Cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de ARN de transferencia en Escherichia coli

Resumen

Aquí presentamos un método para medir directamente el ARN de transferencia carga niveles de purificada de Escherichia coli RNA como una forma de comparar niveles relativos de ARN de transferencia, o cualquier otro RNA corto, a través de diferentes muestras basadas en la adición de espiga en células expresan un gen de referencia.

Resumen

ARN de transferencia (tRNA) es una parte esencial de la maquinaria traduccional en cualquier organismo. ARNt se unen y transferir los aminoácidos al ribosoma traduciendo. Los niveles relativos de tRNAs distintos y la proporción de aminoacylated tRNA al tRNA total, conocido como el nivel de carga, son factores importantes en la determinación de la exactitud y velocidad de traducción. Por lo tanto, la abundancia y niveles de carga de tRNAs son variables importantes a medir en el estudio de la síntesis de proteínas, por ejemplo en diversas condiciones de estrés. Aquí, describimos un método para cosechar tRNA y medición directa de la abundancia relativa y el nivel absoluto de la carga de la especie específica del ARNt en Escherichia coli. El tRNA se recolecta de tal manera que se conserve el vínculo inestable entre el ARNt y su aminoácido. El RNA entonces se somete a electroforesis en gel y Northern Blot, que resulta en la separación de los tRNAs cargados y descargados. Los niveles de tRNAs específicos en diferentes muestras se pueden comparar debido a la adición de espiga en las células para la normalización. Antes de la purificación del ARN, agregamos 5% de células de e. coli que sobreproducción la tRNA rara^selC a cada muestra. La cantidad de las especies de tRNA de interés en una muestra luego se normaliza la cantidad de tRNA^selC en la misma muestra. Además de la espiga en las células antes de la purificación del ARN tiene la ventaja sobre adición de purificada spike en RNAs que también explica las diferencias en la eficiencia de la lisis de células entre las muestras.

Introducción

A continuación, presentamos un método para cuantificar el ARNt específico y medir su carga niveles por borrar norteño. El método se basa en una técnica desarrollada por Varshney et al. ¹. recolección de las células en ácido tricloroacético (TCA) y manteniendo las muestras a 0 ° C a lo largo de la purificación de RNA, el enlace éster entre el tRNA y el aminoácido es conservado^2,3,4. TRNAs Aminoacylated pueden distinguirse de sus contrapartes nonacylated por electroforesis y blotting norte, debido a una movilidad disminuida de la aminoacylated t....

Protocolo

1. preparación de culturas bacterianas.

1. Crecer todos cultivos en matraces Erlenmeyer con una relación de volumen de cultura/frasco de a lo más 1/6. En una típica configuración experimental, crecen las culturas a 37,0 ° C y agitación a 160 rpm en el morpholinepropanesulfonic ácido (MOPS) mínimo media ¹⁸ complementado con la fuente de carbono preferido, por ejemplo 0.2% glucosa, por lo menos 10 generaciones consecutivas antes de la cosecha de RNA.
2. El día antes de la cosecha de RNA, diluir un pequeño cultivo de la cepa deseada en medio mínimo de fregonas de tal manera que llegará el deseado OD ₄₃₆ en el tiempo dese....

Resultados

Utilizando el procedimiento descrito aquí, la abundancia y carga se miden los niveles de tres tRNAs en e. coli K-12 antes y durante el hambre de aminoácidos.

El auxotroph arginina cepa NF915⁴ (leu thr su argH thi mtl supE44) se cultivaba durante al menos diez generaciones en MOPS medio mínimo suplementado con 0.4% de glicerol, 50 treonina μg/mL, leucina, arginina e histidina 5 μg/mL a 37.......

Discusión

Este protocolo describe cómo medir simultáneamente el nivel de carga de concreto e. coli tRNAs y comparar los niveles relativos de los tRNAs en diferentes muestras. Son los puntos críticos del protocolo 1) manejar las muestras de tal manera que se mantienen los niveles de carga celular tRNA, 2) para normalizar la cantidad de tRNA de tal manera que pueden compararse confiablemente niveles relativos del tRNA en diferentes muestras y 3) para el sp ecificity de las sondas seleccionadas para los tRNAs de interés. Est.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Urea	Merck	57-13-6	Pureza >99%
Poliacrilamida	Serva	79-06-7
Bis (N,N'-Metileno-bis-acrilamida)	BIO-RAD	161-0201
Ácido tricloroacético (TCA)	Sigma	76-03-9
Fenol	Merck	108-95-2
IPTG
Glucosa
Acetato
EDTA
Etanol
Tris
Ácido
Cloruro de
NaH2PO4
Citrato
SDS
Arenque Esperma ADN	Sigma	100403-24-5
BSA
Polivinilpirrolidona
Ficoll
P32 y gamma; ATP	Perkin Elmer
Oligonucleótidos de ADN (sondas)	TAG Copenhague
Membrana Hybond N+	GE Healthcare	RPN203B
Crosslinker
Electroblotter	BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner	GE Healthcare	28955809
Espectrofotómetro
			hidridización
Geiger-Mü Tubo
Pantalla de generador de imágenes de fósforo	GE Healthcare
			hibridación
Matraces
cultivo Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Tubos
			centrífuga de 20 ml
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Software
ImageQuant	GE Healthcare
Excel	Microsoft

de sodioclorhídricosodiode sodioHorno dellerTubo dedede