Summary
Här presenterar vi en metod för att direkt mäta överföring RNA laddning nivåer från renat Escherichia coli RNA samt ett sätt att jämföra relativ nivåer av överföring RNA, eller några andra korta RNA, över olika prover baserat på tillägg av spike-i celler som uttrycker en referens-gen.
Abstract
Överföring RNA (tRNA) är en viktig del av den translationella maskinen i någon organism. tRNAs binda och överföra aminosyror till översätta Ribosomen. De relativa nivåerna av olika tRNAs, och förhållandet mellan aminoacylated tRNA till totala tRNA, känd som den laddning nivån, är viktiga faktorer vid fastställandet av den noggrannhet och hastighet av översättning. Överflöd och laddning nivåer av tRNAsna är därför viktiga variabler att mäta när man studerar proteinsyntesen, till exempel under olika stress förhållanden. Här, beskriver vi en metod för skörd tRNA och direkt mäta både relativ överflödet och den absoluta laddning nivån av specifika tRNA arter i Escherichia coli. TRNAen skördas på ett sådant sätt att den labila bond mellan tRNAen och dess aminosyra bevaras. RNA utsätts sedan för gelelektrofores och Northern blotting, vilket resulterar i separation av de laddade och oladdade tRNAsna. Nivåerna av specifika tRNAs i olika prover kan jämföras på grund av tillägg av spike celler för normalisering. Innan RNA rening, vi lägger till 5% av E. coli -celler som överproducera de sällsynta tRNA-selC till varje prov. Beloppet av tRNA arter av intresse i ett prov är sedan normaliserat till mängden tRNAselC i samma prov. Tillägg av spike celler innan RNA rening har fördelen över tillägg av renat spike-i RNAs som det också står för eventuella skillnader i cell lysis effektivitet mellan prover.
Introduction
I följande presenterar vi en metod för att kvantifiera specifika tRNAs och mäta deras laddning nivåer av Northern blotting. Metoden bygger på en teknik som utvecklades av Varshney o.a. 1. genom skörd celler i triklorättiksyra (TCA) och hålla proverna vid 0 ° C under hela RNA rening, ester bindningen mellan tRNAen och aminosyran är bevarade2,3,4. Aminoacylated tRNAs kan skiljas från sina nonacylated motsvarigheter gelelektrofores och Northern blotting, tack till en minskad rörlighet i aminoacylated tRNA i gelen, orsakade av kovalent bundna aminosyra5. Dessutom presenterar vi ett protokoll för att normalisera tRNA kvantiteter genom tillsats av spike-celler överuttryck används sällan tRNAselC 4.
tRNAsna är några av de vanligast förekommande molekylerna i cellen bakteriell och en absolut nödvändig del av översättning maskiner. tRNAs binda aminosyror och överföra dem till att översätta ribosomerna. Bindningen av aminosyror till tRNAs (aminoacylation eller laddning) underlättas av aminoacyl tRNA synthetases. Det relativa överflödet av olika laddade tRNAsna är viktiga för att garantera trohet i proteinsyntesen, eftersom underrepresentation av besläktat laddad tRNA för en given budbärar-RNA (mRNA) codon ökar sannolikheten för att en nära-besläktat tRNA kommer felaktigt leverera sin aminosyra till den växande polypeptidkedja på Ribosomen6. Vikten av laddad tRNA återspeglas i den omfattande Svaren av E. coli cellen till en allvarlig nedgång i laddning nivåer av en tRNA; den stränga svaren. Under den stränga Svaren syntes av tRNAs, ribosomalt RNA och de flesta mRNA sänks till förmån för transkription av specifika mRNA associerade med aminosyran biosyntes och stress överlevnad och tillväxttakten i cellerna sänks dramatiskt7 . Senaste arbete av oss och andra har dessutom visat att E. coli aktivt försämras majoriteten av dess tRNA svar betonar att begränsar översättning4,8, vilket tyder på att justering av tRNA nivåerna kan vara viktigt för att klara sådana påfrestningar. Pålitliga mätningar av tRNA sammansättning och laddning nivåer kommer således vara ett viktigt verktyg för att fullt förstå bakteriell stressreaktioner.
E. coli används ofta uttrycka rekombinant protein och på grund av skillnader i kodon användning mellan arter, suboptimal uttryck är ett problem som ofta inför9. Detta kan kringgås genom uttryck för ytterligare tRNAs behövs för att översätta de rekombinanta mRNA-10. Mätningar av tRNA laddning nivåer i sådana stammar kunde vägleda felsökning insatser och bidrar till att optimera proteinuttryck.
Denna metod möjliggör också upptäckt av ”mischarging”; en tRNA molekyl aminoacylated med en icke-besläktat aminosyra. Aminoacylation av olika aminosyror kan orsaka en tRNA att migrera med lite olika hastigheter genom polyakrylamidgeler1,11. I vissa fall kan metoden också användas för att skilja olika modifiering mönster på annars identiska tRNAs3.
En annan etablerad biokemiska proceduren för utredningen av tRNA laddning nivåer är natriumperjodat oxidation. Metoden bygger på iakttagelsen att aminoacylated tRNA är skyddad från natriumperjodat oxidation och oladdade tRNA är inte. Efter natriumperjodat oxidation behandling laddning av tRNAen används för att uppskatta laddning nivåerna av den skördade RNA. Laddning av flera tRNAs har dock visat sig påverkas av behandling vilket ger vissa felaktigheter12. Metoden presenteras här åtgärder laddning direkt från renat RNA, alltså exklusive eventuella fördomar från kemiska eller enzymatiska reaktioner. En begränsning med denna metod är att endast en tRNA arter upptäcks i taget, så även om den samma Northern blot kan strippad och reprobed för flera tRNAs, det är tidskrävande och ganska arbetsamt att samla in uppgifter om många tRNAs.
Ett tillförlitligt sätt i normalisera prover till varandra är vital i studier där målet är att jämföra de relativa nivåerna av en molekyl mellan olika prover. Här presenterar vi en normalisering förfarande för RNA där en liten delmängd av E. coli celler överuttryck av den sällsynta tRNAselC läggs som ett spike till alla experimentella proverna före RNA rening. Denna metod är användbar inte bara vid prövningen tRNAs men för relativ kvantifiering av någon art av RNA när den experimentella setup är sådan att ingen endogena RNA kan vara betrodd att vara närvarande vid samma cellulära koncentrationen i alla prover. Till exempel används nivån på en ”städning” RNA-liknande ribosomalt RNA ofta som en endogen referens att jämföra de relativa mängder en annan RNA mellan olika prover13. Men detta är till liten nytta om den cellulära koncentrationen av referens RNA varierar mellan prover, som kan vara fallet för ribosomalt RNA om provtagning sker under en stress svar15,16,17 eller under trätt i stationär fas17. Tillsats av spike celler till experimentella proverna före RNA rening ger ett fast och korrekt sätt att normalisering oberoende av inställningen för provtagning. Ett annat sätt att standardisering är tillägget av en eller flera spike-i RNAs till experimentella proverna efter RNA rening. Denna metod tar dock inte hänsyn till eventuella skillnader i RNA återhämtning mellan prover.
Med E. coli -celler som overexpress hänvisningen RNA som spike-i celler (se figur 1) i ett experiment på E. coli har den nackdelen att det resulterar i tillägg av en liten mängd av exogena E. coli totalt RNA till den prover. Vi korrigera för detta tillägg genom att analysera ett prov som innehåller endast spike celler parallellt med experimentella proverna (se nordligt blot i figur 2, lane märkt ”selC”). Det protokoll som presenteras är utvecklad för E. coli k-12 men sannolikt är tillämpliga för de flesta bakteriearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av bakteriekulturer.
- Växa alla kulturer i Erlenmeyer-kolvar med en kultur/kolv volymförhållandet av högst 1/6. I en typisk experimentella setup, växa kulturerna på 37,0 ° C och skaka på 160 rpm i morpholinepropanesulfonic syra (moppar) minimal medium 18 kompletteras med den föredragna kolkälla, till exempel 0,2% glukos, minst 10 på varandra följande generationer innan RNA skörd.
- Dagen innan RNA skörd, späd en urvuxen kultur av önskad stammen i moppar minimalmedium på ett sådant sätt att det kommer att nå den önskade OD 436 vid önskad tid följande dag. Beräkna volymen av urvuxna kultur att använda för inympning genom formeln:
Obs: här, OD nya betecknar den önskade OD 436 efter inkubation, V ny betecknar volymen av de utspädda kulturen, OD gamla betecknar den OD 436 av urvuxna kultur utspädd från, G betecknar antalet generationer kulturen kommer att växa, från den tid av utspädning (t 1) att det behövs dagen efter (t 2) och kan beräknas som: tidsskillnad (i minuter) mellan t 1 och t 2 dividerat med tid (i minuter). För att säkerställa steady state tillväxt vid tidpunkten för provtagning, G bör ≥ 10; V gamla betecknar volym ut odlade kulturen som ska överföras till färska medium. Denna ekvation är en approximation som inte tar hänsyn till varje lag fas. ett fenomen som ofta observeras efter spädning av en ut odlade kultur i färska media.- Tillväxt villkorar varierar beroende på syftet med försöket, men om du vill begränsa cell till cell variation i tRNA nivåer och att öka reproducerbarheten av resultaten, (rekommenderas) växa kulturerna till steady-state före provtagningen 19.
2. Beredning av spike celler
Obs: E. coli stam MAS1074, som uttrycker den selC-gen som kodar tRNA selC under kontroll av en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- inducerbara arrangören används som spike-i stammen.
- Dilute en urvuxen kultur av MAS1074 till en OD 436 0,05 i moppar minimalmedium kompletteras med 100 µg/mL ampicillin och 0,2% glukos. Växer kulturen vid 37 ° C skakar på 160 rpm.
Obs: Se diskussion för användning av en alternativ referensstam. - På OD 436 ~ 0,1, lägga till IPTG till en slutlig koncentration på 1 mM att inducera uttrycket av tRNA selC. Växa kulturen till OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h tillväxt) och flytta kultur kolven till ett isbad. Hålla den spike-i cellkulturen på is tills alla prover för RNA rening har skördats.
3. Skörden av experimentprover.
- Pre varmt (37 ° C) en maximerad 100 mL Erlenmeyerkolv (eller liknande) som innehåller 4 mL 10% (w/v) triklorättiksyra (TCA) för varje prov genom att placera den i uppvärmda vattenbad.
Obs: försiktighet, TCA sönderdelas vid uppvärmning, producerar giftiga och frätande ångor inklusive väteklorid och kloroform. Lösningen i vatten är en stark syra; Det reagerar häftigt med baser och är korrosivt för många metaller. Ordentlig försiktighet bör tas när du använder denna vätska. - Omedelbart före cellen skörd, mät och anteckna den OD 436 kultur.
- För att skörda cellerna, överföra 4 mL kultur till en redan uppvärmd kolv som innehåller TCA.
- Blanda provet genom omskakning kolven för hand för 5 s. blandning med TCA omedelbart inaktiverar alla enzymatiska aktiviteter och därmed bevarar laddning nivåerna av tRNAsna.
Obs: Om flera prover samlas in, hålla skördade prover i TCA på is tills alla prover samlats.
4. Tillägg av spike celler
Obs: beredning av spike celler beskrivs i steg 2.
- När alla prover för RNA förberedelse har samlats in, lägga till 5% spike celler (baserat på OD) till varje prov.
Obs: Volymen av spike-i cellkultur behövs beräknas genom formeln:
där V spike betecknar volymen av spike-i cellkultur behövs, V exp betecknar volymen av skördade experimentella cellkultur (utan TCA), OD exp betecknar den OD 436 i experimentell cellkulturen vid tidpunkten för skörden till TCA. OD spike betecknar den OD 436 av spike-i cellkulturen. Om flera prover skördas vid olika ODs, volymen av spike-celler lagt till justeras enligt formeln ovan för varje prov. - Att kvantifiera spike-i cellerna bidrag till RNA arter av intresse, förbereda ett prov som endast innehåller spike celler genom att blanda 4 mL spike celler med 4 mL TCA. Förbereda RNA från detta prov på samma sätt som för de andra proverna.
- Alternativt ta en annan kolv som innehåller endast experimentella provet, utan spike-celler, och inkludera det för att kvantifiera bidrag av experimentella provet tRNAen selC nivåer; de endogena nivåerna av tRNA selC i E. coli k-12 är negligibly låga.
5. Beredning av RNA
Obs: det RNA förberedelse-protokollet som beskrivs här är i huvudsak som beskrivs av Varshney o.a. 1. För att undvika deacylation av de aminoacylated tRNAsna under rening är det viktigt att hålla proverna vid surt pH och vid 0 ° C i hela loppet av rening. Använda ren sterilt rör/kolvar för att hålla prover och lösningar, och förbereda alla lösningar med ultrarent (18,2 MΩ·cm resistivitet) vatten.
- Häll 8 mL av varje prov i en is-kylda centrifugrör. Centrifugera prover för 10 min vid 9500 x g vid 4 ° C. helt ta bort supernatanten och återsuspendera i 0,3 mL kall 0,3 M natriumacetat, pH 4,5 och 10 mM EDTA.
- Överför varje prov till ett kallt 1,5 mL mikrocentrifug rör och tillsätt 0,3 mL fenol jämviktas med samma bufferten.
Obs: försiktighet, phenol producerar giftiga ångor och är starkt frätande på huden. - Vortex varje prov 10 x 15 s med minst 1 min mellan varje vortex. Mellan vortexa hålla proverna vid 0 ° C. Använd de ofta pauserna för att proverna ligga kallt.
- Centrifug prover för 15 min vid 20 000 x g vid 4 ° C. överföring av vatten fas (övre) till nya 1,5 mL mikrocentrifug rör. Lägga till 0,3 mL kall fenol och vortex 4 x 15 s som tidigare.
- Centrifugera i 10 min vid 20 000 x g vid 4 ° C. överföring vattenfasen till ny, kall 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 2,5 gånger volymen av 96-procentig etanol (~ 750 µL). Fällningen RNA av ruvning rören för 1 h vid-20 ° C eller över natten vid -80 ° C.
- Centrifug prover för 30 min vid 20 000 x g vid 4 ° C. avlägsna supernatanten och tillsätt försiktigt 1 mL kall 70% etanol utan att störa pelleten RNA. Vänd försiktigt en gång för att tvätta insidan av rören med etanol.
Obs: Pelleten kan vara svårt att se på detta steg. - Centrifugera i 10 min vid 20 000 x g vid 4 ° C. helt avlägsna supernatanten och lufttorka pelleten tills ingen etanol finns kvar. Återsuspendera pelleten av kraftigt vortexa i 20 µL kallt 10 mM natrium acetat pH 4,5 och 1 mM EDTA.
Obs: Torka inte alltför pelleten som det blir svårt att resuspendera. - Alternativt bedöma koncentrationen av RNA genom att mäta absorbansen vid 260 nm.
- Alternativt bedöma kvaliteten på renat RNA av agaros gelelektrofores 20.
- Store prover vid -80 ° C.
Obs: Protokollet kan pausas här.
Obs: för att skilja bandet av aminoacylated tRNA från dess deacylated motsvarighet på nordligt blot, ett kemiskt deacylated alikvotens bereds genom alkalisk behandling. För de flesta ändamål, är det tillräckligt att deacylate ett enda prov för varje nordliga plumpen.
- Tina RNA prov på is. Överför en 4 µL alikvot av RNA provet till en ny tub. Lägg till 46 µL Tris-HCl pH 9,0. Inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
- Lägg till 15 µL 0,3 M natriumacetat vid pH 4,5 och därefter tillsätt 125 µL av 96% etanol. Fällningen RNA vid-20 ° C under 1 h.
- Centrifugera under 30 minuter vid 20 000 x g vid 4 ° C. helt avlägsna supernatanten och återsuspendera i 4 µL kallt 10 mM natrium acetat pH 4,5 och 1 mM EDTA.
Obs: Protokollet kan pausas här, om provet förvaras vid -80 ° C.
7. Gel-elektrofores och Northern blotting
- Mix 4 µL prov (obehandlat eller kemiskt deacylated) med 6 µL lastning buffert (0,1 M natriumacetat (pH 5.0), 8 M urea, 0,05% bromophenol blå och 0,05% xylen cyanol).
Obs: Kom ihåg att inkludera provet som innehåller endast spike-i celler, de kemiskt deacylated prov (och provet utan spike celler, om man var beredd). - Ladda proverna på en 0,4 mm tjocka 6,5% polyakrylamidgel (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) som innehåller 8 M urea i 0,1 M natrium acetatbuffert (pH 5.0). Använda 60 cm lång geler för ordentlig separation av tRNA arter.
- Separat RNA genom elektrofores på 10 V/cm gel vid 4 ° C, tills bromofenolblått når botten av gelen (~ 20 h).
- Området från xylen cyanol färgämnet och 20 cm ned mot den bromophenol blå färgämnet används för blotting (avståndet mellan de två färgämnena bör vara 25-30 cm). Försiktigt separera de två glasskivor, så att gelen förblir på en av dem. En tunn bit filtrerpapper skärs till storleken på önskat blotting område och placeras ovanpå delen av gelen som kommer att användas för blotting. De delar av gelen som inte omfattas av filterpapper är avskuren och kasseras. använda pappersfiltret till lyft försiktigt gel bit från glasskivan.
Obs: Den stora gel är mycket ömtålig så hantera med försiktighet. - Ett positivt laddade nylon membran (t.ex. Hybond N + membran) placeras ovanpå gelen och det är electroblotted på 20 V för 90 min med 40 mM Tris-acetat (pH 8,1), 2 mM EDTA som överföring buffert.
- Crosslink RNA till membranet med UV-ljus (0,12 J/cm 2).
Obs: Membranet kan nu lagras i rumstemperatur och protokollet kan pausas här.
8. Konstruktion och verifiering av sonder
Obs: noggrann design och verifiering av nordliga plumpen sonder är avgörande för att få tillförlitliga resultat och undvika oönskade cross-hybridisering med andra RNA arter.
- Använd korta syntetiska oligonukleotider som sonder. Utforma sonden sekvensen på ett sätt att det är ett komplement till den mest unika delen av sekvensen av tRNAen sevärdheter - detta är ofta anticodon slingan.
Obs: En lista över förväntade tRNA sekvenser från olika organismer kan hittas i den genomiska tRNAen databas (GtRNAdb) 21. - Justera längden på sekvensen att erhålla en förutspådd smälttemperaturen 55-65 ° C.
- BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) valt sekvens mot genomsekvens av den bakteriestam som används i experimentet, kontrollera att sekvensen är unika för den valda tRNAen, som beskrivs i 22.
Obs: Tabell 1 visar föreslagna sonden sekvenser för flera olika tRNAs av E. coli K12. Om sonden är specifika för tRNAen sevärdheter, bara två band är synliga på den nordliga plumpen (laddad och oladdade tRNA) och bara ett band syns i körfält med deacylated provet (oladdade tRNA). Om mer än två band är närvarande eller om ytterligare validering av sonden specificitet önskas, se diskussion.
9. Hybridisering av nordliga plumpen
Obs: I följande steg, membranet är sekventiellt hybridiseras med sonder komplement till de önskade specifika tRNAs, inklusive en sond specifik för referens tRNA selC.
- Placera membranet i en hybridisering tube och tillsätt 6 mL hybridisering lösning (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, 0,5% (w/v) SDS, 100 mg/mL av klippt och denatureras sill spermier DNA och 5 x Denhardt ' s lösning (100 x Denhardt ' s lösning = 2% bovint serumalbumin, 2% polyvinylpyrrolidon 40 och 2% Ficoll)).
- Pre hybridisera membranet i bufferten för 1 h roterande på 42 ° C. lägga 30 pmol radioaktiva oligo-DNA probe 5 ' - end - märkt med 32 P (beredd enligt beskrivningen av Sambrook et al. 23)
Obs: varning, high-energy beta utsläppen från 32 P kan presentera en betydande hud och fara för ögon-dos. Ordentlig försiktighet bör tas när använder 32 s. radioaktivt avfall ska kasseras enligt de lämpliga institutionella säkerhet protokoll. - Inkubera sonden med den membran övernattning roterande vid 42 ° C. ta bort sonden med disponibla 10 mL pipett.
Obs: Om lagras i en frys sonden kan återanvändas. - i hybridisering röret, tvätta membranet strax i 50 mL 0,3 M NaCl, 30 mM natriumcitrat, 0,1% (w/v) SDS rumstemperatur.
Obs: Denna första wash innehåller mycket obundna sonden och måste hanteras som högradioaktivt. - Upprepa steg 9,4 en gång, sedan flytta membranet till en platt plastflaska eller fack inklusive lock. Täcka membranet med tvättlösningen (0.3 M NaCl, 30 mM natriumcitrat, 0,1% (w/v) SDS) och inkubera det i 30 min i rumstemperatur.
- Ändra tvättlösningen och fortsätta att tvätta tills en tillfredsställande signal-brusförhållandet har erhållits (ofta 3-4 ändringar av tvättlösningen). Använder en Geiger-Müller rör upptäcker hur buller till signal baserat ändras genom att mäta strålningen från ett tomt område av membranet och jämföra det med området där sonden har hybridiseras specifikt för tRNA.
- För att kunna tömma sonden från membranet efter exponering, säkerställa att (viktigt) membranet inte torkar ut innan strippning förfarandet. Placera membranet i en tunn plastpåse eller wrap det ordentligt med plast wrap och försegla det vara lufttät av band eller svetsning. Placera den förseglade membranen på en phosphorimaging skärm.
Obs: Krävs exponeringstid på skärmen phosphorimaging bestäms av den specifika aktiviteten av sonden, mängden RNA probed for och hybridisering effektiviteten av sonden och kan variera mycket; från några minuter till flera dagar. Med erfarenhet ger intensiteten av den strålning som upptäckts på membranet med Geiger-Müller röret en bra indikation på krävs exponeringstiden. För tillförlitlig kvantifiering, är det viktigt att skärmen inte är överexponerad. - Skanna phosphorimaging skärmen med hjälp av laserskanner och spara filen i " .gel " format.
Obs: En högt signal-brusförhållandet är nödvändigt för tillförlitlig kvantifiering. Sondera för en tRNA ska resultera i två band; en innehållande aminoacylated tRNA (långsammare migration) och en innehållande deacylated tRNA (snabbare migrering). Se figur 2.
10. Strippar membranet
Obs: innan membranet kan vara probed för en annan tRNA, tidigare sonden först måste avlägsnas genom strippning membranet.
- Värme nog stripp buffert (15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitrat, 0,1% (w/v) SDS) att täcka membranet och häll det över membranet. Inkubera det i 15 min i rumstemperatur.
- Upprepa steg 10.1 tills ingen strålning kan upptäckas med en Geiger-Müller rör; membranet nu kan åter hybridiserade följa stegen som beskrivs i avsnitt 9.
11. Kvantifiera tRNA och laddning nivåer
- Ladda .gel filen till bildtagning programvara (se Tabell för material). Rita en lodrät linje längs varje av köer som prov på ett sådant sätt att det spänner över de flesta av bredden av lane men utesluter kanterna på banden där signalen kan vara ojämn, som visas i figur 3A.
- Visualisera räknar från varje bana genom att klicka på " analys "-> " skapa graf ". Manuellt definiera de två topparna som representerar den laddad och den oladdade tRNAen från varje lane, som visas i figur 3B.
- Få räknas från varje topp genom att klicka på " analys "-> " område rapport ", och registrera området under var och en av de två topparna.
- När blot har varit probed för tRNA selC och minst en tRNA sevärdheter, normalisera nivåerna av tRNAen av intresse för tRNA selC.
- Beräkna andelen tRNA med ursprung från spike-i cellerna i varje körfält och subtrahera från totala signalen i det körfält som med hjälp av ekvation:
Obs: här, Prova tRNA = den signal som erhålls från en enda lane av ett membran som trotsat för den önska tRNAen; Prov selC = den signal som erhålls från samma körfält av samma membran probed för tRNA selC; Ref tRNA = den signal som erhålls från körfältet som innehåller endast spike-i cell RNA av samma membran probed för den önska tRNAen; Ref selC = den signal som erhålls från körfältet som innehåller endast spike-i cell RNA av samma membran probed för tRNA selC. - Att normalisera, dividera det korrigerade tRNA-värdet från varje lane med tRNA selC signalen från samma körfält.
Obs: Bidrag till tRNA selC signalen från samplade cellerna är försumbar (se figur 2, lane märkt "-selC ").
- Beräkna andelen tRNA med ursprung från spike-i cellerna i varje körfält och subtrahera från totala signalen i det körfält som med hjälp av ekvation:
- Beräkna den tRNAen laddning nivå för varje bana genom att dela upp signalen för toppen som motsvarar laddad tRNA med summan av signalen från båda toppar (laddade + oladdade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av proceduren som beskrivs här, överflödet och laddning nivåer av tre tRNAs mättes i E. coli k-12 före och under aminosyra svält.
Det arginin auxotroph stam NF9154 (thr leu hans argH thi mtl supE44) var odlas för minst tio generationer i moppar minimalmedium kompletteras med 0,4% glycerol, 50 µg/mL treonin, leucin, arginin och 5 µg/mL histidin vid 37 ° C skakar på 160 rpm. Arginin svält infördes genom filtrering av den kultur och resuspension i färska moppar medium som ovan men utan arginin. Under arginin svält, proteinsyntes förminskas starkt, men fortsätter på en låg nivå med arginin släpptes av omsättningen för befintliga proteiner. Prover har skördats på gång punkter som anges i figur 4. Efter alla prover skördades i TCA, 5% av MAS1074 spike-i cellerna överuttryck tRNAselC, lades till varje prov som illustreras i figur 1. RNA var renats från proverna, avgränsade med elektrofores och utplånas på ett membran som beskrivs i protokollet. Membranet var utforskad för tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNAhisRoch tRNAselC, som kan ses i figur 2. Strålning signalen från varje lane kvantifierades för var och en av de fyra sonderna som illustreras i figur 3, och korrigerade och normaliserade som beskrivs i avsnitt 11. Resultaten presenteras i figur 4. Figur 4A visar att nivåerna av alla testade tRNA arter snabbt minskar under aminosyra svält, som nyligen rapporterade4. Figur 4B visar att den tRNAen laddning nivåer fungerar som förväntat: laddade fraktionen av den arginin-acceptera tRNAen tappar snabbt efter borttagning av arginin från odlingsmedium, medan laddning nivåerna av de andra tRNAsna ökar något vid svält eftersom debiteras tRNAs ackumuleras när deras klassar av decharging på ribosomerna minskar på grund av substrat för proteinsyntes4. Vidare in i svält perioden minskar den laddad tRNA-fraktionen till cirka pre svält nivåer på grund av nedbrytning av majoriteten av tRNA poolen (figur 4A), vilket resulterar i en högre frekvens av decharging av de återstående tRNAsna på ribosomerna. Däremot ökar den laddade fraktionen av tRNAargVYZQ av minst två skäl. (1) aktivering av stränga svar innebär att mRNA, inte debiteras tRNAarg, blir den begränsande faktorn för översättning och 2) totala poolen av tRNAarg är minskar (figur 4A) så en större andel av den totala tRNAenarg kan laddas med samma små belopp av arginin. Detta experiment visar hur samtidiga mätningar av tRNA överflöd och tRNA laddning nivåer ger högkvalitativ information om villkoren för proteinsyntesen inuti cellen.
Figur 1. Tillägg av spike celler att prover. I det här exemplet skördas prover från en enda kultur av E. coli NF915 i en tidsserie före och under aminosyra svält. En schematisk bild av tillväxtkurvan av NF915 visas, där de blå Prickarna visar pekar av provet skörd. Y är logaritmisk skala. Prover av den experimentella samarbetsrelation skördas som beskrivs i avsnitt 3. En schematisk bild av tillväxtkurvan spike-i stam MAS1074 visas också, med peka av provet skörd anges som en blå prick. Poängen med figuren är att illustrera att alla experimentella prover (av E. coli NF915 i det här exemplet) får en alikvot av spike celler från samma referens kultur. Till varje prov, 5% med spike celler läggs till de experimentella celler, beräknas utifrån OD av cellkulturer (se avsnitt 4). Därefter RNA renas från alla prover och används för Northern blotting. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fosfor imager genomsökning av en nordliga plumpen probed för de angivna tRNAsna. Membranet innehåller RNA från E. coli stam NF915 skördas vid angivna tidpunkter före och efter induktion av arginin svält (minuter). Membranet innehåller dessutom två körfält av prover där spike celler har utelämnats (-selC DA och -selC), och ett körfält som innehåller RNA från spike-modulen celler bara (selC). -SelC DA provet innehåller kemiskt deacylated tRNA. De två banden som representerar de laddade och oladdade tRNA arterna är klart åtskilda. Observera försumbar signalen från tRNAselC i körfält utan tillsats spike celler. Samma membranet var successivt avskalade och reprobed för de tRNAsna som anges till vänster. Det inramade området i övre blot anger vilken del av blot, som visas för den efterföljande tRNA inträngandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kvantifiering av nordliga plumpen. tRNA överflöd mäts med hjälp av programvara. (A) A single lane från den nordliga plumpen som ses i figur 2 probed för tRNAargVYZQ. Övre och nedre pilen indikerar aminoacylated tRNA och deacylated tRNA, respektive. De röda linjerna som löper parallellt med lane läggs till och används för att definiera området för kvantifiering. (B) kvantifiering av signal inom två trasiga röda linjer sett (a) skildras som en graf, där den horisontella axeln anger avståndet från toppen av raden i (A) (i pixlar) och den lodräta axeln visar intensiteten i signalen (i antal). De två toppar som innehåller signal med ursprung från aminoacylated tRNA och deacylated tRNA, respektive är definieras manuellt. Data som exporteras för vidare analys är värdet som motsvarar området under var och en av de två topparna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa resultat: kvantifiering av tRNA sammansättning end Ladda nivåer under arginin svält. Kvantifiering av banden på den nordliga plumpen som visas i figur 2. (A) relativt överflöd av tRNAgltTUVW (röd), tRNAargVYZQ (blå) och tRNAhisR (grön). Nivån på noll minuter (prover skördas strax före uppkomsten av svält) är inställd på 1. (B) laddning nivå av de samma tre tRNAsna som i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sonden specificitet | Sonden sekvens |
| tRNAargVYZQ | 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC |
| tRNAgluTUVW | 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG |
| tRNAhisR | 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC |
| tRNAleuPQVT | 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC |
| tRNAleuU | 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG |
| tRNAleuW | 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC |
| tRNAleuX | 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA |
| tRNAleuZ | 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT |
| tRNAlysQTVWYZ | 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC |
| tRNAthrV | 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA |
| tRNAtyrTV | 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA |
| tRNAselC | 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC |
Tabell 1. Tabell över föreslagna sonden sekvenser för valda tRNAs i E. coli k-12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver hur man samtidigt mäta nivån laddning av specifika E. coli tRNAs och jämföra de relativa nivåerna av tRNAsna i olika prover. De kritiska punkterna i protokollet är 1) att hantera proverna på ett sådant sätt att de cellulära tRNA laddning nivåerna behålls, 2) att normalisera tRNA kvantiteter på ett sådant sätt att relativa tRNA nivåer i olika prover kan jämföras på ett tillförlitligt sätt, och 3) att säkerställa sp ecificity av de valda sonderna för tRNAsna sevärdheter. Dessa punkter behandlas separat nedan.
tRNA rening
TRNAsna renas från E. coli på ett skonsamt sätt som är optimerat för att behålla deras cellulära laddningsnivån. Det är vår erfarenhet att detta protokoll primärt extrakt RNAs kortare än 150 nt, tRNA utgör således en stor del av renat RNA. Av denna anledning är det inte rekommenderat att använda det här protokollet för att rena total-RNA från E. coli. Det protokoll som presenteras här bör också vara lämplig för detektion och kvantifiering av andra RNAs såsom små RNA (sRNA) utan någon ytterligare anpassningar. Eftersom protokollet RNA extraktion berikar för korta RNA-sekvenser bör det också finna användning även om sRNA under utredning uttrycks ödmjuk.
Normalisering av spike celler
För att jämföra nivåerna av tRNAen över olika prover, är det nödvändigt att normalisera de tRNA-nivåerna till nivåer av en avskrift som finns i samma Genomsnittligt antal per cell i alla prover, för att korrigera för prov till prov variationer i RNA återhämtning och gel lastning. För detta ändamål spike vi proverna med 5% av referens celler som överuttrycka den sällsynta tRNA-selC före RNA rening. Spike-i metoden är att föredra över med en endogen RNA som referens, eftersom det tillåter jämförelse av tRNA nivåer över villkor där ingen endogena RNAs är känd med säkerhet finns på samma cellulära koncentrationen. Med E. coli celler som spike-modulen har nackdelen att 5% extra E. coli RNA läggs till alla experimentella prover, där det bidrar till signalera av RNA av intresse. Denna bias redovisas av inklusive ett prov som innehåller endast spike-i celler på varje nordliga plumpen och korrigera RNA värden som beskrivs i steg 11.4.1. Uttrycket av tRNAselC vildtyp celler är så lågt jämfört med andra tRNAs (se figur 2) att det gör inte en betydande skillnad i kvantifiering och således kan försummas. Dock i referensstam MAS1074, där selC uttrycks av T7 främjare på en hög kopia plasmid, uppskattar vi att minst 1.000-faldig mer tRNAselC produceras i närvaro av 1 mM IPTG än den som produceras av vildtyp E. coli k-12 under alla förhållanden. MAS1074 upphör att växa efter två generationer av full IPTG induktion. På den punkten, kultur-till-kultur skillnader i induktion av tRNAselC är små, och inte en angelägenhet för detta protokoll som alla portioner med spike celler för en enda experiment är tagna från samma inducerad kulturen av MAS1074. Som ett alternativ till MAS1074, kan celler från en organism vars RNA inte kommer korsreagerar med sonden hybridisering användas som spike-i celler. Sulfolobus solfataricus celler har framgångsrikt använts som spike-i för experiment med E. coli tRNA4. Men E. coli spike celler sannolikt mer exakt speglar graden av cellys experimentella celler, eftersom det är osäkert huruvida S. solfataricus lyserar med samma effektivitet som E. coli. Växande S. solfataricus är också mer tråkiga när de växer på 85 ° C med en generationstid på ~ 16 h.
Att säkerställa specificitet av valda tRNAs
Om både aminoacylated och deacylated tRNA har framgångsrikt bör renat två band upptäckas på norra membranet. Avståndet mellan de två banden varierar beroende på den specifika tRNAen under utredning, och är en kombinerad följd av skillnaden i storlek, polära egenskaper och konformation som en viss aminosyra orsakar när det binder en viss tRNA5 . Exempelvis avståndet mellan aminoacylated och deacylated tRNA är större för tRNAargVYZQ än för tRNAgltTUVW, som kan ses i figur 2. Till följd av den stora storleken på gelen används här för att separera RNA, är upplösningen tillräckligt hög för att skilja laddad tRNA från oladdad men också att skilja de flesta av de olika tRNAsna från varandra på grund av deras skillnader i längd, sekvens sammansättning och modifiering mönster. Även isoaccepting tRNAs kan särskiljas som visas för den leucin acceptera tRNAs2. Observera att det i denna studie inte var möjligt att särskilja tRNAleuPQV från tRNAleuT, som skillnaden i sekvens är dock bara ett G till T substitution.
Om fler än två band visas på norra membranet kan det vara en följd av korsreaktion av sonden med andra RNAs. Ökande striktheten hos tvättningen (steg 9,5) genom att öka temperaturen kan oftast lösa detta. Tvätt 30 min vid 55 ° C räcker oftast. Om ökande tvätta striktheten inte tar bort cross-hybridisering, kan lösningen vara att utforma en ny sond som är ett komplement till en annan (ofta delvis överlappande) del av sekvensen tRNA. Extra band kan också överföringar från en tidigare probe, till följd av otillräcklig strippar av membranet. För att förhindra detta, göra en remsa kontroll genom att exponera membranet innan åter sondering. Om band visas på control Skanna membranet kan behöva ytterligare strippar. Det är oftast möjligt att åter sond ett membran minst 8 - 10 gånger men efter flera sonder kan det vara svårt att tömma helt. Om så är fallet, kan membranet lagras ett par månader innan ny sondering som 32P sönderfaller snabbt.
Ytterligare kontroll av sonden specificitet kan erhållas genom att utföra en nordlig blot med celler skördas under en uppsättning villkor där utskriften av intresse förväntas påverkas på ett förutsägbart sätt. Exempelvis bör inducerbara uttryck för tRNAen från en plasmid eller aminosyra svält för den cognate aminosyran, resultera i en ökad relativ uttryck nivå eller en lägre laddning, respektive av tRNAen sevärdheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Marit Warrer för utmärkt teknisk assistans. Detta arbete stöds av danska rådet för oberoende forskning | Naturvetenskap [1323-00343B] och danska National Research Foundation [DNRF120].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
| Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
| Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
| Phenol | Merck | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| Glucose | |||
| Sodium Acetate | |||
| EDTA | |||
| Ethanol | |||
| Tris | |||
| Hydrochloric acid | |||
| Sodium Chloride | |||
| NaH2PO4 | |||
| Sodium Citrate | |||
| SDS | |||
| Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 γATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
| Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| Spectrophotometer | |||
| Hydridization oven | |||
| Geiger-Müller tube | |||
| Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
| Hybridization tube | |||
| Culture Flasks | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 20 ml centrifuge tubes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageQuant | GE Healthcare | ||
| Excel | Microsoft |
References
- Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
- Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
- Krüger, M. K., Sørensen, M. A.
- Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
- Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
- Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
- Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
- Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).
- Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
- Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
- Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
- Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).
- Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
- McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
- Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
- Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
- Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F.
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
- Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
- Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).
