटर पर बैंडों का ठहराव । (क) tRNAgltTUVW (लाल), tRNAargVYZQ (नीला) और tRNAhisR (हरा) के सापेक्ष बहुतायत है. शूंय मिनट में पाया स्तर (नमूनों सिर्फ भुखमरी की शुरुआत से पहले काटा) 1 पर सेट है । (B) समान तीन tRNAs का चार्जिंग स्तर (A) में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

जांच विशिष्टता जांच अनुक्रम
tRNAargVYZQ 5 '-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC
tRNAgluTUVW 5 '-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG
tRNAhisR 5 '-CACGACAACTGGAATCACAATCC
tRNAleuPQVT 5 '-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC
tRNAleuU 5 '-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG
tRNAleuW 5 '-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC
tRNAleuX 5 '-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA
tRNAleuZ 5 '-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT
tRNAlysQTVWYZ 5 '-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC
tRNAthrV 5 '-TGGGGACCTCACCCTTACCAA
tRNAtyrTV 5 '-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA
tRNAselC 5 '-ATTTGAAGTCCAGCCGCC

तालिका 1. ई. कोलाई K-12 में चयनित tRNAs के लिए सुझाए गए जांच दृश्यों की तालिका।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक साथ विशिष्ट ई. कोलाई tRNAs के चार्ज स्तर को मापने के लिए और विभिंन नमूनों में tRNAs के सापेक्ष स्तर की तुलना करें । प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण बिंदुओं 1 हैं) इस तरह के नमूनों में संभाल करने के लिए कि सेलुलर tRNA चार्ज स्तर बनाए रखे हैं, 2) tRNA मात्रा सामान्य करने के लिए इस तरह से है कि विभिन्न नमूनों में सापेक्ष tRNA स्तर मज़बूती से तुलना की जा सकती, और 3) सपा सुनिश्चित करने के लिए tRNAs के लिए चयनित जांचों का ecificity । इन बिंदुओं को अलग से नीचे संबोधित कर रहे हैं ।

tRNA शुद्धिकरण

tRNAs ई. कोलाई से एक सौंय तरीका है कि अपने सेलुलर चार्ज स्तर को बनाए रखने के लिए अनुकूलित है में शुद्ध कर रहे हैं । यह हमारा अनुभव है कि इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से RNAs से कम १५० nt अर्क, इस प्रकार tRNA शुद्ध आरएनए का एक बड़ा अंश का गठन किया । इस कारण से, यह इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए ई. कोलाईसे कुल आरएनए शुद्ध करने के लिए अनुशंसित नहीं है । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल को किसी और रूपांतरित किए बिना अन्य RNAs जैसे लघु आरएनए (sRNA) का पता लगाने और ठहराव के लिए भी उपयुक्त होना चाहिए. क्योंकि आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल लघु आरएनए अनुक्रम के लिए समृद्ध है यह भी उपयोग मिल जाना चाहिए भले ही जांच के तहत sRNA नीच व्यक्त की है ।

स्पाइक द्वारा सामान्य कोशिकाओं में

विभिन्न नमूनों में tRNA के स्तरों की तुलना करने के लिए, आरएनए में नमूना-टू-नमूना विविधताओं के लिए सही करने के लिए, सभी नमूनों में प्रति कक्ष समान औसत संख्या में मौजूद है एक प्रतिलिपि के स्तर के लिए tRNA स्तरों को सामान्य करने के लिए आवश्यक है वसूली और जेल लोड हो रहा है । इस प्रयोजन के लिए, हम उन 5% संदर्भ कक्षों वाले नमूनों को स्पाइक करते हैं जो आरएनए शुद्धि से पहले दुर्लभ tRNAselC को अभिव्यक्त करते हैं । स्पाइक-विधि में संदर्भ के रूप में एक अंतर्जात आरएनए का उपयोग कर पर बेहतर है, क्योंकि यह tRNA स्तरों की तुलना परमिट जहां कोई अंतर्जात RNAs निश्चितता के साथ जाना जाता है एक ही सेलुलर एकाग्रता में पाया जा करने के लिए अनुमति देता है । स्पाइक के रूप में ई. कोलाई कोशिकाओं का उपयोग करने में दोष है कि 5% अतिरिक्त ई. कोलाई आरएनए सभी प्रयोगात्मक नमूनों, जहां यह ब्याज की आरएनए के संकेत करने के लिए योगदान करने के लिए जोड़ा जाता है । यह पूर्वाग्रह हर उत्तरी दाग पर केवल स्पाइक में कोशिकाओं से युक्त एक नमूना सहित द्वारा के लिए हिसाब है, और चरण 11.4.1 में वर्णित के रूप में आरएनए मूल्यों को सही. जंगली प्रकार की कोशिकाओं में tRNAselC की अभिव्यक्ति अन्य tRNAs की तुलना में इतनी कम है ( चित्रा 2देखें) कि यह ठहराव में एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं है और इस तरह उपेक्षित किया जा सकता है । हालांकि, संदर्भ में तनाव MAS1074, जहां selC एक उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड पर एक टी7 प्रमोटर द्वारा व्यक्त की है, हम अनुमान है कि कम से १,००० गुना अधिक tRNAselC 1 मिमी IPTG की उपस्थिति में उत्पादन किया है कि से wildtype ई द्वारा उत्पादित । किसी भी शर्त के तहत कश्मीर-12 कोलाई । MAS1074 पूर्ण IPTG प्रेरण की दो पीढ़ियों के बाद विकसित करने के लिए रहता है । उस समय, संस्कृति को tRNAselC की प्रेरण में संस्कृति मतभेद छोटे हैं, और नहीं एक ही प्रयोग के लिए सेल में स्पाइक के सभी aliquots के रूप में इस प्रोटोकॉल के लिए चिंता का विषय MAS1074 के एक ही प्रेरित संस्कृति से लिया जाता है । MAS1074 के लिए एक विकल्प के रूप में, एक जीव जिसकी आरएनए पार नहीं होगा से कोशिकाओं संकरण जांच के साथ प्रतिक्रिया स्पाइक में कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । Sulfolobus solfataricus कोशिकाओं को सफलतापूर्वक ई. कोलाई tRNA4के साथ प्रयोग के लिए में स्पाइक के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, ई. कोलाई स्पाइक-कोशिकाओं में और अधिक सही प्रयोगात्मक कोशिकाओं के सेल lysis की डिग्री को प्रतिबिंबित करने की संभावना है, क्योंकि यह अनिश्चित है कि एस solfataricus ई. कोलाई के रूप में एक ही क्षमता के साथ lyses है । इसके अलावा, बढ़ती एस solfataricus अधिक थकाऊ के रूप में वे ~ 16 एच की एक पीढ़ी के समय के साथ ८५ डिग्री सेल्सियस पर हो जाना है ।

चयनित tRNAs की विशिष्टता सुनिश्चित करना

यदि दोनों aminoacylated और deacylated tRNA सफलतापूर्वक शुद्ध किया गया है दो बैंड उत्तरी झिल्ली पर पता लगाया जाना चाहिए । दो बैंड के बीच की दूरी जांच के तहत विशिष्ट tRNA के आधार पर अलग होगा, और आकार में अंतर का एक संयुक्त परिणाम है, ध्रुवीय गुण और अनुरूप है कि एक विशेष एमिनो एसिड का कारण बनता है जब यह एक विशेष tRNA बांधता है5 . उदाहरण के लिए, aminoacylated और deacylated tRNA के बीच की दूरी tRNAargVYZQ के लिए अधिक से अधिक है, यह tRNAgltTUVWके लिए है, जैसा कि चित्रा 2में देखा गया है । इस शाही सेना को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जेल के बड़े आकार का एक परिणाम के रूप में, संकल्प tRNA से आरोपी के भेद करने के लिए पर्याप्त उच्च है, लेकिन यह भी लंबाई में अपने मतभेदों के कारण एक दूसरे से अलग tRNAs के अधिकांश भेद करने के लिए, अनुक्रम संरचना, और संशोधन पैटर्न । यहां तक कि isoaccepting tRNAs के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है leucine स्वीकार tRNAs2के लिए दिखाया गया । हालांकि, ध्यान दें कि इस अध्ययन में tRNAleuTसे tRNAleuPQV भेद करना संभव नहीं था, क्योंकि अनुक्रम में अंतर टी प्रतिस्थापन करने के लिए केवल एक जी है ।

यदि दो से अधिक बैंड उत्तरी झिल्ली पर दिखाई देते है यह पार की एक परिणाम हो सकता है अंय RNAs के साथ जांच की प्रतिक्रिया । तापमान बढ़ाने से वॉश स्टेप (स्टेप ९.५) की stringency बढ़ाने से आम तौर पर यह हल हो सकता है । ५५ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट धोने आमतौर पर पर्याप्त है । अगर वॉश stringency बढ़ाने से क्रॉस-संकरण नहीं निकलता है, तो समाधान एक नई जांच डिजाइन करने के लिए हो सकता है जो एक अलग (अक्सर आंशिक रूप से अतिव्यापी) tRNA अनुक्रम के हिस्से के पूरक है । अतिरिक्त बैंड भी ले जा सकते है पर एक पिछली जांच से, झिल्ली के अपर्याप्त अलग करना का एक परिणाम के रूप में । इस को रोकने के लिए, पुन: जांच से पहले झिल्ली को उजागर करके एक पट्टी नियंत्रण करते हैं । बैंड नियंत्रण पर दिखाई देते हैं, तो झिल्ली अतिरिक्त अलग करना पड़ सकता है स्कैन । यह आमतौर पर एक झिल्ली को फिर से जांच करने के लिए संभव है कम से 8-10 बार लेकिन कई जांच के बाद यह पूरी तरह से पट्टी मुश्किल हो सकता है । यदि यह मामला है, झिल्ली के लिए कुछ महीनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है फिर से पहले ३२पी क्षय तेजी के रूप में जांच ।

जांच विशिष्टता के आगे सत्यापन की शर्तों का एक सेट है जहां ब्याज की प्रतिलिपि एक उंमीद के मुताबिक तरीके से प्रभावित होने की उंमीद है के तहत काटा कोशिकाओं के साथ एक उत्तरी दाग प्रदर्शन से प्राप्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक प्लाज्मिड से tRNA के inducible अभिव्यक्ति, या cognate एमिनो एसिड के लिए एमिनो एसिड भुखमरी, एक बढ़ाया सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर या कम चार्ज स्तर में परिणाम, ब्याज की tRNA के क्रमशः होना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मेरीट वरर का धन्यवाद किया । इस काम के लिए स्वतंत्र अनुसंधान के लिए डेनिश परिषद द्वारा समर्थित था । प्राकृतिक विज्ञान [1323-00343B] और डेनमार्क नेशनल रिसर्च फाउंडेशन [DNRF120] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urea Merck 57-13-6 Purity >99%
Polyacrylamide Serva 79-06-7
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) BIO-RAD 161-0201
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma 76-03-9
Phenol Merck 108-95-2
IPTG
Glucose
Sodium Acetate
EDTA
Ethanol
Tris
Hydrochloric acid
Sodium Chloride
NaH2PO4
Sodium Citrate
SDS
Herring Sperm DNA Sigma 100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 γATP Perkin Elmer
DNA oligos (probes) TAG Copenhagen
Hybond N+ membrane GE Healthcare RPN203B
Crosslinker
Electroblotter BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner GE Healthcare 28955809
Spectrophotometer
Hydridization oven
Geiger-Müller tube
Phosphor imager screen GE Healthcare
Hybridization tube
Culture Flasks
1.5 ml microcentrifuge tubes
20 ml centrifuge tubes
Name Company Catalog Number Comments
Software
ImageQuant GE Healthcare
Excel Microsoft

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References

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जैव रसायन अंक १२६ ई कोलाई ribonucleic एसिड गैर कोडिंग आरएनए आरएनए शुद्धि स्थानांतरण आरएनए चार्ज स्तर aminoacylation आरएनए ठहराव उत्तरी दाग.
ठहराव की बहुतायत और चार्ज करने के स्तर के हस्तांतरण RNAs में <em>ई कोलाई</em>
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Stenum, T. S., Sørensen, M. A., … More

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., Svenningsen, S. L. Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56212, doi:10.3791/56212 (2017).

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