Summary
スパイクの追加に基づく異なるサンプル間転移 RNA の相対的なレベルまたは他の短い RNA を比較する方法と同様、精製されたエシェリヒア属大腸菌RNA からレベルを充電転送の RNA を直接測定法を紹介します。参照の遺伝子を発現する細胞。
Abstract
トランスファー RNA (tRNA) は、あらゆる有機体の並進機械の重要な部分です。Trna はバインドし、アミノ酸をリボソーム翻訳に転送します。別の Trna の相対的なレベルと aminoacylated の比を合計 tRNA、充電レベルとして知られている tRNA が精度と翻訳のスピードを決める重要な要素。したがって、豊かさと Trna の充電レベルは、たとえば種々 の応力条件下でのタンパク質合成の勉強を測定する重要な変数です。ここでは、tRNA を収穫し、相対的な豊かさと大腸菌における特定の tRNA 種の絶対的な充電レベルを直接測定する方法をについて説明します。TRNA は、tRNA とアミノ酸の間不安定な結合が維持されることそのような方法で収穫されます。RNA ゲル電気泳動および北しみが付くこと、充電、非荷電の Trna の分離の結果にさらされます。正規化のためのスパイクの細胞のための異なるサンプルで特定の Trna のレベルを比較できます。RNA 精製の前に、各サンプルにまれな tRNAselCの過剰大腸菌細胞の 5% を追加します。サンプルの興味の tRNA 種の量は、同じサンプルの tRNAselCの量に正規化されます。スパイクで細胞の RNA の浄化前の追加サンプルのセル換散の効率の違いも占める浄化されたスパイクで Rna のさらに利点があります。
Introduction
以下では、特定の Trna の定量化手法を提案し、北にしみが付くことによってレベルに充電を測定します。最初 Varshneyらが開発した技術に基づく1。 トリクロロ酢酸 (TCA) に細胞を収穫し、RNA 精製中の 0 の ° C でサンプルを維持する、tRNA とアミノ酸のエステル結合が保存された2,3,4。Aminoacylated Trna で区別できる nonacylated 対応ゲル電気泳動とブロッティング、ため、aminoacylated の減少移動する共有結合アミノ酸5によるゲルの tRNA。さらに、使用頻度の低い tRNAselC 4を過剰発現細胞のスパイクの添加 tRNA の量の正規化のためのプロトコルを提案する.
細菌の細胞の翻訳機械の絶対に不可欠な部分の最も豊富な分子である Trna。Trna はアミノ酸をバインドし、翻訳のリボゾームにそれらを転送します。Trna のアミノアシル化 (充電) するためにアミノ酸の結合は、アミノアシル tRNA シンテターゼによって促進されます。別の充電された Trna の相対的な豊かさはタンパク質合成の忠実性を確保するため重要な同系の過少請求指定されたメッセンジャー RNA (mRNA) コドンの tRNA 同系近く tRNA がされる可能性が高くなりますので誤ってそのアミノ酸をリボソーム6成長ポリペプチド鎖に配信します。充電された tRNA の重要性は、tRNA; の充電レベルの深刻な低下にエシェリヒア属大腸菌細胞の広範な応答に反映されます。厳格な応答です。厳格な応答時に Trna、リボソーム Rna とほとんど Mrna の合成はアミノ酸の生合成やストレスの生存に関連付けられている特定の Mrna の転写を支持して低下され、細胞の成長率を劇的に下げた7.さらに、われわれや他の最近の作品は、大腸菌が tRNA レベルの調整可能性があることを示唆している制限する翻訳4,8ストレスへの応答で、tRNA の大半を積極的に劣化することを示しています。このようなストレスに対処するために重要です。したがって、tRNA 微量含有量と充電レベルの信頼性の高い計測は完全に細菌のストレス反応を理解するための重要なツールになります。
エシェリヒア属大腸菌組換え蛋白質を表現する使用され、種のコドン使用の違い、最適な表現はしばしば直面する問題9。これは組換え mRNA10を変換に必要な追加の Trna の式によって回避できます。TRNA のような株のレベルを充電の測定ことができるトラブルシューティングの努力を導くし、蛋白質の表現を最適化するため。
このメソッドは、また"mischarging"の検出を可能にします。非同種のアミノ酸を tRNA 分子 aminoacylated。種類のアミノ酸によってアミノアシル化は、ポリアクリルアミドゲル1,11をわずかに異なる速度で移行する tRNA を引き起こす可能性があります。いくつかのケースでは、そうでなければ同じ Trna3異なる修飾パターンを区別するためにメソッドを使用できます。
別は、tRNA の充電レベルの調査は酸化を過ヨウ素酸の生化学的なプロシージャを設立しました。メソッドは、tRNA から保護 aminoacylated に酸化が過ヨウ素酸中性 tRNA ではない観察に依存します。後、酸化処理収穫された RNA の充電レベルの見積もりに使用、tRNA の充電過ヨウ素酸します。しかし、このようにいくつかの不正確さ12を提供する治療によって影響を受けるいくつかの Trna の充電を示されています。メソッドは、浄化された RNA から直接充電、化学か酵素の反応からどんな先入観を排除対策を紹介しました。このメソッドの制限の 1 つは時間がかかり、やや多く Trna のデータを収集するは面倒だが、同じ北のしみの除去および複数の Trna の reprobed できるように、時だけ 1 つの tRNA 種が検出されました。
互いにサンプルの正規化の信頼性の高い方法は、異なるサンプルの間で分子の相対的なレベルを比較することの研究で不可欠です。ここまれな tRNAselCを過剰発現大腸菌細胞の小さい因数のスパイクでとしての RNA の浄化の前にすべての実験サンプルに追加されます RNA の正規化の手順を紹介します。このメソッドは、Trna を調べるときだけでなく、RNA の任意の種の相対的な定量化のためのすべてのサンプルで同じ細胞濃度で提示実験のセットアップがこのような内因性 RNA がないする信頼できる便利です。たとえば、「ハウスキーピング」RNA のようなリボソーム RNA レベルは別の RNA 間の相対的な量を比較する内因性参照サンプル13、によく使用されます。しかし、これは少し使用の参照 RNA の細胞濃度のサンプル間の相違ストレス応答15,16,17中または中にサンプリングが発生した場合、リボソーム RNA のためのケースをすることができます。固定相17へ参入。スパイクで細胞の RNA の浄化の前に実験サンプルへの添加は、正規化サンプリング設定の独立の堅実で正確な方法を提供します。標準化の別の方法は、RNA 精製後 1 つまたは複数のスパイクで Rna の実験サンプルに追加です。ただし、このメソッドは、サンプルの RNA の回復の違いについては考慮しません。
エシェリヒア属大腸菌細胞を用いた大腸菌の実験でスパイクの細胞 (図 1を参照) として参照 RNA が欠点があるその過剰さらに外因性大腸菌の少量の合計する RNA、サンプル。我々 はスパイクでのみセル (参照図 2,の車線「selC」というラベルの付いたしみ北) 実験サンプルと並行を含むサンプルを分析することによりこのほかの修正します。提示プロトコルエシェリヒア属大腸菌K-12 の開発がほとんどの細菌種に適用する可能性があります。
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Protocol
1 細菌文化の準備。
。 せいぜい 1/6 の文化/フラスコの容積比のエルレンマイヤー フラスコの- すべて育てる文化。典型的な実験設定で成長 37.0 ° C で文化や morpholinepropanesulfonic 酸 (モップ) 最小培地で 18 最寄りの炭素源、少なくとも 10 のたとえば 0.2% グルコースを添加した 160 rpm で揺れRNA の収穫前に連続した世代 。 RNA の収穫前日の
- モップ目的 OD 436 希望の時間次の日になるような方法で最小媒体で必要なひずみの小さくなった文化を薄くしなさい。数式による接種に使用する小さくなった文化の体積を計算:
注: ここでは、OD 新しい 示します目的 OD 436インキュベーション後、V 新しい 希釈培養量を示します、OD 古い から薄く小さくなった文化の OD 436 を示します、G 文化が成長、世代数を表しますから、(t 2) の翌日を必要とし、として計算することができます希釈 (1 t) の時間: 時間の差 (分) t 1 と t 2 世代時間 (分) で割って。G サンプリング時の定常成長するように、する必要があります ≥ 10;V 古い 新鮮な媒体に転送する必要があります外の培養のボリュームを示します。この式はラグ フェーズの考慮していない近似です。新鮮なメディアで外培養の希釈後しばしば観察される現象。- 成長条件は、実験の目的によって異なりますを制限する (推奨)、結果の再現性を高めるため tRNA レベルの細胞に変化はサンプリングの前に状態を安定させるため文化を育てる 19.
2。スパイクで細胞の調製
注: 大腸菌 の菌株 MAS1074、selC tRNA selC イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) の制御の下で遺伝子を表現-誘導型プロモーター、スパイクのひずみとして使用されます
。- Dilute モップで 0.05 の OD 436 人と MAS1074 の小さくなった文化最小媒体 100 μ g/mL アンピシリンと 0.2% グルコースを添加しました。160 rpm で揺れ 37 ° C で文化を育てる
。 注: 代替参照ひずみの使用のため の議論 を参照してください 。
- で OD 436 ~ 0.1、最終濃度 tRNA selC の発現を誘導する 1 mM の IPTG を追加します。OD 436 ~0.5 する文化を育てる (3 ~ 4 成長の h) し、培養用フラスコを氷浴に移動します。すべてのサンプルの RNA の浄化のために収穫されているまで氷のスパイクで細胞培養を維持します 。
3。実験サンプルの収穫
。- 前暖かい (37 ° C) 1 つは上限 100 mL 三角フラスコ (または類似の) 温水のお風呂に置くことで各サンプルの 4 mL 10% (w/v) トリクロロ酢酸 (TCA) が含まれている
。 注: 注意 TCA を分解加熱、クロロホルム、塩化水素を含む有毒で腐食性のガスを生産します。水溶液の水は強酸です。それは塩基と激しく反応し、多くの金属に腐食性です。この液体を使用する場合、適切な予防措置を撮影必要があります 。
- 細胞収穫直前に測定し、記録文化の OD 436 。
- セルを収穫する TCA を含む予め温めておいたフラスコに文化の 4 mL を転送します 。
- は、TCA と 5 s. の混合直後にすべて酵素を無効にし、したがって、Trna の充電レベルを維持のためにフラスコを手で旋回でサンプルをミックスします
。 : 複数のサンプルを収集する場合は、注意収穫サンプル TCA 氷の上まで、すべてのサンプルが収録されています 。
4。電池スパイクの添加
注: 手順 2 でスパイクのセルの準備を説明
。- ときすべての RNA の準備のためサンプルが収集されている、各サンプルに 5% スパイクのセル (OD に基づく) を追加します
。 メモ: 必要なスパイクで細胞培養のボリュームは、数式によって算出されて:
V スパイク とスパイクで細胞培養のボリュームを表します場所 Vexpボリュームを表します (TCA) なし収穫実験細胞文化の OD 経験 は TCA に収穫の時に実験的細胞培養の OD 436 を表します。OD スパイク スパイクで細胞培養の OD 436 を示します。サンプルごとに上記の式によると追加のスパイクでセルのボリュームを調節する必要があります複数のサンプルは、異なる ODs で収穫され場合、 。
スパイクの細胞から、関心の RNA 種への貢献を定量化する - 4 ml TCA スパイクでセル 4 mL を混合することによってのみスパイクでセルを含むサンプルを準備します。他のサンプルと同じ方法でこのサンプルから RNA を準備します 。
- 必要に応じて、スパイクの細胞、実験試料のみを含む別のフラスコを取るし、tRNA に実験サンプルの貢献を定量化することは、selC レベル; で tRNA selC の内因性のレベル大腸菌 K-12、サイドス 。
5。RNA の準備
注: ここで説明した、RNA の準備のプロトコルが本質的に Varshney ら によって記述 1;浄化中 aminoacylated Trna の結果を避けるために、酸性 pH で、浄化のコース全体で 0 の ° C でサンプルを保持する重要です。サンプルおよび、ソリューションを保持するためにクリーンな滅菌チューブ/フラスコを使用し、水超純水 (18.2 MΩ·cm 抵抗) とすべてのソリューションを準備します
。- 氷冷蔵遠心管に各サンプルの注ぐ 8 mL。4 ° c. 完全に削除上澄みで 9,500 × g で 10 分間のサンプルを遠心し、0.3 mL 冷たい 0.3 M ナトリウムのアセテート、pH 4.5 と 10 mM EDTA で再懸濁します 。
- 冷たい 1.5 mL 遠心チューブに各サンプルを転送し、0.3 mL フェノールと同じバッファーを追加します
。 注: 注意 をフェノールの有毒ガスを生成し、皮膚に腐食性が高い 。
- 渦各サンプル 10 x 15 のそれぞれの渦の間少なくとも 1 分で s。ボルテックスの間に 0 時サンプルを保つ ° c. を使ってサンプルを確保して冷たい、頻繁に一時停止 。
- 4 で 20,000 × g で 15 分遠心分離機サンプル ° C. 転送水段階 (上相) 新しい 1.5 mL 遠心チューブします。0.3 mL 冷たいフェノールと渦 4 x 15 s を前に追加します 。
- 4 で 20,000 × g で 10 分間遠心 ° 2.5 倍量の 96% のエタノール (~ 750 μ L) を含む C. 転送冷たい新しい 1.5 mL 遠心に水相のチューブします。1 時間-20 ° c または一晩-80 でチューブの孵化によって RNA を沈殿させ ° C
- 4 で 20,000 × g で 30 分間遠心分離機サンプル ° C は、上澄みを廃棄し、RNA の餌を乱すことがなく 1 mL 冷たい 70% エタノールを慎重に追加。軽く一度エタノールでチューブの内面を洗浄する反転します
。 注: ペレットはこのステップで参照してくださいするは難しいことができます 。
- 4 で 20,000 × g で 10 分間遠心する ° c. 完全に上澄みを除去し、エタノールがなくなるまでペレットを風乾します。20 μ L 冷たい 10 mM ナトリウム酢酸 pH 4.5、1 mM EDTA で精力的にボルテックスでペレットを再懸濁します
。 注: 乾燥しないでください過剰ペレットを再懸濁しますにくくなる 。
- 必要に応じて、260 で吸光度を測定することにより RNA 濃度を評価する nm 。
- 必要に応じて、agarose のゲルの電気泳動の 20 によって浄化された RNA の品質を評価します 。
- ストア サンプル-80 ° C
注: プロトコルがここで一時停止にすることができます 。
注: aminoacylated のバンドを区別するために北にその競合相手から tRNA のしみ、化学的に競合因数はアルカリ処理によって準備されます。ほとんどの目的に deacylate 1 つのサンプルそれぞれの北のしみのため十分です
。 氷の上の- 雪解け RNA サンプルです。RNA サンプルの 4 μ 因数を新しいチューブに転送します。46 μ L トリス塩酸 pH 9.0 を追加します。37 ° C で 2 時間インキュベート
- は pH 4.5 で 0.3 M ナトリウムのアセテートの 15 μ L を追加し、その後 96% のエタノールの 125 μ L を追加します。1 のための-20 ° C で RNA を沈殿させる
- 4 で 20,000 × g で 30 分間遠心する ° c. 完全に上清を除去、4 μ L 冷たい 10 mM ナトリウム酢酸 pH 4.5、1 mM EDTA で再懸濁します
。 注: プロトコルを一時停止できるここでは、サンプルが-80 で格納されている場合 ° C
7。ゲルの電気泳動およびブロッティング
- ミックス 4 μ L サンプル (未処理または化学的に競合) 6 μ L 読み込みバッファー (0.1 M 酢酸ナトリウム (pH 5.0)、8 M 尿素、0.05% ブロモフェノール ブルーとキシレンシアノール 0.05%).
: 注意セル スパイクでのみを含むサンプルを含むように、化学的に脱アシルされたサンプル (とスパイクの細胞、1 つが準備された場合なしサンプル). - は、0.4 mm 厚 6.5% ポリアクリルアミドゲル (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) 0.1 M 酢酸緩衝液 (pH 5.0) で 8 M 尿素を含むにサンプルをロードします。TRNA 種の適切な分離のため 60 cm 長いゲルを使用します 。
- 4 ° C で 10 V/cm のゲルの電気泳動による分離 RNA ブロモフェノール ブルーまで (~ 20 h) ゲルの底に到達します 。 しみが付くことの
- エリア キシレン cyanol 染料から、ブロモフェノール ブルーの方を 20 cm 染料を使用 (2 つの染料の間の距離は 25-30 cm にする必要があります)。慎重に 2 枚のガラス板を切り離すことで、ゲルがそれらの 1 つに残る。フィルター紙の薄い部分は希望のしみが付くエリアのサイズにカットし、しみが付くことに使用されるゲルの部分の上に配置。ろ紙でカバーされていない、ゲルの部分を切断し、破棄しますフィルター ペーパーを使用してガラス プレートからゲルの部分を持ち上げながら。
。 注: 大型のゲルは非常に壊れやすいので取り扱いに注意 。
- ゲルの上に正荷電のナイロン膜 (例えば Hybond N + 膜) を配置、転送バッファーとして 40 mM トリス酢酸 (pH 8.1)、2 ミリメートルの EDTA を使用して 90 分間 20 V で electroblotted です 。 紫外光を用いた膜に
- 架橋 RNA (0.12 J/cm 2).
注: 膜を常温保存今すぐことができます、プロトコルをここで一時停止することができます 。
8。プローブの設計と検証
注: 北のしみプローブの設計と検証、信頼性の高い結果を取得して他の RNA 種と不要な十字交配を避ける重要な注意してください
。- 使用短い合成オリゴヌクレオチド プローブとして。デザイン、それが興味の tRNA のシーケンスの最もユニークな部分に相補的な - これは頻繁にアンチコドン ループ方法でプローブ シーケンス
。 メモ: 様々 な生物から予測された tRNA シーケンスのリスト見つけることができますゲノムの tRNA のデータベース (GtRNAdb) 21. - 調整、予測を取得するシーケンスの長さ 55 65 ° c. の融点
- ブラスト (基本的なローカル配列検索ツール) 22 で説明されているようにシーケンスが選択した tRNA に一意であることを確認する実験では、使用される菌株のゲノム シーケンスに対して選択したシーケンスします
。 注: 表 1 は、大腸菌 K12 のいくつかの異なる Trna の推奨プローブの順序を示します。プローブが関心の tRNA の特定の場合のみ 2 つのバンドは北のしみ (充電し中性 tRNA) に表示されます、のみ 1 つのバンドは脱アシルされたサンプル (非荷電 tRNA) レーンに表示されます。以上 2 つのバンドが存在する場合、またはさらにプローブ特異性の検証が必要な場合は、ディスカッションを参照してください 。
9。北のしみの交配
注: 以下の手順で膜が順番にプローブと交配参照の特定のプローブを含む目的の特定の Trna に相補的な tRNA selC
。- は交配管内膜を置き 6 mL 交配ソリューションを追加 (0.9 M の NaCl、0.05 M NaH 2 PO 4 (pH 7.7)、5 mM の 0.5% (w/v) SDS、100 mg/mL, EDTA, 剪断が変性ニシン精子 DNA と 5 x Denhardt ' s 解 (100 xDenhardt ' s ソリューション 2%、2% ポリビニルピロリドン 40、2% ウシ血清アルブミンを = Ficoll)).
- は前 1 時間 42 ° c. を追加 30 pmol 放射性オリゴ DNA プローブ 5 で回転バッファー内膜を交配させる ' エンド - の付いた 32 P (Sambrook ら で説明されているように準備 23)
注: 注意、32 P から高エネルギーのベータ版の排出量は、実質的な皮膚や目線量ハザードを提示できます。適切な機関の安全プロトコルに従って処分すべき 32 p. 放射性廃棄物を使用してときに、適切な予防措置を取られるべき 。
- インキュベート 42 膜一晩回転プローブ ° C. 削除使い捨て 10 mL ピペットを使用してプローブします
。 メモ: 冷凍庫に格納されている場合、プローブを使用できます 。
- すぐに 0.3 M nacl、室温で 0.1% (w/v) SDS クエン酸ナトリウム 30 mM 50 mL で膜を洗浄する交配管
。 注: この最初の洗浄くらい自由なプローブが含まれています、高レベル放射性として処理する必要があります 。
- 繰り返し 9.4 を一度、ステップし、平らなプラスチック製のコンテナーまたはトレイ蓋を含む膜に移動します。洗浄液 (0.3 M 塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム 30 mM、0.1% (w/v) SDS) 膜をカバーし、室温で 30 分間インキュベートします 。
- は、洗濯ソリューションを変更し、洗濯するまで満足のいく信号対雑音比 (多くの場合洗浄ソリューションの 3-4 変更) を受けた。ガイガーミュラー管を使用して膜の空の領域からの放射を測定することによりノイズと信号の比率がどのように変化を検出およびプローブを tRNA に交配はどこエリアにそれを比較します 。 暴露後膜からプローブを除去することができるために
- こと (重要) 膜を乾燥していません除去の手順の前にことを確認します。膜が薄いビニール袋やラップをラップし、それがテープまたは溶接によって気密シールしっかりとプラスチックを使用して、します。Phosphorimaging 画面にシール膜を配置します
。 備考: phosphorimaging 画面に必要な露光時間決定のプローブは、特定のアクティビティによって RNA の量プローブ for、およびプローブの交配の効率は大きく異なります。数分数日から。経験とは、ガイガーミュラー管を持つ膜上で検出された放射線の強度は必要な露光時間の良い指示を与えます。信頼性の高い定量画面が露出しないことが重要です 。
- レーザー ・ スキャナーを使用して、phosphorimaging 画面をスキャンし、ファイルの保存 " .gel " 形式
。 注: 高い信号対雑音比は信頼性の高い定量化のため必要です。2 つのバンドになりますが tRNA のプロービング1 つ含む aminoacylated tRNA (遅い移行) と 1 つの含んでいる競合 tRNA (高速移動)。 図 2 を参照してください 。
10。膜を剥離
注: 膜のプローブ別 tRNA をことができます、前に前のプローブは、膜を取り去ることによって削除最初必要があります
。- 熱十分なストリッピング バッファー (15 mM 塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム 1.5 mM、0.1% (w/v) SDS) カバー、膜と膜にそれを注ぐ。室温で 15 分間インキュベーションします 。
- いいえ放射線まで繰り返しステップ 10.1 はガイガー ・ ミューラー管で検出できる; 膜再交配させられたセクション 9 で説明されている手順を実行できるようになりました 。
11。TRNA を定量化し、充電レベル
- 負荷イメージングに .gel ファイル ソフトウェア (材料の表 を参照してください)。信号できるできないも、 図 3 a に示すように、それは車線の幅の大部分にまたがるが、バンドのエッジを除外するような方法で各サンプル車線に沿って垂直線を描画します 。
- 可視化をクリックしてそれぞれの車線からカウント " 分析 "-> " グラフの作成 "。 図 3 b に示すように、それぞれの車線からチャージと中性の tRNA を表す 2 つのピークを手動で定義します 。
- をクリックして各々 のピークからカウントを取得 " 分析 "-> " エリア レポート "、それぞれ 2 つのピークの下の領域を記録と 。
- しみは tRNA selC の名所では、少なくとも 1 つの tRNA プローブされているときは、tRNA selC に関心の tRNA のレベルを正規化します。
- 各レーンのスパイクで細胞由来 tRNA の割合を計算し、方程式を用いた車線合計信号から減算:
注: ここでは、TRNA をサンプル 必要な trna; プローブ膜の単一の車線から得られた信号を =サンプル selC tRNA selC; を探るを受けて同じ膜の同じ車線から得られた信号を =Ref tRNA 必要な trna; プローブ同じ膜のスパイクでのみ細胞 RNA を含む車線から得られた信号を =Ref selC tRNA selC のプローブ同じ膜のスパイクでのみ細胞 RNA を含む車線から得られた信号を = します 。
正常化 - は除算同じ車線から tRNA selC 信号それぞれの車線から修正された tRNA 値
。 注: サンプルの細胞から tRNA selC 信号への貢献は無視 (参照してください 図 2、レーン標識 "-selC ").
- 各レーンのスパイクで細胞由来 tRNA の割合を計算し、方程式を用いた車線合計信号から減算:
- 両方のピークから信号の合計と充電された tRNA を表すピークの信号を割ることによって、各レーンのレベルを充電 tRNA を計算 (充電 + 非荷電).
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Representative Results
豊かさと充電前に、とアミノ酸飢餓の中に 3 つの Trna のレベルがエシェリヒア属大腸菌K-12 で測定されたここで説明手順を使用しています。
アルギニン auxotroph ひずみ NF9154 (木ルー彼くっティ mtl supE44) 0.4% グリセロール、50 μ g/mL スレオニン、ロイシン、アルギニン、37 ° c で揺れ 5 μ G/ml ヒスチジンとモップ最小培で少なくとも 10 世代の育ち160 rpm。アルギニン不足は、文化の上なくアルギニンとして新鮮なモップ中濁ろ過によって導入されました。アルギニン飢餓タンパク質合成は強く減るが既存の蛋白質の売り上げ高が発表したアルギニンを使用して低レベルで続けています。サンプルの時点で収穫された点は、図 4に示します。示すように、tRNAselCを過剰発現細胞のスパイクで MAS1074 の 5% が各サンプルに追加されたすべてのサンプルは、TCA に収穫された後、 図 1。RNA は、サンプルから精製、電気泳動で分離し、プロトコルで説明されているように、膜に消されました。膜は、図 2に見られるように、tRNAselC、tRNAhisR、tRNAgltTUVWtRNAargVYZQプローブだった。図 3に示すと修正されたセクション 11 で説明するように正規化と 4 つのプローブごとにそれぞれの車線からの放射電磁界信号の定量化を行った。結果は、図 4に掲載されています。図 4 aでは、すべてのテストされた tRNA 種のレベルが最近報告された4としてのアミノ酸飢餓の間に急速に減少を示しています。図 4 bは充電レベルが期待どおりに動作する tRNA を示す: その他の Trna の充電レベルが若干増大に対しアルギニン受け入れる tRNA の充電の割合が成長媒体からアルギニンの除去時に急速に低下飢餓のため Trna リボソームに decharging の彼らの率が低下する蛋白質合成4用基板の不足のための蓄積します。約前飢餓レベルで残りの Trna の decharging の大きい率で tRNA プール (図 4 a) の大半の劣化のために充電の tRNA の割合減少を飢餓時代にさらにリボソーム。少なくとも 2 つの理由; 対照的に、tRNAargVYZQの充電の割合を増加させる1) 厳格な応答の活性化意味翻訳の制限要因となる mRNA、tRNAarg、充電されていない 2)argは、tRNA のプールの合計の減少 (図 4 a) だから合計 tRNAの大部分を占める argアルギニンの同じ小さい量で課金することができます。この実験は、tRNA の豊かさと tRNA 充電レベルの同時測定が細胞内のタンパク質合成のための条件に関する質の高い情報を提供する方法について説明します。
図 1。スパイクの細胞サンプルへ添加します。この例では大腸菌NF915 の単一文化からのサンプルは前に、とアミノ酸飢餓の中に時系列に収穫されます。ブルーのドットがサンプルの収穫のポイントを示す、NF915 の成長曲線の模式図を示します。軸が対数スケールです。実験的ドシンドシンのサンプルは、セクション 3 で説明したように収穫されます。青い点で示されているサンプルの収穫のポイントには、スパイクのひずみ MAS1074 の成長曲線の模式図も表示します。図のポイントは、(この例では大腸菌NF915) のすべての実験サンプルが同じ参照文化からスパイクで細胞の因数を受け取ることを示すことです。計算実験のセルに、各サンプルにスパイクで細胞の 5% が追加されます (セクション 4 を参照) 細胞培養の OD に基づきます。その後、RNA はすべてのサンプルから精製された、北のしみに使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。指定された Trna の北のしみの蛍光イメージャ スキャン プローブします。膜には、大腸菌の菌株 NF915 アルギニン飢餓 (分) の誘導の前後に示された時点で収穫からの RNA が含まれています。膜がスパイクでセルが省略されているサンプルの 2 つの車線には含まれていますさらに、(-selC DA と - selC)、スパイクで RNA を含む車線細胞のみ (selC)。化学的に競合が含まれています - selC DA サンプルには tRNA。荷電ポリビニル tRNA 種を表す 2 つのバンドが明確に分かれています。車線の tRNAselCからごくわずかな信号もなくスパイクでセルを追加してください。同じ膜は連続して除去し、左に示されている Trna の reprobed。上のしみにボックス型の領域は、以降の tRNA probings の示されているしみの部分を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。北のしみの定量化します。tRNA の豊かさは、ソフトウェアを使用して測定されます。(A) A図 2 tRNAargVYZQ用プローブに見られる北のしみから単一の車線。上部と下部の矢印を示す、aminoacylated tRNA と競合、tRNA、それぞれ。車線と平行に走る赤いラインが追加され、定量化の領域を定義するために使用します。(B) (A) に見られる 2 つの壊れた赤線内の信号の定量化は、グラフの横軸 (a) (単位: ピクセル) の行の上端からの距離、縦軸 (カウント) で信号の強さを示していますとして描かれています。2 つのピークを含む信号発信、aminoacylated から tRNA と、競合、tRNA、それぞれが手動で定義されています。さらに分析にエクスポートされるデータは、それぞれ 2 つのピークの下の領域に対応する値です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。代表的な結果: tRNA の存在量の定量化、d アルギニン飢餓の中にレベルを充電します。図 2に示すように北のしみのバンドの定量化。(A) 相対的な豊富な tRNAgltTUVW (赤)、tRNAargVYZQ (青) と tRNAhisR (緑)。0 分 (飢餓の発症直前に収穫のサンプル) で見つけられたレベルは、1 に設定されます。(B) (A) のように同じ 3 つの Trna のレベルを充電します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プローブ特異性 | プローブ シーケンス |
| tRNAargVYZQ | 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC |
| tRNAgluTUVW | 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG |
| tRNAhisR | 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC |
| tRNAleuPQVT | 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC |
| tRNAleuU | 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG |
| tRNAleuW | 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC |
| tRNAleuX | 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA |
| tRNAleuZ | 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT |
| tRNAlysQTVWYZ | 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC |
| tRNAthrV | 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA |
| tRNAtyrTV | 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA |
| tRNAselC | 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC |
表 1。エシェリヒア属大腸菌K-12.で選択した Trna の推奨プローブの順序のテーブル
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Discussion
このプロトコルは、特定の大腸菌の充電レベルを同時に測定する方法をについて説明します Trna と異なったサンプルの Trna の相対的なレベルを比較します。1) 携帯電話の tRNA 充電レベルが保持されます、tRNA は、異なったサンプルの相対的な tRNA のレベルを確実に比較できる、そのような方法で数量を正規化するには 2) と 3) sp を確実にこのような方法でサンプルを処理するプロトコルの重要なポイントは、します。興味の Trna の選択したプローブの ecificity。これらのポイントは、以下個別に解決されます。
tRNA の浄化
Trna は大腸菌から自分の携帯電話の充電レベルを保持するために最適化された穏やかな方法で浄化されます。それは私たちの経験をこのプロトコルは主に 150 より短い Rna を抽出する nt、したがって tRNA の浄化された RNA の大部分を構成します。この理由から、エシェリヒア属大腸菌からの総 RNA の浄化するためにこのプロトコルを使用することはお勧めできません。ここで提示されたプロトコルは、任意のそれ以上の適応のない小さな RNA (スルナ) などその他の Rna の検出と定量に適して必要があります。短い rna の RNA の抽出のプロトコルを富ませるためには、たとえ捜査スルナは卑しい表現にも使用を見つける必要があります。
スパイクの細胞によって正規化
RNA のサンプルにサンプル変化の修正するために同じ平均すべてのサンプル内のセル数に存在するトラン スクリプトのレベルに tRNA のレベルを正規化する必要がある、異なるサンプルの間で、tRNA のレベルを比較するには回復とゲルの読み込み。この目的のための RNA の浄化の前にまれな tRNAselCノザン参照セルの 5% のサンプルを急上昇します。条件が、Rna 知られているない確信を持って同じ細胞濃度で発見される tRNA レベルの比較を可能にするので、スパイクでメソッドは、参照として内因性 RNA を使用して望ましいです。スパイクでとして大腸菌の細胞を使用して欠点がある余分なエシェリヒア属大腸菌の RNA はすべての実験サンプルに追加されます 5% が興味の RNA の信号に貢献しています。このバイアスはスパイクにしたセルだけがすべての北のしみを含む手順 11.4.1 RNA 値の補正サンプルを含むで説明します。SelC野生型細胞では、tRNA の式は非常に低い (図 2参照) その他の Trna とそれを比較して数量に大きな違いをしていないと無視されることが。しかしで、 selCが高いコピーのプラスミッドの T7プロモーターによって表される、参照株 MAS1074、推定 1 mM IPTG 存在下で少なくとも 1,000 倍以上 tRNAselCが作り出される場合よりも、野生型大腸菌大腸菌K-12 任意の条件の下で。MAS1074 は、完全な IPTG 誘導の二世代後成長しなくなります。その時点で、tRNAselCの誘導で文化に差が小さいとない単一の実験のためのスパイクの細胞のすべての因数としてこのプロトコルの心配が MAS1074 の同じ誘導文化から取得されます。MAS1074 する代わりに、その RNA が交配のプローブとは交差反応有機体からの細胞はスパイクのセルとして使用できます。スルフォロバス属 solfataricus細胞は、大腸菌tRNA4実験のためにスパイクのとして使用されている正常に。ただし、スパイクのエシェリヒア属大腸菌のセルは、実験細胞のセル換散の程度をより正確に反映する可能性が高いs. solfataricusと同じ効率を溶かすかどうかは不明です大腸菌。また、 s. solfataricusの成長は 85 ° C ~ 16 h の生成時間で育つより退屈です。
選択した Trna の特異性を確保
TRNA が正常にされている aminoacylated と競合精製の 2 つのバンドを北部の膜を検出できます。2 つのバンド間の距離は、捜査では、特定の tRNA によって異なります、サイズ、極性プロパティおよび特定のアミノ酸を引き起こす特定の tRNA5 をバインドするときの構造の違いの結合された結果は、.たとえば、aminoacylated と、競合間の距離 tRNA は tRNAgltTUVW、それは以上の tRNAargVYZQ 図 2に見られるように。RNA を分離するここで使用されるゲルのサイズが大きいの結果として解像度が十分に高い非荷電から充電された tRNA を区別するために、シーケンスの長さの違いからお互い異なる Trna のほとんどを区別するためにも構成、および修飾パターン。でも isoaccepting Trna は、Trna2を受け入れるロイシンの示すように、区別できます。ただし、本研究では、tRNAleuPQV tRNAleuTシーケンスの違いとして区別はありません注は T 置換するだけ 1 つの G です。
以上 2 つのバンドが北部の膜に表示する場合他の Rna のプローブの交差反応の結果かもしれない。温度を増やすことによって洗浄ステップ (ステップ 9.5) の逼迫を増やすことができます通常この問題を解決します。洗浄し、55 ° C で 30 分間で通常十分です。洗浄金詰りを増加しても、十字交配は削除されません、ソリューションは tRNA シーケンスの別の (頻繁に部分的に重複する) 部分に相補的な新しいプローブを設計することができます。追加バンド不足膜の除去の結果として、以前のプローブから繰越も可能です。これを防ぐためには、膜を再検出する前に公開することによって板の制御を行います。バンド表示コントロール スキャンの場合、追加の除去膜が必要があります。通常再、少なくとも 8 〜 10 回膜をプローブすることが可能だが、複数のプローブの後は、完全に除去するは難しいそれすることができます。これは、場合は、膜が再高速32P 崩壊として検出する前に、数ヶ月保存できます。
プローブ特異性のさらなる検証は、北を実行することによって得ることがしみを付けなさい細胞の一連の条件の下で収穫される興味のトラン スクリプトが予測可能な方法で影響を受ける予定です。たとえば、プラスミド、または同種のアミノ酸のアミノ酸飢餓から tRNA の誘導的発現になります相対発現レベルまたは低い充電レベル、それぞれ関心の tRNA の。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、優れたテクニカル サポート メッテ Warrer をありがとうございます。この作業は、独立した研究のためデンマーク評議会によって支えられた |自然科学 [1323-00343B] と [DNRF120] デンマーク国立研究財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
| Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
| Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
| Phenol | Merck | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| Glucose | |||
| Sodium Acetate | |||
| EDTA | |||
| Ethanol | |||
| Tris | |||
| Hydrochloric acid | |||
| Sodium Chloride | |||
| NaH2PO4 | |||
| Sodium Citrate | |||
| SDS | |||
| Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 γATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
| Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| Spectrophotometer | |||
| Hydridization oven | |||
| Geiger-Müller tube | |||
| Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
| Hybridization tube | |||
| Culture Flasks | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 20 ml centrifuge tubes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageQuant | GE Healthcare | ||
| Excel | Microsoft |
References
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