Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Published: August 22, 2017 doi: 10.3791/56212
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Copenhagen

Summary

Hier presenteren we een methode voor het meten van direct transfer-RNA opladen niveaus van gezuiverde Escherichia coli RNA als een manier om te vergelijken van de relatieve niveaus van transfer-RNA, of elke andere korte RNA, over verschillende steekproeven gebaseerd op de toevoeging van spike-in cellen die een referentie-gen uitdrukt.

Abstract

Transfer-RNA (tRNA) is een essentieel onderdeel van de vertalende machine in een organisme. tRNAs binden en overbrengen van aminozuren naar het ribosoom vertalen. Het relatieve niveau van verschillende tRNAs, en de verhouding van aminoacylated tRNA aan totale tRNA, bekend als het opladen niveau, zijn belangrijke factoren bij het bepalen van de nauwkeurigheid en snelheid van de vertaling. Dus, de overvloed en opladen niveaus van tRNAs zijn belangrijke variabelen te meten bij de studie van de eiwitsynthese, bijvoorbeeld onder verschillende omstandigheden van stress. Hier beschrijven we een methode voor het verzamelen van tRNA en direct meten van zowel de relatieve overvloed en het absolute opladen niveau specifieke tRNA soorten in Escherichia coli. Het tRNA wordt geoogst op een zodanige wijze dat de labiele band tussen het tRNA en haar aminozuur behouden blijft. RNA is vervolgens onderworpen aan de Elektroforese van het gel en de noordelijke bevlekken, wat resulteert in de scheiding van de geladen en ongeladen tRNAs. De niveaus van specifieke tRNAs in verschillende monsters kunnen worden vergeleken als gevolg van de toevoeging van spike-cellen voor normalisatie. Voorafgaand aan de zuivering van het RNA voegen we 5% van de cellen van E. coli die hen van de zeldzame tRNAselC aan elk monster. Het bedrag van het tRNA-soorten van belang in een monster is dan op de hoeveelheid tRNAselC in hetzelfde monster genormaliseerd. Toevoeging van spike-cellen vóór RNA zuivering heeft het voordeel ten opzichte van de toevoeging van gezuiverde spike-in RNAs die het ook goed is voor eventuele verschillen in cellysis efficiëntie tussen de monsters.

Introduction

In de volgende, presenteren we een methode voor het kwantificeren van de specifieke tRNAs en meten hun opladen niveaus door het noordelijke bevlekken. De methode is gebaseerd op een techniek die het eerst ontwikkeld door Varshney et al. 1. door het oogsten van cellen in Trichloorazijnzuur (TCA) en het houden van de monsters bij 0 ° C gedurende de RNA-zuivering, is de ester-binding tussen het tRNA en het aminozuur geconserveerde2,3,4. Aminoacylated tRNAs kunnen worden onderscheiden van hun nonacylated tegenhangers door elektroforese van het gel en het noordelijke bevlekken, zijner tijd voor een verminderde mobiliteit van de aminoacylated in de gel, veroorzaakt door de covalent gebonden aminozuur5tRNA. Daarnaast presenteren we een protocol voor het normaliseren van tRNA hoeveelheden door toevoeging van spike-cellen de zelden gebruikte tRNAselC 4overexpressing.

tRNAs zijn enkele van de meest voorkomende moleculen in de bacteriële cel en een absoluut noodzakelijk onderdeel van de machine vertaling. tRNAs binden van aminozuren en deze overbrengen naar de vertalen ribosomen. De binding van aminozuren te tRNAs (aminoacylation of opladen) wordt vergemakkelijkt door het aminoacyl-tRNA-synthetases. De relatieve overvloed van verschillende geladen tRNAs is belangrijk om te zorgen voor de trouw van de eiwitsynthese, omdat ondervertegenwoordiging van de cognate betalen dat tRNA voor een bepaalde boodschapper-RNA (mRNA) codon verhoogt de waarschijnlijkheid dat een in de buurt van-cognate tRNA zal ten onrechte haar aminozuur aan de groeiende polypeptide-keten op het ribosoom6leveren. Het belang van geladen tRNA wordt weerspiegeld in de uitgebreide reactie van de E. coli cel tot een ernstige daling in de laden niveaus van een tRNA; de strenge reactie. Tijdens de strenge reactie is de synthese van tRNAs, ribosomaal RNAs en meeste mRNAs verlaagd ten gunste van de transcriptie van specifieke mRNAs aminozuur biosynthese en stress survival is gekoppeld en het groeitempo op jaarbasis van de cellen wordt drastisch verlaagd7 . Bovendien heeft recent werk van ons en anderen aangetoond dat E. coli actief de meerderheid van haar tRNA in reactie op benadrukt dat beperken vertaling4,8 degradeert, suggereren dat aanpassing van het tRNA niveaus mogelijk belangrijk voor het omgaan met dergelijke benadrukt. Betrouwbare metingen van tRNA abundanties en opladen niveaus zullen dus een belangrijk instrument voor het volledig begrijpen van bacteriële stress reacties.

E.coli wordt vaak gebruikt om uit te drukken van recombinante eiwitten en vanwege de verschillen tussen soorten in het codon gebruik, suboptimaal expressie is een probleem dat vaak geconfronteerd9. Dit kan worden omzeild door expressie van extra tRNAs nodig om te vertalen van de recombinante mRNA10. Metingen van tRNA opladen niveaus in dergelijke spanningen kunnen begeleiden probleemoplossing inspanningen en optimaliseren van eiwit expressie.

Deze methode maakt het ook mogelijk de detectie van "mischarging"; een tRNA molecuul aminoacylated met een niet-cognate aminozuur. Aminoacylation door verschillende aminozuren kan veroorzaken een tRNA migreren met lichtjes verschillende snelheden t/m polyacrylamide gels1,11. In sommige gevallen kan de methode ook worden gebruikt om te onderscheiden van andere wijziging patronen op identieke tRNAs3.

Andere vastgesteld biochemische procedure voor het onderzoek van tRNA opladen niveaus oxidatie is Perjodaat. De methode is gebaseerd op de observatie dat aminoacylated tRNA is beschermd tegen Perjodaat oxidatie en ongeladen tRNA niet. Na Perjodaat oxidatie behandeling het opladen van het tRNA wordt gebruikt voor het schatten van het opladen niveaus van de geoogste RNA. Echter, het opladen van verschillende tRNAs is aangetoond te worden beïnvloed door de behandeling waardoor sommige onnauwkeurigheid12. De methode gepresenteerde maatregelen opladen rechtstreeks uit gezuiverde RNA, dus exclusief eventuele vooroordelen van chemische of enzymatische reacties. Een beperking van deze methode is dat slechts één soort tRNA wordt ontdekt tegelijkertijd, zodat hoewel het dezelfde Noord vlek kan worden gestript en reprobed voor meerdere tRNAs, is het tijdrovend en enigszins moeizaam gegevens te verzamelen over de vele tRNAs.

Een betrouwbare manier van normaliseren monsters aan elkaar is van vitaal belang in studies waar het doel is om het relatieve niveau van een molecule van verschillende monsters met elkaar vergelijken. Hier introduceren we een normalisatie-procedure voor RNA waar een kleine hoeveelheid van E. coli cellen overexpressing de zeldzame tRNAselC wordt toegevoegd als een piek aan alle experimentele monsters vóór RNA zuivering. Deze methode is nuttig niet alleen bij de behandeling van tRNAs, maar voor relatieve kwantificering van elke soort van RNA wanneer de experimentele opzet is zodanig dat geen endogene RNA kan worden vertrouwd te presenteren in de dezelfde cellulaire concentraties in alle monsters. Bijvoorbeeld, wordt het niveau van een "schoonmaak" RNA-achtige ribosomaal RNA vaak gebruikt als een endogene verwijzing naar het vergelijken van de relatieve hoeveelheden van een andere RNA tussen verschillende monsters13. Maar dit is van weinig nut als de cellulaire concentratie van de referentie-RNA tussen de monsters varieert, zoals het geval voor ribosomaal RNA zijn kan als de bemonstering plaatsvindt tijdens een stress reactie15,16,17 of inwerkingtreding van de stationaire fase17. De toevoeging van spike-cellen aan de experimentele monsters vóór RNA zuivering biedt een solide en nauwkeurige manier van normalisatie onafhankelijk is van de bemonstering setup. Een andere manier van normalisatie is de toevoeging van een of meer spike-in RNAs aan de experimentele monsters na zuivering van RNA. Echter, houdt deze methode geen rekening met eventuele verschillen in RNA herstel tussen de monsters.

Cuvetten van E. coli die overexpress de verwijzing RNA als spike-cellen (Zie Figuur 1) in een experiment met E. coli heeft het nadeel dat het resultaten bovendien van een kleine hoeveelheid exogene E. coli total RNA aan de monsters. We corrigeren voor deze toevoeging door het analyseren van een steekproef met alleen spike-in cellen parallel met de experimentele monsters (Zie de noordelijke vlek in Figuur 2, lane met het label "selC"). Het protocol gepresenteerd is ontwikkeld voor E. coli K-12 maar dreigt te worden die van toepassing zijn voor de meeste bacteriesoorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding van bacteriele.

  1. Groeien alle culturen in conische kolven met een cultuur/kolf volumeverhouding van hooguit 1/6. In een typische experimentele opzet, groeien de culturen bij 37.0 ° C en schudden bij 160 t/min in morpholinepropanesulfonic zuur (MOPS) minimaal middellange 18 aangevuld met de gewenste koolstofbron, bijvoorbeeld 0,2% glucose, voor ten minste 10 opeenvolgende generaties vóór RNA oogst.
  2. De dag vóór RNA oogst, Verdun een outgrown cultuur van de gewenste stam in MOPS minimaal medium op een zodanige wijze dat het de gewenste OD 436 op het gewenste tijdstip de volgende dag bereiken zal. Berekenen van het volume van cultuur ontgroeid te gebruiken voor inoculatie door de formule:
    Equation 1
    Opmerking: hier, OD nieuwe duidt de gewenste OD 436 Na incubatie V nieuwe duidt het volume van de verdunde cultuur, OD oude duidt de OD 436 van de outgrown cultuur van verdund, G geeft het aantal generaties de cultuur groeien zal, van de tijd van verdunning (t-1) aan de tijd dat het nodig is de dag na (t 2) en kan worden berekend als: tijdsverschil (in minuten) tussen t 1 en t 2 gedeeld door de generatietijd (in minuten). Om ervoor te zorgen de steady-state groei op het tijdstip van bemonstering, G moet ≥ 10; V oude duidt het volume van de uitgaande volwassen cultuur die worden aan het verse medium overgedragen moet. Deze vergelijking is een benadering die houdt geen rekening met elke fase lag; een fenomeen dat vaak waargenomen na verdunning van een uitgaande volwassen cultuur in nieuwe media.
    1. Groei omstandigheden zal variëren afhankelijk van het doel van het experiment, maar als u wilt beperken cel-naar-cel variatie in tRNA niveaus en om de reproduceerbaarheid van de resultaten, (aanbevolen) groeien de culturen om stabiele staat Golden vóór de bemonstering 19.

2. Voorbereiding met spike-cellen

Opmerking: de E. coli-stam MAS1074, die spreekt van het gen van de selC codering tRNA selC onder de controle van een isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- afleidbare promotor wordt gebruikt als de Prikker-in stam.

  1. Dilute een outgrown cultuur van MAS1074 naar een OD-436 van 0,05 in MOPS minimaal medium aangevuld met 100 µg/mL ampicilline en 0,2% glucose. Groeien van de cultuur bij 37 ° C schudden bij 160 rpm.
    Opmerking: Zie de discussie voor het gebruik van een alternatieve referentiestam.
    2. IPTG toevoegen
  2. bij OD 436 ~ 0,1, om een eindconcentratie van 1 mM voor het opwekken van de expressie van tRNA selC. De cultuur uitgroeien tot OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h van de groei) en de cultuur kolf naar een ijsbad. Houden van de spike-in celkweek op ijs totdat alle monsters voor RNA zuivering zijn geoogst.

3. Oogst van experimentele monsters.

  1. Pre warm (37 ° C) een afgetopte 100 mL conische kolf (of soortgelijke) met 4 mL 10% (m/v) Trichloorazijnzuur (TCA) voor elk monster door deze te plaatsen in een verwarmd waterbad.
    Opmerking: Let op, TCA ontleedt bij verwarming, produceren giftige en corrosieve dampen, met inbegrip van waterstofchloride en chloroform. De oplossing in water is een sterk zuur; het is bijtend voor de vele metalen en reageert heftig met honken. Juiste voorzorgsmaatregelen moet worden genomen bij het gebruik van deze vloeistof.
  2. Onmiddellijk voorafgaand aan de oogst van de cel, meten en registreren van de OD-436 van de cultuur.
  3. Breng om te oogsten van de cellen, 4 mL van cultuur een voorverwarmde kolf met TCA.
  4. Meng het monster door de wervelende de kolf met de hand voor 5 s. mengen met TCA onmiddellijk uitgeschakeld alle enzymatische activiteiten en aldus het opladen niveaus van de tRNAs behoudt.
    Opmerking: Als meerdere monsters worden verzameld, houd geoogste monsters in TCA op ijs totdat alle monsters verzameld.

4. Toevoeging van spike-cellen

Opmerking: voorbereiding met spike-cellen wordt beschreven in stap 2.

  1. Als alle monsters voor RNA voorbereiding zijn verzameld, 5% piek-in cellen (gebaseerd op de OD) toevoegen aan elk monster.
    Opmerking: Het volume van celkweek van een spike-in nodig wordt berekend door de formule:
    Equation 2
    waar V piek het volume van celkweek van een spike-in nodig duidt, V exp duidt het volume van de geoogste experimentele celkweek (zonder TCA), OD exp duidt de OD 436 van de experimentele celcultuur ten tijde van de oogst in TCA. OD piek duidt de OD 436 van de spike-in celkweek. Als meerdere monsters worden geoogst op verschillende ODs, het volume spike-in cellen toegevoegd moet worden aangepast volgens de bovenstaande formule voor elk monster.
  2. Te kwantificeren van de bijdrage van de spike-cellen aan het RNA-soorten van belang, bereiden een monster met alleen spike-in cellen door het mengen van 4 mL spike-cellen met 4 mL TCA. Bereiden van RNA van dit voorbeeld op dezelfde manier als de andere monsters.
  3. Desgewenst nemen een andere kolf met alleen het experimentele monster, zonder spike-cellen, en opnemen om te kwantificeren van de bijdrage van de experimentele monster, tot het tRNA selC niveaus; de endogene niveaus van tRNA selC in E. coli K-12 zijn verwaarloosbaar laag.

5. Voorbereiding van RNA

Opmerking: The RNA voorbereiding protocol hier beschreven is in wezen die beschreven door Varshney et al. 1; Om te voorkomen dat deacylation van de aminoacylated tRNAs tijdens het zuiveringsproces ongehinderd is het belangrijk om te houden van de monsters bij zure pH en bij 0 ° C in de loop van zuivering. Gebruik schone steriele buizen/kolven te houden van de monsters en oplossingen, en stelt alle oplossingen met ultrazuiver (18.2 MΩ·cm soortelijke weerstand) water.

  1. Pour 8 mL van elk monster in een centrifugebuis met ijs gekoeld. Centrifugeer steekproeven voor 10 min bij 9.500 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen supernatant en resuspendeer in 0.3 mL koude 0,3 M Natriumacetaat, pH 4,5 en 10 mM EDTA.
  2. Elk monster overbrengen in een koude 1,5 mL microcentrifuge buis en toevoegen van 0.3 mL fenol geëquilibreerd met de dezelfde buffer.
    Opmerking: Let op, fenol giftige dampen produceert en is zeer corrosief voor de huid.
  3. Vortex elk monster 10 x voor 15 s met ten minste 1 min. tussen elke vortex. Tussen de vortexing houden de monsters bij 0 ° C. de frequente pauzes gebruiken om ervoor te zorgen dat de monsters koud blijven.
  4. Centrifuge monsters gedurende 15 minuten staan bij 20.000 x g bij 4 ° C. Transfer de waterfase (bovenste fase) naar nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen. Toevoegen van 0.3 mL koude fenol en vortex 4 x 15 s als voorheen.
  5. Centrifuge voor 10 min bij 20.000 x g bij 4 ° C. Transfer de waterfase aan nieuwe, koude 1,5 mL microcentrifuge buizen met 2,5 maal het volume van 96% ethanol (~ 750 µL). Neerslaan van het RNA door het broeden van de buizen gedurende 1 uur bij-20 ° C of 's nachts -80 ° C.
  6. Centrifuge monsters gedurende 30 minuten bij 20.000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg voorzichtig 1 mL koude 70% ethanol zonder verstoring van de RNA-pellet. Voorzichtig omkeren eens te wassen van de binnenkant van de buizen met ethanol.
    Opmerking: De pellet kan worden moeilijk te zien bij deze stap.
  7. Centrifuge voor 10 min bij 20.000 x g bij 4 ° C. volledig Verwijder het supernatant en drogen van de pellet totdat geen ethanol niet. Resuspendeer de pellet door krachtig vortexing in 20 µL koude 10 mM natrium acetaat pH 4.5 en 1 mM EDTA.
    Opmerking: Doen niet overdreven drogen de pellet naarmate het zal moeilijk te resuspendeer.
  8. Optioneel, het beoordelen van de concentratie van RNA door het meten van de absorptie bij 260 nm.
  9. Optioneel, het beoordelen van de kwaliteit van het gezuiverde RNA door agarose gel elektroforese 20.
  10. Winkel monsters op -80 ° C.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
< p klasse"jove_title" = > 6. Voorbereiding van chemisch deacylated controlemonster

Opmerking: om te onderscheiden van de band van aminoacylated tRNA roepen vanaf de bijbehorende deacylated op de noordelijke vlek, een chemisch deacylated aliquoot wordt bereid door alkalische behandeling. Voor de meeste doeleinden, volstaat één sample deacylate voor elke noordelijke vlek.

  1. Dooi het RNA monster op ijs. Een aliquot 4 µL van het RNA-monster overbrengen in een nieuwe buis. 46 µL Tris-HCl pH 9.0 toevoegen. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
  2. 15 µL van 0,3 M Natriumacetaat toevoegen met een pH van 4.5 en voeg vervolgens 125 µL van 96% ethanol. Neerslag van RNA bij-20 ° C gedurende 1 h.
  3. Centrifuge gedurende 30 minuten bij 20.000 x g bij 4 ° C. volledig verwijderen van supernatant en resuspendeer in 4 µL koude 10 mM natrium acetaat pH 4,5 en 1 mM EDTA.
    Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier, als het monster wordt opgeslagen bij -80 ° C.

7. Gel elektroforese en het noordelijke bevlekken

  1. Mix 4 µL monster (onbehandeld of chemisch deacylated) met 6 µL laden buffer (0,1 M Natriumacetaat (pH 5.0), 8 M ureum, 0.05% bromophenol blauw en 0,05% xyleen cyanol).
    Nota: Herinner me om op te nemen van het monster met alleen spike-in cellen, het chemisch deacylated monster (en het monster zonder spike-in cellen, als men was bereid).
  2. Laden de monsters op een 0,4 mm dikke 6,5% polyacrylamidegel (19:1-acrylam - ide:bisacrylamide) met 8 M ureum in 0,1 M natrium acetaat buffer (pH 5.0). 60 cm lange gels gebruiken voor correcte scheiding van tRNA soort(en).
  3. Aparte het RNA door elektroforese in 10 V/cm gel bij 4 ° C, tot de blauwe bromophenol bereikt de onderkant van de gel (~ 20 h).
  4. Het gebied van de xyleen cyanol kleurstof en 20 cm naar beneden naar de bromophenol-blauwe kleurstof wordt gebruikt voor het bevlekken (de afstand tussen de twee kleurstoffen moeten 25-30 cm). Zorgvuldig scheiden de twee glazen platen, zodat de gel op een van hen blijft. Een klein stukje filtreerpapier is op de maat van het gewenste Bevlekkende gebied gesneden en geplaatst op de top van het deel van de gel die wordt gebruikt voor het bevlekken. De onderdelen van de gel die niet onder het filtreerpapier vallen worden afgesneden en weggegooid. het koffiefilter kunt Trek voorzichtig de gel stuk uit de buurt van de glasplaat.
    Opmerking: De grote gel is erg kwetsbaar dus voorzichtig behandelen.
  5. Een positief geladen nylon membraan (bijvoorbeeld Hybond N + membraan) is geplaatst op de top van de gel en het is electroblotted bij 20 V voor 90 min 40 mM Tris-acetaat (pH 8.1), 2 mM EDTA gebruiken als overdracht buffer.
  6. Dwarslijn RNA aan het membraan met behulp van UV-licht (0,12 J/cm 2).
    Opmerking: Het membraan kan nu worden opgeslagen op kamertemperatuur en het protocol kan hier worden gepauzeerd.

8. Ontwerp en verificatie van sondes

Opmerking: zorgvuldige ontwerp en de verificatie van de noordelijke vlek sondes is cruciaal voor betrouwbare resultaten te verkrijgen en te voorkomen dat ongewenste Kruis-kruising met andere soorten RNA.

  1. Gebruik korte synthetische oligonucleotides als sondes. Ontwerpen van de volgorde van de sonde op een manier dat het is een aanvulling op het meest unieke deel van de reeks van het tRNA van belang - dit vaak de lus anticodon is.
    Opmerking: Een lijst met voorspelde tRNA-sequenties van verschillende organismen kan worden gevonden in de genomische tRNA Database (GtRNAdb) 21.
  2. Aanpassen van de lengte van de reeks te verkrijgen een voorspelde smelttemperatuur van 55-65 ° C.
  3. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de gekozen volgorde tegen het genoom van de bacteriële stam gebruikt in het experiment, om te verifiëren dat de volgorde uniek voor de geselecteerde tRNA, is zoals beschreven in 22.
    Opmerking: Tabel 1 lijsten met voorgestelde sonde sequenties voor verscheidene verschillende tRNAs van E. coli K12. Als de sonde specifiek voor het tRNA van belang is, slechts twee bands zijn zichtbaar op de noordelijke vlek (geladen en ongeladen tRNA) en slechts één band is zichtbaar in de baan met het deacylated monster (ongeladen tRNA). Als meer dan twee bands aanwezig zijn of desgewenst verdere validatie van de specificiteit van de sonde is, zie bespreking.

9. Kruising van de noordelijke vlek

Opmerking: In de volgende stappen, het membraan is sequentieel gekruist met sondes ter aanvulling van de gewenste specifieke tRNAs, met inbegrip van een specifieke sonde voor de verwijzing tRNA selC.

  1. Plaats van het membraan in een kruising buis en voeg 6 mL hybridisatie oplossing (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7.7), 5 mM EDTA, 0,5% (w/v) SDS, 100 mg/mL van geschoren en gedenatureerd haring sperma DNA en 5 x Denhardt ' s oplossing (100 x Denhardt ' s oplossing = 2% bovien serumalbumine, 2% Polyvinylpyrrolidon 40 en 2% densiteitgradiënt)).
  2. Kruisen vooraf het membraan in de buffer voor 1 h roteren op 42 ° C. toevoegen 30 pmol radioactieve oligo-DNA sonde 5 ' - end - label met 32 P (voorbereid zoals beschreven door Sambrook et al. 23)
    Opmerking: Let op, de hoog-energetische bèta emissiesvan 32 P kunnen een aanzienlijke huid en oog dosis gevaar presenteren. Juiste voorzorgsmaatregelen moet worden genomen wanneer met behulp van 32 P. radioactief afval moet worden verwijderd volgens de passende institutionele veiligheid protocollen.
  3. Broeden de sonde met de membraan overnachting ronddraaiende 42 ° C. verwijderen de sonde die met behulp van een precisiepipet wegwerp 10 mL.
    Opmerking: Als in een vriezer opgeslagen de sonde kan worden hergebruikt.
  4. In de kruising buis, wassen het membraan binnenkort in 50 mL 0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitraat, 0,1% (g/v) SDS bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Deze eerste wassing bevat veel niet-afhankelijke sonde en moeten worden behandeld als hoogradioactief.
  5. Herhaal stap 9.4 eenmaal, dan de membraan verplaatsen naar een plat plastic container of de lade met inbegrip van een deksel. Betrekking hebben op het membraan met de wassen oplossing (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitraat, 0,1% (g/v) SDS) en laat het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
  6. Wijzigen van de oplossing van het wassen en het wassen blijven totdat een bevredigende signaal / ruisverhouding is verkregen (vaak 3-4 veranderingen oplossing te wassen). Gebruikt een Geiger-Müller buis om te ontdekken hoe de ruis/signaal verhouding verandert door het meten van de straling van een leeg gebied van het membraan en het vergelijken met het gebied waar de sonde heeft gekruist wil tRNA.
  7. Om de sonde van het membraan strip na blootstelling, te kunnen zorgen dat (belangrijk) het membraan droogt niet uit voordat de stripping procedure. Plaats het membraan in een dunne plastic zak of wrap strak met plastic wrap en zegel te luchtdichte door tape of lassen. Plaatsen van het verzegelde membraan op een phosphorimaging scherm.
    Opmerking: De vereiste blootstellingstijd op het scherm van de phosphorimaging wordt bepaald door de specifieke activiteit van de sonde, het bedrag van RNA gesondeerd for, en de efficiëntie van de kruising van de sonde, en kan variëren sterk; een paar minuten tot meerdere dagen. Met ervaring geeft de intensiteit van de straling aangetroffen op het membraan met de Geiger-Müller buis een goede indicatie van de vereiste blootstellingstijd. Voor betrouwbare kwantificatie, is het belangrijk dat het scherm niet is overbelicht.
  8. De phosphorimaging-scherm met behulp van een laserscanner scannen en sla het bestand in " .gel " formaat.
    Opmerking: Een hoog signaal / ruisverhouding is nodig voor betrouwbare kwantificering. Indringende voor een tRNA zou moeten resulteren in twee bands; één met aminoacylated tRNA (langzamer migratie) en één met deacylated tRNA (sneller migratie). Zie Figuur 2.

10. Strippen van het membraan

Opmerking: voordat het membraan kan worden bestudeerd voor een ander tRNA, de vorige sonde eerst moet worden verwijderd door het strippen van de membraan.

  1. Warmte genoeg strippen buffer (15 mM NaCl, 1.5 mM Natriumcitraat, 0,1% (g/v) SDS) te dekken van het membraan en giet het over het membraan. Laat het 15 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
  2. Herhaal stap 10.1 tot geen straling kan worden opgespoord met een Geiger-Müller buis; het membraan kunnen nu opnieuw gehybridiseerde de procedure die wordt beschreven in sectie 9.

11. Kwantificeren van tRNA en opladen niveaus

  1. lading het bestand .gel in de beeldvorming software (Zie de Tabel van de materialen). Tekenen van een verticale lijn langs elk van de steekproef rijstroken op zodanige wijze dat het omvat allermeest naar de breedte van de rijstrook, maar omvat niet de randen van de bands waar het signaal kunnen ongelijke, zoals weergegeven in figuur 3A.
  2. Visualiseren telt van elke rijstrook door te klikken op " analyse "-> " grafiek maken ". Handmatig het definiëren van de twee bergtoppen die vertegenwoordigen de geladen en de ongeladen tRNA van elke lane, zoals weergegeven in figuur 3B.
  3. Elke piek graven verkrijgen door te klikken op " analyse "-> " gebied verslag ", en het opnemen van het gebied onder elk van de twee bergtoppen.
  4. Wanneer de vlek voor tRNA selC en ten minste één tRNA van belang, heeft zijn gesondeerd normaliseren de niveaus van het tRNA voor tRNA selC van belang.
    1. Berekenen van het aandeel van tRNA die afkomstig zijn van de piek-cellen in elke rijstrook en aftrekken van het totale signaal in die baan met behulp van de vergelijking:
      Equation 3
      Opmerking: hier, Proeven van tRNA = het signaal verkregen uit een enkele rijstrook van een membraan gesondeerd voor de gewenste tRNA; Monster selC = het signaal verkregen uit de zelfde baan van het dezelfde membraan gesondeerd voor tRNA selC; Ref tRNA = het signaal verkregen van de rijstrook met alleen spike-in cel RNA van het dezelfde membraan gesondeerd voor de gewenste tRNA; Ref selC = het signaal verkregen van de rijstrook met alleen spike-in cel RNA van het dezelfde membraan gesondeerd voor tRNA selC.
    2. Te normaliseren, verdelen de gecorrigeerde waarde van het tRNA van iedere baan van het tRNA selC signaal van de dezelfde baan.
      Opmerking: De bijdrage aan het tRNA selC signaal uit de bemonsterde cellen is te verwaarlozen (Zie Figuur 2, lane label "-selC ").
  5. Berekenen van het niveau voor elke rijstrook opladen door het verdelen van het signaal van de piek die geladen tRNA met de som van het signaal vertegenwoordigt van zowel pieken tRNA (geladen + ongeladen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van de procedure die hier worden beschreven, de overvloed en opladen niveaus van drie tRNAs werden gemeten in E. coli K-12 vóór en tijdens het aminozuur honger.

De arginine-auxotroph stam NF9154 (thr leu zijn argH thi mtl supE44) werd geteeld voor minstens tien generaties in minimaal medium MOPS aangevuld met 0,4% glycerol, 50 µg Mo/mL threonine, leucine, arginine en 5 µg Mn/mL bij 37 ° C schudden bij histidine 160 rpm. Arginine honger werd geïntroduceerd door filtratie van de cultuur en de hersuspensie in verse MOPS medium als hierboven, maar zonder arginine. Tijdens arginine honger, eiwitsynthese is sterk verminderd, maar blijft op een laag niveau met behulp van arginine uitgebracht door de omzet van bestaande eiwitten. Monsters zijn geoogst op het moment punten aangegeven in Figuur 4. Nadat alle monsters zijn geoogst in TCA, 5% van de MAS1074 piek-cellen tRNAselC, overexpressing was toegevoegd aan elk monster zoals geïllustreerd in Figuur 1. RNA was gezuiverd van de monsters, gescheiden door elektroforese en bevlekt op een membraan zoals beschreven in het protocol. Het membraan was gesondeerd voor tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNAhisRen tRNAselC, zoals te zien in Figuur 2. Het signaal van de straling van elke rijstrook was gekwantificeerd voor elk van de vier sondes als geïllustreerd in Figuur 3, en gecorrigeerde en genormaliseerde zoals beschreven in paragraaf 11. De resultaten worden gepresenteerd in Figuur 4. Figuur 4A toont dat de niveaus van alle geteste tRNA soorten snel tijdens aminozuur honger, als onlangs gemelde4 afnemen. Figuur 4B toont aan dat het tRNA opladen niveaus gedragen zoals verwacht: de geladen breuk van de aanvaarding van arginine tRNA daalt snel na verwijdering van arginine uit het groeimedium, terwijl het opladen van de andere tRNAs te verhogen iets op honger omdat tRNAs zich ophopen als hun tarief van decharging bij de ribosomen als gevolg van het ontbreken van substraat voor eiwit synthese4 afneemtin rekening gebracht. Verder in de periode van de honger, de geladen tRNA breuk af tot ongeveer pre honger niveaus als gevolg van de afbraak van de meerderheid van het tRNA-zwembad (figuur 4A), wat in een hoger tarief resulteert van decharging van de resterende tRNAs op de ribosomen. Daarentegen verhoogt de geladen Fractie van tRNAargVYZQ voor ten minste twee redenen; 1) activering van de strenge reactie houdt in dat mRNA, niet ten laste van tRNAarg, de beperkende factor voor vertaling wordt en 2) de totale pool van tRNAarg is verminderd (figuur 4A) dus een grotere fractie van de totale tRNAarg kan worden opgeladen met hetzelfde kleine bedrag van arginine. Dit experiment toont aan hoe de gelijktijdige metingen van tRNA overvloed en tRNA opladen niveaus biedt hoogwaardige informatie over de voorwaarden voor de eiwitsynthese in de cel.

Figure 1
Figuur 1. Toevoeging van spike-cellen aan samples. In dit voorbeeld worden de monsters uit een enkele cultuur van E. coli NF915 geoogst in een tijdreeks vóór en tijdens het aminozuur honger. Een schematische voorstelling van de groeikromme van NF915 wordt weergegeven, waar de blauwe stippen geven de punten van monster oogst. De Y-axes zijn de logschaal. Monsters van de experimentele culturen worden geoogst, zoals beschreven in sectie 3. Een schematische voorstelling van de groeicurve van de stam spike-in MAS1074 wordt ook weergegeven, met de punt van monster oogst aangegeven als een blauwe stip. Het punt van de figuur is om te illustreren dat alle experimentele monsters (van E. coli NF915 in dit voorbeeld) een aliquoot gedeelte van het piek-cellen van dezelfde referentie cultuur ontvangen. Elk monster, 5% van de piek-cellen worden toegevoegd aan de experimentele cellen, berekend op basis van de OD van de celculturen (zie punt 4). RNA is vervolgens gezuiverd van alle monsters en gebruikt voor noordelijke vlekken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Fosfor imager scan van een noordelijke vlek gesondeerd voor de aangegeven tRNAs. Het membraan bevat RNA van de E. coli -stam NF915 geoogst op de aangegeven tijdstippen vóór en na de inductie van arginine honger (minuten). Bovendien, het membraan bevat twee rijstroken van monsters waar spike-cellen zijn weggelaten (-selC DA en -selC), en een baan met RNA vanuit de spike cellen alleen (selC). Het monster - selC DA bevat chemisch deacylated tRNA. De twee bands vertegenwoordigen de geladen en ongeladen tRNA-soorten zijn duidelijk gescheiden. Opmerking het te verwaarlozen signaal van tRNAselC in de rijstroken toegevoegd zonder spike-cellen. Het dezelfde membraan was achtereenvolgens ontdaan en reprobed voor de tRNAs aangegeven aan de linkerkant. De doos gebied in het bovenste vlek geeft het deel van de vlek, die wordt weergegeven voor de latere tRNA-probings. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Kwantificering van noordelijke vlek. tRNA overvloed is gemeten met behulp van software. (A) A één rijstrook van de noordelijke vlek te zien in Figuur 2 gesondeerd voor tRNAargVYZQ. De bovenste en onderste pijl geven de aminoacylated tRNA en de deacylated tRNA, respectievelijk. De rode lijnen die parallel lopen met de lane zijn toegevoegd en gebruikt om het gebied voor kwantificering te definiëren. (B) kwantificering van signaal binnen de twee gebroken rode lijnen gezien in (A) afgebeeld als een grafiek, waar de horizontale as geeft de afstand vanaf de bovenkant van de lijn in (A) (in pixels) en de verticale as geeft de intensiteit van het signaal (in punten). De twee pieken met signaal van oorsprong uit de aminoacylated tRNA en de deacylated tRNA, respectievelijk, zijn handmatig gedefinieerd. De gegevens die wordt geëxporteerd voor nadere analyse is de waarde die overeenkomt met het gebied onder elk van de twee bergtoppen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Representatief resultaat: kwantificering van tRNA abundanties eend opladen niveaus tijdens arginine honger. Kwantificering van de bands op de noordelijke vlek afgebeeld in Figuur 2. (A) de relatieve abundantie van tRNAgltTUVW (rood), tRNAargVYZQ (blauw) en tRNAhisR (groen). Het niveau gevonden op nul minuten (monsters geoogst vlak voor het begin van de honger) is ingesteld op 1. (B) niveau van de zelfde drie tRNAs zoals in (A) in rekening te brengen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Sonde specificiteit Sonde-reeks
tRNAargVYZQ 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC
tRNAgluTUVW 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG
tRNAhisR 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC
tRNAleuPQVT 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC
tRNAleuU 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG
tRNAleuW 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC
tRNAleuX 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA
tRNAleuZ 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT
tRNAlysQTVWYZ 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC
tRNAthrV 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA
tRNAtyrTV 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA
tRNAselC 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC

Tabel 1. Tabel van voorgestelde sonde sequenties voor geselecteerde tRNAs in E. coli K-12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol wordt beschreven hoe u tegelijkertijd het te meten opladen van specifieke E. coli tRNAs en het relatieve niveau van de tRNAs in verschillende steekproeven te vergelijken. De kritieke punten van het protocol zijn 1) om de monsters op zodanige wijze dat de cellulaire tRNA opladen niveaus worden bewaard, 2) om te normaliseren tRNA hoeveelheden op zodanige wijze dat relatieve tRNA niveaus in verschillende monsters op betrouwbare wijze kunnen worden vergeleken, en 3) om de sp ecificity van de geselecteerde sondes voor de tRNAs van belang. Deze punten zijn afzonderlijk behandeld onder.

tRNA zuivering

De tRNAs worden gezuiverd van E. coli in een zachte manier, die is geoptimaliseerd voor het behouden van hun cellulaire opladen niveaus. Het is onze ervaring dat dit protocol hoofdzakelijk uittreksels RNAs korter zijn dan 150 nt, tRNA vormt dus een groot deel van de gezuiverde RNA. Om deze reden is het niet aanbevolen om dit protocol te gebruiken voor het zuiveren van totaal RNA van E. coli. Het hier gepresenteerde protocol moet ook geschikt zijn voor de detectie en kwantificering van andere RNAs zoals kleine RNA (sRNA) zonder verdere aanpassingen. Omdat het RNA extractie protocol voor korte RNA-sequenties verrijkt moet het ook gebruik vinden, zelfs als de sRNA onderzochte nederigen wordt uitgedrukt.

Normalisatie door spike-cellen

Om de niveaus van het tRNA van verschillende monsters met elkaar vergelijken, is het noodzakelijk om te normaliseren van het tRNA niveaus tot de niveaus van een afschrift van die aanwezig is in hetzelfde gemiddelde nummer per cel in alle monsters, om te corrigeren voor monster-naar-sample variaties in RNA herstel en gel laden. Voor dit doel spike we de monsters met 5% van verwijzingen naar cellen die overexpress van de zeldzame tRNAselC vóór RNA zuivering. De piek-in methode verdient de voorkeur boven het gebruik van een endogene RNA als referentie, omdat hierdoor de vergelijking van tRNA niveaus over voorwaarden waar geen endogene RNAs met zekerheid bekend zijn te vinden op dezelfde cellulaire concentratie. E. coli cuvetten als de Prikker-in heeft het nadeel dat 5% extra E. coli RNA wordt toegevoegd aan alle experimentele monsters, waar het bijdraagt aan het signaal van het RNA van belang. Dit vooroordeel is verantwoord door met inbegrip van een monster met alleen de spike-in cellen die op elke noordelijke vlek, en corrigeren van de RNA-waarden zoals beschreven in stap 11.4.1. De expressie van tRNAselC in wild type cellen is zo laag ten opzichte van andere tRNAs (Zie Figuur 2) dat het niet een significant verschil in kwantificering en dus kan worden verwaarloosd. Echter in de referentiestam MAS1074, waar selC wordt uitgedrukt door een T7 promotor op een hoge kopie plasmide, we schatten dat minstens 1,000-fold meer tRNAselC wordt geproduceerd in de aanwezigheid van 1 mM IPTG dan die geproduceerd door wildtype E. coli K-12 onder geen enkele voorwaarde. MAS1074 niet langer groeien na twee generaties van de volledige IPTG-inductie. Op dat moment cultuur-naar-cultuur verschillen in inductie van tRNAselC zijn klein, en niet een bron van zorg voor dit protocol als alle aliquots met spike-cellen voor een enkele experiment zijn ontleend aan de dezelfde geïnduceerde cultuur van MAS1074. Als alternatief voor MAS1074, kunnen cellen van een organisme waarvan RNA niet met de kruising sonde cross-react zal worden gebruikt als spike-cellen. Sulfolobus solfataricus cellen zijn met succes gebruikt als spike-in voor experimenten met E. coli tRNA4. E. coli spike cellen zijn echter waarschijnlijk nauwkeuriger weerspiegelen de mate van lysis van de cel van de experimentele cellen, zoals het is onzeker of S. solfataricus lyses met de dezelfde efficiëntie als E. coli. Ook het groeiende S. solfataricus is meer vervelend aangezien zij bij 85 ° C met een generatietijd van ~ 16 h groeien.

Waarborgen van de specificiteit van de geselecteerde tRNAs

Als zowel aminoacylated als deacylated tRNA met succes geweest moeten gezuiverde twee bands worden gedetecteerd op de noordelijke membraan. De afstand tussen de twee bands zal verschillen afhankelijk van de specifieke tRNA onderzochte, en is een gecombineerde gevolg van het verschil in grootte, polar eigenschappen en conformatie die een bepaald aminozuur veroorzaakt wanneer het een bepaalde5-tRNA bindt . Bijvoorbeeld, de afstand tussen de aminoacylated en de deacylated tRNA is groter voor tRNAargVYZQ dan die van tRNAgltTUVW, zoals te zien in Figuur 2. Als gevolg van de grote omvang van de gel gebruikt hier om te scheiden van het RNA, is de resolutie hoog genoeg opgeladen tRNA onderscheidt ongeladen, maar ook om te onderscheiden van de meeste van de verschillende tRNAs van elkaar als gevolg van hun verschillen in lengte, volgorde samenstelling en wijziging patronen. Zelfs isoaccepting tRNAs kunnen worden onderscheiden, zoals voor de aanvaarding van tRNAs2leucine. Opmerking dat in deze studie was het niet mogelijk om te onderscheiden van tRNAleuPQV van tRNAleuT, als het verschil in de juiste volgorde is echter slechts één G aan T substitutie.

Als meer dan twee bands wordt weergegeven op de noordelijke membraan zou het een gevolg van kruisreactie van de sonde met andere RNAs. Verhoging van de striktheid van het wassen stap (9,5) door het verhogen van de temperatuur kan meestal dit oplossen. 30 min bij 55 ° C wassen is meestal voldoende. Als verhoging van de striktheid wassen niet dwars-kruising verwijdert, kan de oplossing zijn om het ontwerpen van een nieuwe sonde die complementair is aan een ander (vaak deels overlappende) deel van de reeks tRNA. Ook kan extra bands "Carry-over" van een vorige sonde, als gevolg van onvoldoende strippen van het membraan. Om dit te voorkomen, doen een strip-besturingselement door het membraan voordat opnieuw indringende bloot te leggen. Als bands wordt weergegeven op de control-scan dat het membraan kan nodig zijn extra strippen. Het is meestal mogelijk opnieuw sonde een membraan ten minste 8 - 10 keer maar na verschillende sondes het kan moeilijk zijn om volledig strippen. Als dit het geval is, kan het membraan worden opgeslagen voor een paar maanden voordat het opnieuw sonderen als 32P vervalt snel.

Verdere verificatie van de specificiteit van de sonde kan worden verkregen door het uitvoeren van een Noord vlek met cellen geoogst onder een aantal voorwaarden waarbij wordt verwacht dat het transcript van de rente op een voorspelbare wijze worden beïnvloed. Bijvoorbeeld afleidbare uitdrukking van het tRNA uit een plasmide of aminozuur honger voor de cognaat aminozuur, moet leiden tot een verbeterde relatieve expressie niveau of een lagere opladen, respectievelijk van het tRNA van belang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Marit Warrer voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek | Natuurwetenschappen [1323-00343B] en de Deense nationale Research Foundation [DNRF120].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urea Merck 57-13-6 Purity >99%
Polyacrylamide Serva 79-06-7
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) BIO-RAD 161-0201
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma 76-03-9
Phenol Merck 108-95-2
IPTG
Glucose
Sodium Acetate
EDTA
Ethanol
Tris
Hydrochloric acid
Sodium Chloride
NaH2PO4
Sodium Citrate
SDS
Herring Sperm DNA Sigma 100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 γATP Perkin Elmer
DNA oligos (probes) TAG Copenhagen
Hybond N+ membrane GE Healthcare RPN203B
Crosslinker
Electroblotter BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner GE Healthcare 28955809
Spectrophotometer
Hydridization oven
Geiger-Müller tube
Phosphor imager screen GE Healthcare
Hybridization tube
Culture Flasks
1.5 ml microcentrifuge tubes
20 ml centrifuge tubes
Name Company Catalog Number Comments
Software
ImageQuant GE Healthcare
Excel Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
  3. Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
  4. Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
  5. Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
  6. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
  7. Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
  8. Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).
  9. Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
  10. Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  11. Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
  12. Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
  13. Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  14. Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).
  15. Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
  16. McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
  17. Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
  18. Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
  19. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  20. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  21. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  22. Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
  23. Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).

Tags

Biochemie kwestie 126 Escherichia coli RNA zuren niet-coderende RNA RNA zuivering transfer-RNA opladen niveau aminoacylation RNA kwantificering noordelijke vlek.
Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., … More

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., Svenningsen, S. L. Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56212, doi:10.3791/56212 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter