Summary
여기에 우리가 직접 스파이크에 추가에 따라 다른 샘플에서 이동 RNA의 상대적 수준 또는 다른 짧은 RNA를 비교 하는 방법 뿐만 아니라 순화 된 대장균 RNA에서 레벨을 충전 하는 전송 RNA를 측정 하는 방법 제시 셀 참조 유전자 표현입니다.
Abstract
이동 RNA (tRNA) 변환 기계 어떤 유기 체에서의 필수적인 부분입니다. tRNAs 바인딩할 하 고 번역 리보솜에 아미노산을 전송. 다른 tRNAs의 상대 수준 및 aminoacylated의 비율 충전 수준으로 알려진 총 tRNA에 tRNA는 정확성과 번역의 속도 결정에 중요 한 요소. 따라서, 풍요로 움과 tRNAs의 충전 레벨 측정 단백질 합성, 다양 한 스트레스 조건 예를 공부 하는 때에 중요 한 변수가 있다. 여기, 우리가 수확 하는 tRNA와 직접 상대 풍요로 움과 대장균에 특정 tRNA의 절대 충전 레벨을 측정 하는 방법을 설명 합니다. tRNA는 tRNA의 아미노산 사이 정한 채권 유지 되는 그런 방법으로 수확 이다. RNA는 다음 젤 전기 이동 법 그리고 북부 더럽혀, 충전 및 충전 tRNAs의 분리에는 결과를 받게 됩니다. 다른 샘플에서 특정 tRNAs 수준의 스파이크 셀 정규화의 추가 때문에 비교할 수 있습니다. RNA 정화, 전에 우리는 각 샘플에 드문 tRNAselC 당신과 대장균 세포의 5%를 추가 합니다. TRNA 종의 샘플에 관심의 금액은 다음 tRNAselC 동일한 샘플의 양을 정규화 됩니다. 스파이크에 RNA 정화 이전 셀의 추가 또한 샘플 사이 세포 세포의 용 해 효율 차이 차지 하는 순화 된 스파이크에 RNAs의 추가 이점이 있다.
Introduction
다음, 우리는 특정 tRNAs 측정에 대 한 방법을 제시 하 고 북부 blotting에 의해 레벨을 측정 하 고 그들의 충전. 방법은 먼저 Varshney 그 외 여러분 에 의해 개발 된 기술에 기반 1. trichloroacetic 산 (TCA)으로 세포를 수확 하 고 RNA 정화에 걸쳐 0 ° C에서 샘플을 유지는 tRNA는 아미노산 사이의 에스테 르 결합은 보존된2,,34. Aminoacylated tRNAs 구별 될 수 있다 그들의 nonacylated에서 젤 전기 이동 법 그리고 북부 blotting에 의해 때문에 aminoacylated의 감소 이동성에 기인한 covalently 바인딩된 아미노산5젤에 tRNA. 또한, 우리는 스파이크 셀 거의 사용된 tRNAselC 4overexpressing의 추가 의해 tRNA 수량 정상화에 대 한 프로토콜을 제시.
tRNAs 세균성 세포 및 번역 기계에의 한 절대적으로 중요 한 부분에 있는 가장 풍부한 분자의 일부입니다. tRNAs는 아미노산 바인딩 그리고 번역 리보솜에 그들을 전송. (Aminoacylation 또는 충전) tRNAs에 아미노산의 바인딩 aminoacyl tRNA synthetases에 의해 촉진 된다. Underrepresentation는 동계어의 청구 주어진된 메신저 RNA (mRNA) 코 돈에 tRNA 근처 동계어 tRNA는 가능성을 증가 하기 때문에 다른 충전된 tRNAs의 관계 되는 풍부는 단백질 합성의 품질 보장을 위한 중요 한 잘못 리보솜6에 성장 polypeptide 사슬의 아미노산을 제공 합니다. TRNA 위탁된의 중요성;는 tRNA의 충전 레벨에 심각한 드롭 대장균 세포의 광범위 한 응답에 반영 됩니다. 엄격한 응답입니다. 엄격한 응답 동안 tRNAs 리보솜 RNAs, 대부분 mRNAs의 합성은 아미노산 생 합성 및 스트레스 생존와 관련 된 특정 mRNAs의 녹음 방송에 찬성 하 여 하향 조정 하 고 세포의 성장 율은 극적으로 낮 췄 다7 . 또한, 우리와 다른 사람에 의해 최근 작품 대장균 적극적으로 대부분 tRNA 레벨의 조정 될 수 있습니다 제안 번역4,8을 제한 하는 스트레스에 대 한 응답에서의 tRNA의 저하를 보이고 있다 이러한 스트레스와 대처에 대 한 중요 한. 따라서, tRNA 나타났는데 및 충전 레벨의 신뢰할 수 있는 측정 세균성 긴장 응답을 완전히 이해 하기 위한 중요 한 도구가 됩니다.
대장균 은 일반적으로 재조합 단백질을 표현 하는 데 사용 됩니다 그리고 차이 codon 사용법에서 종 사이, 차선 식 자주 직면 하는 문제9. 이 재조합 mRNA10번역 하는 데 필요한 추가 tRNAs의 표현에 의해 피할 수 있다. 이러한 긴장에 레벨 충전 하는 tRNA의 측정 문제 해결 노력을 안내 하 고 단백질 식이 최적화 하는 데 도움이 수 있습니다.
이 메서드는 또한 "mischarging";의 검색을 수 있습니다. 비 동계어 아미노산 tRNA 분자 aminoacylated 다른 아미노산에 의해 Aminoacylation polyacrylamide 젤1,11을 통해 약간 다른 속도으로 마이그레이션할 tRNA를 발생할 수 있습니다. 경우에 따라 방법 또한 달리 동일한 tRNAs3에 다른 수정 패턴을 구별 하 사용할 수 있습니다.
다른 레벨을 충전 하는 tRNA의 조사는 산화를 periodate에 대 한 생 화 확 적인 절차를 설립. 메서드는 tRNA에서 보호 하는 aminoacylated periodate 산화 및 충전된 tRNA는 관찰에 의존 합니다. 후에 수확된 하는 RNA의 충전 수준을 추정 하는 데 사용은 tRNA의 재충전 산화 치료 periodate. 그러나, 여러 tRNAs 충전 표시 되었습니다 일부 부정확12제공 하는 치료에 의해 영향을 받을 것. 방법 제시 여기 측정값 순화 된 RNA에서 직접 충전, 따라서 화학 또는 효소 반응에서 어떤 편견을 제외. 이 방법의 한 가지 한계는 그 하나만 tRNA 종 그것은 어렵고 다소 많은 tRNAs에 데이터를 수집 하는 힘이 드는 비록 동일한 북부 오 점 제거 하 고 여러 tRNAs에 대 한 reprobed 될 수 있으므로 한 번에 검색.
서로 게 샘플을 정상화의 신뢰할 수 있는 방법은 목표 다른 샘플에서 분자의 상대적 수준을 비교 하는 연구에 생명 이다. 여기 우리는 RNA 어디 드문 tRNAselC overexpressing 대장균 세포의 작은 약 수는으로 추가 스파이크에 RNA 정화 전에 모든 실험 샘플에 대 한 표준화 절차를 소개 합니다. 이 방법은 tRNAs 검사 하는 경우에 뿐만 아니라 그러나 RNA의 어떤 종의 상대 정량화에 대 한 모든 샘플에서 동일한 세포 농도에 현재 아무 생 RNA 수 신뢰할 수 있는 그런 실험적인 체제 때 유용 하다. 예를 들어 다른 사이 다른 RNA의 상대적 양을 비교 하는 내 생 참조 샘플13로 "가사" RNA 같은 리보솜 RNA의 수준 자주 사용. 그러나 이것은 거의 사용 경우 참조 RNA의 세포 농도 샘플, 사이 차이 수 ribosomal RNA의 경우 샘플링 스트레스 응답15,,1617 또는 도중 발생 하는 경우 고정 단계17로 항목입니다. 스파이크 셀 이전에 RNA 정화 실험 샘플의 추가 샘플링 설치의 독립적인 정규화의 견고 하 고 정확한 방법을 제공합니다. 표준화의 또 다른 방법은 RNA 정화 후 하나 이상의 스파이크에 RNAs 실험 샘플의 추가 이다. 그러나,이 방법은 견본 사이의 RNA 복구에 차이 대 한 고려 하지 않습니다.
대장균 세포를 사용 하 여 참조 RNA 스파이크 셀 ( 그림 1참조)으로 대장균 에 대 한 실험 결과 단점이 그 overexpress 또한 외 인 대장균 의 작은 금액의 총 RNA에는 샘플입니다. 우리는이 추가 대 한 실험 샘플 (참조 그림 2, 차선 "selC" 라는 오 점 북)와 병렬로 스파이크에만 셀을 포함 하는 샘플을 분석 하 여 수정 합니다. 제시 하는 프로토콜은 대장균 K-12 위해 개발 하지만 대부분 세균성 종에 적용 될 것입니다.
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Protocol
1. 세균성 문화의 준비.
최대 1/6의 문화/플라스 크 볼륨 비율 삼각 플라스 크에- 성장 모든 문화. 전형적인 실험 설정에서 성장 37.0 ° C에서 문화 및 morpholinepropanesulfonic 산 (MOPS) 최소한의 중간 18 선호 탄소 소스, 예를 들어 0.2% 포도 당, 적어도 10와 보완에 160 rpm에 떨고 RNA 수확을 하기 전에 연속 세대.
- RNA 수확 전에 하루 희석 MOPS 다음 날 원하는 시간에 원하는 OD 436 도달할 것 같은 방법으로 최소한의 매체에서 원하는 스트레인의 능가 해 문화. 계산 수식으로 접종에 사용할 능가 해 문화의 볼륨:
참고: 여기, OD 새로운 나타냅니다 원하는 OD 436 부 화, 후 V 새로운 상징 희석된 문화의 볼륨, OD 오래 된 능가 해 문화에서 희석의 OD 436 나타냅니다, G 세대 문화, 성장 수를 나타냅니다에서 희석 (t 1)로 산출 될 수 있다 (t 2) 후 일 필요는 시간이 하의 시간: 시간 t 1과 t 2 세대 시간 (분)으로 나눈 값 (분)에서 차이. 샘플링 시간에 정상 성장을 보장 하기 위해, G는 이어야 한다 ≥ 10; V 오래 된 신선한 매체에 전송 해야-자란 문화의 볼륨을 나타냅니다. 이 방정식은 어떤 래그 단계; 고려 하지 않습니다는 근사 종종 신선한 미디어에서 밖으로 성장된 문화의 희석 후 관찰 하는 현상.- 성장 조건, 실험의 목적에 따라 달라 집니다 하지만 제한 셀 변형 tRNA 수준 (권장) 결과의 재현성을 증가 하 고 성장 샘플링 이전 상태를 꾸준히 문화 19.
2. 스파이크 셀의 준비
참고: 대장균 스트레인 MAS1074, tRNA selC는 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)의 통제를 인코딩 selC 유전자 표현- 유도할 수 있는 발기인 스파이크에 긴장으로 사용 됩니다.
- Dilute 능가 해 문화 MAS1074의 OD 436 MOPS에 0.05를 최소한의 미디어 100 µ g/mL 암 피 실린과 0.2% 포도 당으로 보충. 160 rpm에서 떨고 37 ° C에서 문화 성장.
: 참고는 대체 참조 긴장의 사용에 대 한 토론. - 에서 OD 436 ~ 0.1, tRNA selC의 표현을 유도를 1mm의 최종 농도에 IPTG을 추가 합니다. OD 436 ~0.5 문화 성장 (3-4 h 성장의) 문화 플라스 크를 얼음 목욕을 이동. RNA의 정화에 대 한 모든 샘플 수확 되었습니다 때까지 얼음에 스파이크에서 세포 배양을 유지.
3. 실험 샘플의 수확.
- 사전 따뜻한 (37 ℃) 한 출장 100 mL 삼각 플라스 크 (또는 유사한) 4 mL 10% (w/v) trichloroacetic 산 (TCA)를 포함 하는 온수 물 욕조에 그것을 배치 하 여 각 샘플.
참고: 주의 TCA 분해, 난방 시 염화 수소 및 클로 프롬을 포함 한 독성 및 부식성 가스를 생산 합니다. 물에서이 솔루션은 강한 산 성; 그것은 기지와 심하게 반응 하 고 많은 금속에 부식성 이다. 이 액체를 사용 하는 경우 적절 한 주의가지고 야 한다. - 셀 수확 직전 측정 하 고 기록 문화의 OD 436.
- 셀 수확, TCA를 포함 하는 미리 데워 진된 플라스 크를 문화의 4 mL 전송.
- 혼합 샘플 5 미 혼합 TCA와 즉시 모든 효소 활동을 억제 하 고 따라서는 tRNAs의 충전 레벨을 유지 플라스 크를 손으로 소용돌이.
참고: 여러 샘플 수집 될 경우, 계속 수확된 샘플 얼음에 TCA에서 모든 샘플이 수집 될 때까지.
4. 스파이크 셀의 추가
참고: 스파이크 셀의 준비 단계 2에서 설명.
- 때 모든 RNA 준비에 대 한 샘플 수집 되어, 각 샘플에 5% 스파이크 셀 (외경 기준) 추가.
참고: 필요한 스파이크에 세포 배양의 수식으로 계산 됩니다:
V 스파이크 스파이크에 세포 배양 필요의 볼륨을 나타냅니다 어디 V exp 볼륨을 나타냅니다 (TCA) 없이 수확된 실험적인 세포 배양의 OD 특급 TCA에 수확의 시간에서 실험 세포 배양의 OD 436을 나타냅니다. OD 스파이크 스파이크에 세포 배양의 OD 436 나타냅니다. 여러 샘플에서 다른 ODs 수확 하는 경우 스파이크 셀 추가 볼륨 각 샘플에 대 한 위의 공식에 따라 조정 되어야 합니다. - 관심, RNA 종 스파이크 셀에서 기여를 계량만 4 mL TCA와 스파이크 셀 4 mL를 혼합 하 여 스파이크 셀을 포함 하는 샘플을 준비 합니다. 이 샘플에서 준비 하는 경우와 동일한 방식으로 다른 샘플에서 RNA.
- 필요에 따라 다른 플라스 크 셀, 스파이크 없이 실험은 샘플만 포함 하 고 척도 tRNA에 실험 샘플의 기여를 포함 selC 수준, 에 tRNA selC의 내 생 수준 대장균 K-12는 사소 하 게 낮은.
5. RNA의 준비
참고: 여기에 설명 된이 RNA 준비 프로토콜은 기본적으로 Varshney 그 외 여러분에 의해 설명 1; 동안을 피하기 위해 deacylation aminoacylated tRNAs의 정화 그것은 산 성 pH에서 고 정화의 과정을 통해 0 ° C에서 샘플을 유지 하는 것이 중요. 깨끗 한 무 균 튜브/플라스 크를 사용 하 여 샘플 및 솔루션, 그리고 물을 초순 (18.2 ㏁ 저항력)와 모든 솔루션을 준비.
- . 샘플 4 ° C. 완전히 제거 상쾌한에 9500 x g에서 10 분 원심 및 0.3 mL 차가운 0.3 M 아세트산 나트륨, pH 4.5, 10 mM EDTA에에서 resuspend.
참고: 주의 페 놀 유독 가스를 생성 하 고 피부에 매우 부식성입니다.
참고: 펠 릿이이 단계에서 볼 힘들 수 있습니다.
참고:-건조 하지 마십시오 펠 릿 resuspend 어렵다 될 것 이다.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기.
참고: aminoacylated의 밴드를 구별 하는 북에 deacylated 대응에서 tRNA 오 점, 한 화학적 deacylated aliquot는 알칼리 처리에 의해 준비. 대부분의 목적에 대 한 각 북부 오 점에 대 한 deacylate 단일 샘플에 충분 하다.
얼음에- thaw RNA 샘플입니다. 새로운 튜브에 RNA 샘플의 4 µ L 약 수를 전송 합니다. 46 µ L Tris HCl pH 9.0을 추가 합니다. 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
- PH 4.5에서 0.3 M 나트륨 아세테이트의 15 µ L을 추가 하 고 그 후 96% 에탄올의 125 µ L을 추가. 1 헤에-20 ° C에서 RNA 침전
- 20000 x g 4에에 30 분 동안 원심 분리기 ° C. 완전히 상쾌한을 제거 하 고 4 µ L 찬 10 m m 나트륨 아세테이트 pH 4.5 및 1 mM EDTA에 resuspend.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기, 샘플-80에 저장 된 경우 ° c.
7. 젤 전기 이동 법 그리고 북부 blotting
- 믹스 4 µ L 샘플 (치료 또는 화학적 deacylated) 6 µ L 로드 버퍼 (0.1 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.0), 8 M 요소, 0.05 %bromophenol 파랑 및 0.05% 자일 렌 cyanol).
참고: 기억 스파이크에 셀만,를 포함 하는 샘플을 포함 하는 화학적 deacylated 샘플 (및 스파이크에 셀을 하나 준비 하는 경우 없이 샘플). - 에 0.4 m m 두께 6.5 %polyacrylamide 젤 (19:1 acrylam-ide:bisacrylamide) 8 M 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)에서 요소를 포함 하는 샘플을 로드 합니다. TRNA의 적절 한 분리를 위한 60 cm 긴 젤 사용.
- 에서 4 ° C에서 10 V/cm 젤 전기 이동 법으로 분리 되는 RNA 블루 bromophenol까지 젤 (~ 20 h)의 하단에 도달.
- 자일 렌 cyanol 염료에서 지역 bromophenol 파랑 쪽으로 내려 20 cm 염료 blotting 사용 됩니다 (두 염료 사이의 거리는 25-30 cm 이어야 한다). 젤은 그들 중 하나에 남아 있다 그래야 신중 하 게 두 개의 유리 접시를 구분 합니다. 필터 종이의 얇은 조각 잘라 원하는 더 럽 히 면의 크기 이며 젤 blotting에 사용 될 부분 위에 배치. 필터 종이 적용 되지 않는 젤 부분의 차단 및 삭제. 필터 종이 사용 하 여 유리 접시에서 젤 조각을 조심 스럽게 들어올립니다.
참고: 큰 젤은 매우 깨지기 쉬운 그래서 관심을가지고 취급. - 충전 된 나일론 막 (예: Hybond N + 막) 젤 위에 놓이고 그것은 20 V 전송 버퍼 2 mM EDTA 40mm 트리 아세테이트 (pH 8.1)을 사용 하 여 90 분 electroblotted. 자외선을 사용 하 여 막에
- Crosslink RNA (0.12 J/c m 2).
참고: 막 실내 온도에 저장 될 수 있습니다 및 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
8. 설계 및 검증의 프로브
참고: 설계 및 북부 오 점 프로브의 검증은 신뢰할 수 있는 결과 가져오고 다른 RNA 종족과 원치 않는 간 교 잡 방지 하는 중요 한 주의.
- 사용 조사로 짧은 합성 oligonucleotides. 그것은 관심의 tRNA의 시퀀스의 가장 독특한 부분에 보완-이것은 종종 anticodon 루프 방식에서 프로브 시퀀스 디자인.
참고: 다양 한 유기 체에서 예측된 tRNA 시퀀스 목록에서에서 찾을 수 있습니다 게놈 tRNA 데이터베이스 (GtRNAdb) 21. - 조정 한 예측를 시퀀스의 길이 55-65 ° c.의 온도 용융
- 폭발 (기본적인 현지 줄 맞춤 검색 도구) 선택한 순서 22에 설명 된 대로 선택한 tRNA에는 확인 하는 실험에 사용 하는 세균성 긴장의 게놈 순서에 대 한 시퀀스.
주: 표 1 대장균 K12의 여러 다른 tRNAs에 대 한 제안된 프로브 시퀀스를 나열합니다. 프로브는 특정 관심의 tRNA에 대 한, 두 밴드는 북부 오 점 (충전 및 충전 tRNA)에 표시 하 고 단 하나의 밴드 deacylated 샘플 (충전된 tRNA)와 차선에 표시 됩니다. 두 개 이상의 밴드를 사용할 수 있는지 또는 경우 추가 유효성 검사 프로브 특이성의 토론을 참조 하십시오.
9. 북부 오 점 교 잡
참고: 다음 단계에서 막은 순차적으로 때 교배 프로브 프로브 특정 참조를 포함 하 여 원하는 특정 tRNAs에 무료 tRNA selC.
- 막 교 잡 튜브에 놓고 6 mL 교 잡 솔루션 추가 (0.9 M NaCl, 0.05 M NaH 2 포 4 (pH 7.7), 5 mM EDTA, 0.5% (w/v) SDS, 100 mg/mL의 전단 및 청 어 정자 DNA와 5를 변성 x Denhardt ' s 솔루션 (100 x Denhardt ' s 솔루션 2% 소 혈 청 알 부 민, 2% polyvinylpyrrolidone 40, 및 2% = Ficoll)).
- 미리 1 h 42 ° C. 추가 30 pmol 방사성 올리고 DNA 프로브 5 회전에 대 한 버퍼에 막 교배 '-엔드-32 P (Sambrook 그 외 여러분에 의해 설명 된 대로 준비와 함께 표시 23)
참고: 주의 32 P에서에서 고 에너지 베타 방출 상당한 피부와 눈 복용량 위험을 제시할 수 있습니다. 32 P. 방사성 폐기물을 사용 하 여 폐기 해야 합니다의 적절 한 제도적 안전 프로토콜에 따라 때 적절 한 주의가지고 야 한다. - 42에서 막 하룻밤 회전 프로브를 품 어 ° C. 제거 일회용 10 mL 피 펫을 사용 하 여 프로브.
참고: 냉동 실에 저장 하는 경우 프로브 다시 사용할 수 있습니다. - 교 잡 튜브에 씻어 0.3 M NaCl, 30mm 나트륨 시트르산, 실 온에서 0.1% (w/v) SDS의 50 mL에 곧 막.
참고:이 첫 번째 워시 훨씬 언바운드 프로브를 포함 하 고 높은 방사성으로 처리 되어야 합니다. - 반복 9.4 번 단계 다음 평평한 플라스틱 컨테이너 또는 트레이 뚜껑을 포함 한 막 이동. 세척 솔루션 (0.3 M NaCl, 30mm 나트륨 시트르산, 0.1% (w/v) SDS) 막 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
- 세척 솔루션을 변경 하 고 만족 신호 대 잡음 비 (자주 세척 솔루션의 3-4 변경) 얻은 되었습니다 때까지 세척을 계속. 가 거-뮐러 관을 사용 하 여 막의 빈 영역에서 방사선을 측정 하 여 잡음 신호 비율을 변경 하는 방법을 감지 하 여 프로브는 tRNA를 특히 때 교배는 어디 지역에 그것을 비교.
- 노출, 후 막에서 프로브를 수 있을 것 (중요 한) 막 건조 하지 않습니다 밖으로 스트립 절차 전에 확인 합니다. 막 얇은 비닐 또는 플라스틱을 사용 하 여 단단히 포장 하 고 봉인 테이프 또는 용접으로 밀폐 되도록 포장에 놓습니다. Phosphorimaging 화면에 봉인된 막 장소.
참고: phosphorimaging 화면에 필요한 노출 시간에 따라 결정 됩니다 프로브, 특정 활동 RNA의 양을 조사 for, 그리고 프로브, 그리고 수의 교 잡 효율 크게; 다 몇 일 분. 경험으로,가 거-뮐러 관 막에 방사선의 강도 필요한 노출 시간에 대 한 좋은 표시를 제공 합니다. 신뢰할 수 있는 정량화, 화면 설쳐 하지 것이 중요 하다. - 레이저 스캐너를 사용 하 여 phosphorimaging 화면을 스캔 하 고 파일에 저장 ".gel " 형식.
참고: 높은 신호 대 잡음 비는 신뢰할 수 있는 정량화 필요 합니다. 두 밴드; 초래 한다는 tRNA에 대 한 한 포함 aminoacylated tRNA (느린 마이그레이션)와 1 개의 포함 deacylated tRNA (빠른 마이그레이션). 그림 2를 참조 하십시오.
10. 멤브레인 스트립
참고: 이전 프로브 막 벗 겨 서 먼저 제거 해야 합니다 전에 막 다른 tRNA에 대 한 탐색할 수 있습니다,.
- 열 충분히 스트립 버퍼 (15 m m NaCl, 1.5 m m 나트륨 구 연산 염, 0.1% (w/v) SDS) 커버 하는 막 고 막 위에 부 어. 실 온에서 15 분 동안 품 어.
- 반복 단계 10.1 아무 방사선까지가 거-뮐러 관으로 검출 될 수 있다; 막 다시 교배 섹션 9에 설명 된 단계를 따라 될 수 있습니다.
11. TRNA를 측정 하 고 충전 레벨
- 부하는 영상으로.gel 파일 소프트웨어 (재료의 표 참조). 신호 수 있는 하지도, 그림 3A에서와 같이 같은 방법으로 그것은 레인의 너비의 대부분에 걸쳐 있지만 밴드의 가장자리는 제외 됩니다 샘플 레인의 각에 따라 수직 라인을 그릴.
- 시각화를 클릭 하 여 각 차선에서 계산 " 분석 "-> " 그래프 만들기 ". 그림 3B와 같이 각 차선에서는 충전 및 충전된 tRNA를 나타내는 두 개의 봉우리를 수동으로 정의.
- 클릭 하 여 각 피크에서 카운트를 얻을 " 분석 "-> " 지역 보고서 ", 두 봉우리의 각 영역을 기록.
- 오 점 tRNA selC와 관심의 하나 이상의 tRNA 조사 되었습니다 때 tRNA selC 관심의 tRNA의 수준을 정상화.
- 각 레인에 스파이크 셀에서 발생 하는 tRNA의 비율을 계산 하 고 방정식을 사용 하 여 그 차선에 총 신호에서 뺍니다:
참고: 여기에서, TRNA 샘플 = 원하는 tRNA;에 대 한 조사는 막의 단일 차선에서 얻은 신호 샘플 selC = tRNA selC;에 대 한 조사 같은 막의 동일한 차선에서 얻은 신호 Ref tRNA 원하는 tRNA;에 대 한 조사 같은 막의 스파이크에만 셀 RNA를 포함 하는 차선에서 얻은 신호를 = Ref selC tRNA selC에 대 한 조사 같은 막의 스파이크에만 셀 RNA를 포함 하는 차선에서 얻은 신호를 =. - 정상화, 동일한 차선에서 tRNA selC 신호에 나누어 각 차선에서 교정된 tRNA 값.
참고: 샘플된 셀에서 tRNA selC 신호에 기여는 무시할 수 (참조 하십시오 그림 2 차선 표시 "-selC ").
- 각 레인에 스파이크 셀에서 발생 하는 tRNA의 비율을 계산 하 고 방정식을 사용 하 여 그 차선에 총 신호에서 뺍니다:
- 계산 하는 tRNA의 두 봉우리에서 신호의 합으로 청구 tRNA를 나타내는 피크 신호를 분할 하 여 각 레인에 대 한 레벨을 충전 (충전 + 충전).
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Representative Results
절차를 사용 하 여 풍부 하 고 전과 아미노산 기아 중 레벨 3 tRNAs의 대장균 K-12에 측정 되었다 충전 여기, 설명 합니다.
아르기닌 주별 NF9154 스트레인 (세 레이 그의 아 티 mtl supE44) MOPS 최소한의 매체와 0.4% 글리세롤, 50 µ g/mL 트레오닌, 신, 아르기닌, 37 ° C에서 흔들어에서 5 µ g/mL 히스티딘 보충에 10 세대 이상 성장 했다 160 rpm을. 아르기닌 기아 문화와 신선한 MOPS 매체 아르기닌 하지 않고 위의 물의 resuspension의 여과 의해 도입 되었다. 아르기닌 기아 중 단백질 합성은 강하게 감소 하지만 아르기닌 기존 단백질의 회전율에 의해 발표를 사용 하 여 낮은 수준에서 계속 됩니다. 샘플은 시간에 수확 했다 그림 4에 표시 된 포인트. TRNAselC, overexpressing 셀 스파이크에 MAS1074의 5%에서 볼 수 있듯이 각 샘플에 추가 되었습니다 후 모든 샘플 TCA에 수확 했다, 그림 1. RNA 샘플에서 정화, 전기 이동 법으로 분리 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 막에 얼룩이. 그림 2에서 보듯이 막 tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNAhisR, 및 tRNAselC, 조사 했다. 각 차선에서 방사선 신호는 각 그림 3, 그림 및 교정 섹션 11에 설명 된 대로 정규화 된 4 개의 프로브에 대 한 정량 했다. 결과 그림 4에 표시 됩니다. 그림 4A 모든 테스트 tRNA 종의 수준 아미노산 기아, 최근 보고 된4중 급속 하 게 감소 보여줍니다. 그림 4B 을 예상 대로 수준 작동을 충전 하는 tRNA를 보여줍니다: 아르기닌-수락 tRNA의 청구 일부 상품 빠르게 성장 매체에서 아르기닌의 제거에 따라 다른 tRNAs의 충전 레벨에 따라 약간 증가 하는 반면 기아 tRNAs 축적 그들의 속도 리보솜에서 decharging의 단백질 합성4기판의 부족 때 충전 때문에. 또한 기아 기간으로 충전된 tRNA 분수 감소 tRNA 풀 (그림 4A)에서 나머지 tRNAs의 decharging의 큰 비율에 있는 결과의 대다수의 저하로 인해 약 사전 기아 수준 리보솜입니다. TRNAargVYZQ 의 충전된 분수; 적어도 두 가지 이유로 증가 하는 반면, 1) 엄격한 응답 활성화 의미 mRNA, tRNAarg, 청구 하지 번역에 대 한 제한 요인이 된다 2)arg 는 tRNA의 총 수영장 감소 (그림 4A) 그래서 총 tRNA의 큰 분수 arg 아르기닌의 동일한 작은 금액으로 충전 하실 수 있습니다. 이 실험에서는 tRNA 풍요로 움과 tRNA 충전 레벨의 동시 측정 셀 내부의 단백질 합성에 대 한 조건에 대 한 높은 품질 정보를 제공 하는 방법을 보여 줍니다.
그림 1입니다. 스파이크 셀 샘플의 추가. 이 예제에서는 전과 아미노산 기아 중 대장균 NF915의 단일 문화에서 샘플 시계열에 수확. NF915의 성장 곡선의 회로도, 파란색 점 샘플 수확의 포인트를 나타냅니다 표시 됩니다. y 축의 로그 눈금은. 섹션 3에 설명 된 대로 샘플 실험 문화의 수확. 스파이크-스트레인 MAS1074의 성장 곡선의 회로도 샘플 수확 파란색 점으로 표시 된 지점으로도 표시 됩니다. 그림의 요점은 ( 대장균 이 예제에서 NF915)의 모든 실험 샘플 같은 기준 문화권에서 스파이크 셀의 약 수를 수신 설명 하기. 각 샘플 스파이크 셀의 5% 계산 실험 셀에 추가 된다 세포 배양 (섹션 4 참조)의 세에 따라. 그 후, RNA에서 모든 샘플 정화 및 북부 오 점에 대 한 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 북부 오 점의 형광체 영상 스캔 표시 tRNAs에 대 한 조사. 막 E. 콜라이 긴장 NF915 아르기닌 기아 (분)의 유도 전후 표시 시간 지점에서 수확에서 RNA를 포함 합니다. 또한, 막 스파이크 셀 생략 된 샘플의 2 개의 차선을 포함 (-selC 다와-selC), 및 스파이크에서 RNA를 포함 하는 레인 셀만 (selC). -SelC 다 샘플 포함 화학적 deacylated tRNA. 충전 및 충전 tRNA 종 대표 하는 두 밴드 명확 하 게 구분 됩니다. 참고 차선에서 tRNAselC 에서 무시할 수 신호 없이 스파이크 셀 추가. 같은 막 연속적으로 박탈 되었고 tRNAs는 왼쪽에 표시 된에 대 한 reprobed. 위 오 점에 박스형된 지역 후속 tRNA probings에 대 한 표시 되는 오의 일부를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 북부 오 점의 정량화. tRNA 풍부한 소프트웨어를 사용 하 여 측정 됩니다. (A) A 북부 오 점 그림 2 tRNAargVYZQ에 대 한 조사에서 하나의 레인. 상하 화살표 표시는 aminoacylated tRNA와는 deacylated tRNA, 각각. 차선으로 병렬 실행 빨간 줄 추가 하 고 정량화에 대 한 영역을 정의 하는 데 사용 됩니다. 신호 라인 내에서 두 개의 깨진 레드 (A)에서의 부 량 (B) 수평 축 나타냅니다 (픽셀)에 (a) 라인의 상단에서 거리와 수직 축에서는 신호 강도 (개수)를 그래프로 묘사. 두 개의 포함 된 신호 발생 봉우리는 aminoacylated에서 tRNA는 deacylated tRNA, 각각 있으며 수동으로 정의. 추가 분석을 위해 내보낸 데이터는 두 봉우리의 각 영역에 해당 하는 값입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 대표 결과: tRNA 나타났는데 정량화 한d 아르기닌 기아 중 레벨을 충전 합니다. 그림 2에 표시 된 북부 오 점에 밴드 부 량이 고 TRNAgltTUVW (적색), tRNAargVYZQ (파란색) 및 tRNAhisR (녹색)의 (A) 상대 풍부. 0 분 (샘플 기아 발병 직전 수확)에 레벨 1로 설정 됩니다. (B) (A)에서 동일한 3 개의 tRNAs의 레벨을 충전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 프로브 특이성 | 조사 순서 |
| tRNAargVYZQ | 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC |
| tRNAgluTUVW | 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG |
| tRNAhisR | 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC |
| tRNAleuPQVT | 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC |
| tRNAleuU | 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG |
| tRNAleuW | 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC |
| tRNAleuX | 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA |
| tRNAleuZ | 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT |
| tRNAlysQTVWYZ | 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC |
| tRNAthrV | 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA |
| tRNAtyrTV | 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA |
| tRNAselC | 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC |
표 1입니다. 선택한 tRNAs 대장균 K-12. 에 대 한 제안된 프로브 시퀀스의 테이블
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Discussion
이 프로토콜 특정 대장균 의 충전 레벨을 동시에 측정 하는 방법에 설명 합니다 tRNAs 다른 샘플에 tRNAs의 상대적 수준을 비교 하 고. 1) 2)는 다른 샘플에서 상대 tRNA 수준을 안정적으로 비교 될 수 있다, 같은 방식으로 tRNA 수량을 정상화 하 고 3) sp 셀룰러 tRNA 충전 레벨 유지 되는 방식으로 샘플을 처리 하는 프로토콜의 중요 한 포인트는 관심의 tRNAs에 대 한 선택 된 프로브 ecificity. 이러한 포인트는 아래 별도로 해결 됩니다.
tRNA 정화
tRNAs는 그들의 휴대 전화 충전 레벨을 유지 하기 위해 최적화 된 부드러운 방식으로 대장균 에서 정화. 그것은 우리의 경험이이 프로토콜 주로 150 보다 짧은 RNAs를 추출 하는 nt, 따라서 tRNA 구성 순화 된 RNA의 큰 분수. 이러한 이유로, 그것은 대장균에서 총 RNA 정화이 프로토콜을 사용 하 여 권장 하지 않습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 탐지 및 어떤 추가 적응 없이 작은 RNA (요 스르나.) 같은 다른 RNAs의 정량화에 적합 해야 합니다. 짧은 RNA 시퀀스에 대 한 풍요롭게 하는 RNA 추출 프로토콜 때문에 그것은 또한 찾아야한다 사용을 조사 요 스르나. 낮은 표현 하는 경우에.
스파이크에 셀에 의해 정규화
그것은 RNA 샘플 샘플 변화를 해결 하기 위해서는 모든 샘플에서 세포 당 동일한 평균 수에 존재 하는 대 본의 수준에 tRNA 수준을 정상화 하는 데 필요한 다른 샘플에서는 tRNA의 레벨을 비교 하 복구 및 젤 로드 합니다. 이 목적을 위해 우리는 RNA 정화 전에 드문 tRNAselC overexpress 참조 셀의 5%와 샘플 스파이크. 스파이크에 방법이 바람직합니다 참조로 생 RNA를 사용 하 여 조건 어디 아무 생 RNAs 동일한 세포 농도에 확실 하 게 알려져 있습니다에 걸쳐 tRNA 레벨의 비교를 허용 하기 때문에. 스파이크도 대장균 세포를 사용 하 여 단점은 그 5% 있다 여분의 대장균 RNA 모든 실험 샘플에 추가 됩니다 그것은 관심의 RNA의 신호에 기여. 이 바이어스만 스파이크에 셀 모든 북부 오 점를 포함 하 고 단계 11.4.1에에서 설명 된 대로 RNA 값을 수정 하는 샘플을 포함 하 여 여 차지입니다. SelC 야생 타입 셀에서은 tRNA의 식은 그것이 다른 tRNAs ( 그림 2참조)에 비해 낮은 정량화에 상당한 차이 확인 하지 않습니다 하 고 따라서 무시 될 수 있습니다. 그러나, 어디 selC 높은 사본 플라스 미드에는 T7 발기인에 의해 표현 된다, 참조 스트레인 MAS1074, 우리 추정 적어도 빌드하기 더 tRNAselC 1mm IPTG의 생산은 wildtype e.에 의해 생산 보다 대장균 K-12 어떤 조건 하에서. MAS1074 전체 IPTG 유도의 2 세대 이후 성장 중단. 그 시점에서, tRNAselC 의 유도 문화-문화 차이 작은, 그리고 스파이크 셀 단일 실험에 대 한 모든 aliquots로이 프로토콜에 대 한 관심사 아닙니다 MAS1074의 동일한 유도 문화에서 가져옵니다. MAS1074 하는 대신, 그 RNA의 교 잡 프로브 cross-react 하지 것 이다 유기 체에서 세포 스파이크 셀으로 사용할 수 있습니다. Sulfolobus solfataricus 셀 성공적으로 대장균 tRNA4실험으로 스파이크에 사용 되었습니다. 그러나, 대장균 스파이크 셀 높습니다 실험 세포의 세포 세포의 용 해의 정도 보다 정확 하 게 반영 여부 S. solfataricus 로 동일한 효율성으로 lyses 불확실은 대장균. 또한, 성장 하는 S. solfataricus ~ 16 h의 세대 시간 85 ° C에서 그들이 성장 더 지루한입니다.
선택한 tRNAs의 특이성을 보장
TRNA를 성공적으로 되었습니다 aminoacylated와 deacylated 정화 두 밴드 북부 막에 감지 한다. 두 밴드 사이의 거리 조사, 특정 tRNA에 따라 다를 것 이며 크기, 극 지 속성 및 특정 아미노산 특정 tRNA5 바인딩할 때 발생 하는 구조에 있는 다름의 결합 된 결과 . 예를 들어는 aminoacylated에서 deacylated 사이의 거리 tRNA 큽니다 tRNAargVYZQ 에 대 한 보다 tRNAgltTUVW, 그림 2에서 볼 수 있듯이. 여기 RNA를 분리 하는 데 사용 하는 젤의 큰 크기 때문에 해상도 높은 만큼 서로 다른 tRNAs 길이, 순서에 그들의 차이 대부분을 구별 하는 것 뿐만 아니라 충전에서 충전된 tRNA를 구별 하 구성, 고 수정 패턴입니다. 심지어 isoaccepting tRNAs tRNAs2수락 하는 신에 대 한 같이 구분할 수 있습니다. 그러나, 참고는이 연구에서 불가능 했다 순서에 차이 tRNAleuT에서 tRNAleuPQV 를 구별 하는 것만 한 G T 대체를 이다.
두 개 이상의 밴드 북부 막에 나타나는 경우 다른 RNAs 가진 조사 cross-reaction의 결과 수 있습니다. 온도 증가 시켜 세척 단계 (단계 9.5)의 엄중을 증가 일반적으로 이것을 해결할 수 있다. 55 ° C에서 30 분을 세척 하는 것은 일반적으로 충분 합니다. 워시 엄중을 증가 간 교 잡 제거 하지 않습니다, 경우 솔루션은 tRNA 시퀀스의 다른 (수시로 부분적으로 겹치는) 부분을 보완 하는 새로운 프로브 디자인 될 수 있습니다. 추가 밴드 막의 부족 한 스트립 결과로 이전 조사에서 수행 될 수 있습니다. 이 방지 하려면 다시 검색 하기 전에 막 노출 스트립 컨트롤 할. 밴드 제어 스캔에 표시 하는 경우는 막 추가 제거 할 수 있습니다. 일반적으로 다시 조사를 막 8-10 배 이상 가능 하지만 여러 프로브 후 완전히 제거 하기 어려운 될 수 있습니다. 이 경우 막 32P 부패 한다 빨리로 다시 검색 하기 전에 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
프로브 특이성의 더 확인 한 북부를 수행 하 여 얻을 수 있습니다 오 셀 조건 집합에서 수확 어디 관심의 사본을 예측 가능한 방식으로 영향을 받을 것으로 예상 된다. 예를 들어 유도할 수 있는 식 플라스 미드, 또는 동족 아미노산에 대 한 아미노산 기아에서 tRNA의 한다 결과 향상 된 상대 식 수준 또는 더 낮은 충전 수준에 각각, 관심의 tRNA의.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 우수한 기술 지원 마리 트 Warrer를 감사합니다. 이 작품은 독립적인 연구에 대 한 덴마크 위원회에 의해 지원 되었다 | 자연 과학 [1323-00343B] 고 덴마크 연구 재단 [DNRF120].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
| Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
| Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
| Phenol | Merck | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| Glucose | |||
| Sodium Acetate | |||
| EDTA | |||
| Ethanol | |||
| Tris | |||
| Hydrochloric acid | |||
| Sodium Chloride | |||
| NaH2PO4 | |||
| Sodium Citrate | |||
| SDS | |||
| Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 γATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
| Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| Spectrophotometer | |||
| Hydridization oven | |||
| Geiger-Müller tube | |||
| Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
| Hybridization tube | |||
| Culture Flasks | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 20 ml centrifuge tubes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageQuant | GE Healthcare | ||
| Excel | Microsoft |
References
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