Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в Escherichia coli

Published: August 22, 2017 doi: 10.3791/56212
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Copenhagen

Summary

Здесь мы представляем метод непосредственно измерения передачи РНК зарядки уровней от очищенной Escherichia coli РНК, а также способ сравнения относительных уровней передачи РНК, или любые другие короткие РНК, через различные образцы на основе добавления Спайк в клетки, выражая ссылка ген.

Abstract

Транспортная РНК (тРНК) является неотъемлемой частью трансляционного оборудования в любом организме. tRNAs связывают и передать перевода рибосома аминокислоты. Относительные уровни разных tRNAs и отношение aminoacylated tRNA для всего тРНК, известный как уровень зарядки, являются важными факторами в определении точность и скорость перевода. Таким образом численность и уровень заряда tRNAs являются важными переменными для измерения при изучении синтез белков, например при различных условиях стресса. Здесь мы описываем метод для уборки тРНК и непосредственно измерения относительного изобилия и абсолютный уровень зарядки конкретных видов tRNA в Escherichia coli. TRNA собирают таким образом, что лабильной связь между tRNA и его аминокислотный сохраняется. Электрофорез геля и Северный blotting, что приводит к Разделение заряженных и незаряженных tRNAs, затем подвергается РНК. Связано с добавлением Спайк клетки для нормализации можно сравнить уровни конкретных tRNAs в различных образцах. До очистки РНК мы добавляем 5% клеток кишечной палочки , которые перепроизводства редких тРНКselC для каждого образца. Количество видов tRNA интерес в образец затем нормируется на количествоselC tRNA в том же образце. Добавление Спайк клетки до РНК имеет преимущество перед добавлением очищенный Спайк в РНК, которые также приходится любые различия в эффективности лизис клеток между выборками.

Introduction

Ниже мы представляем метод количественной оценки конкретных tRNAs и измерения их зарядки уровнях Северный blotting. Метод основан на методе, впервые разработанный Varshney и др. 1. уборки клеток в трихлоруксусной кислоты (TCA) и хранение образцов при 0 ° C на протяжении Очистка РНК, Эстер Бонд между tRNA и аминокислоты – сохранены2,3,4. Aminoacylated tRNAs можно отличить от их nonacylated коллеги, электрофорез геля и Северный blotting, из-за снижения мобильности aminoacylated tRNA в геле, вызванные ковалентно связанного амино кислоты5. Кроме того мы представляем собой протокол для нормализации tRNA количествах добавлением Спайк клеток, экспрессирующих редко используемых тРНКselC 4.

tRNAs являются одними из самых распространенных молекул в бактериальной клетке и абсолютно жизненно важной частью механизма Организации письменного перевода. tRNAs связывания аминокислот и их передачи в переводе рибосом. Аминоацил тРНК-синтетаз способствует связывания аминокислот с tRNAs (aminoacylation или зарядки). Относительное обилие различных заряженных tRNAs имеет важное значение для обеспечения точности белкового синтеза, потому что недопредставленность Когнаты заряженные tRNA для данного матричная РНК (мРНК) кодон увеличивает вероятность того, что вблизи Когнаты tRNA будет ошибочно доставить его аминокислоты к растущей полипептидной цепи на рибосомы6. Важность заряженных tRNA отражается в обширной реакции клеток E. coli к резкому сокращению уровня зарядки tRNA; строгие ответ. Во время строгих реакции синтеза tRNAs, рибосомной РНК и большинство мРНК опускается пользу транскрипции конкретные мРНК, связанные с аминокислоты биосинтез и стресс выживания, и темпы роста клеток снижается резко7 . Кроме того последние работы нами и другими показал, что E. coli активно деградирует большинство его tRNA в ответ на стрессы, которые ограничивают перевод4,8, предполагая, что корректировка tRNA уровней может быть важное значение для борьбы с такими напряжений. Таким образом надежных измерений tRNA распространённость и зарядки уровней будет важным инструментом для полного понимания бактериальных напряжений ответы.

E.coli часто используется для выражения рекомбинантных белков и вследствие различий в использовании кодон между видами, субоптимальный выражение является проблемой часто сталкиваются с9. Это можно обойти, выражение дополнительных tRNAs необходимо перевести рекомбинантных мРНК10. Измерения tRNA зарядки уровнях в таких штаммов может направлять неполадок усилия и помочь оптимизировать выражение протеина.

Этот метод также позволяет выявлять «mischarging»; aminoacylated молекулы тРНК с не Когнаты аминокислоты. Aminoacylation, различные аминокислоты может вызвать tRNA мигрировать с немного различных скоростей через полиакриламидных гелей1,11. В некоторых случаях метод может также использоваться для различения разных модификации шаблонов на идентичных tRNAs3.

Другой создана биохимические процедуры для расследования tRNA зарядки уровнях Периодат окисления. Метод основывается на том наблюдении, что aminoacylated tRNA защищена от Периодат окисления и незаряженных tRNA нет. После Периодат окисления лечения подзарядки tRNA используется для оценки уровень заряда собранного РНК. Однако зарядка нескольких tRNAs было показано пострадать от лечения, обеспечивая тем самым некоторые неточности12. Метод здесь представлены меры зарядки непосредственно из очищенного РНК, таким образом исключая любых отклонений от химических или ферментативных реакций. Ограничение этого метода состоит, что только один вид tRNA обнаружен в то время, так что хотя же Северной пятно может быть лишен и reprobed для нескольких tRNAs, это много времени и несколько трудоемкий для сбора данных о многих tRNAs.

Надежный способ нормализации образцы друг другу жизненно важную роль в исследованиях, где цель заключается в том, чтобы сравнить относительные уровни молекулы через различные образцы. Здесь мы представляем нормализации процедуры для РНК, где небольшие Алиготе E. coli клеток, экспрессирующих редких тРНКselC добавляется как Спайк в всех экспериментальных образцов до РНК. Этот метод является полезным не только при изучении tRNAs, но относительно количественной оценки любых видов РНК при экспериментальной установки такова, что не эндогенных РНК можно доверять, чтобы быть присутствовать на такой же концентрации клеточных во всех образцах. Например уровень «хозяйствования» рибосомной РНК РНК как часто используется как эндогенных ссылку сравнить относительные количества другой РНК между различными образцы13. Но это мало пользы если сотовой концентрация РНК ссылка колеблется между образцами, как может быть в случае рибосомной РНК, если выборка происходит во время стресса ответ15,,1617 или вступление в стационарной фазы17. Добавление Спайк в клетки экспериментальных образцов до РНК обеспечивает прочную и точный способ нормализации независимо от установки выборки. Еще один способ стандартизации является добавление одного или нескольких RNAs Спайк в экспериментальных образцов после РНК. Однако этот метод не учитывает любые различия в РНК восстановления между выборками.

С использованием клеток кишечной палочки , overexpress, ссылка РНК как Спайк клетки (см. Рисунок 1) в эксперименте на E. coli имеет тот недостаток, что оно приводит к в дополнение небольшое количество экзогенных E. coli всего РНК в образцы. Мы правильно для этого добавления, анализируя образцы, содержащие только Спайк в клетки параллельно с экспериментальных образцов (см. Северной пятно в Лейн Рисунок 2, , под названием «selC»). Представил протокол разработан для E. coli K-12, но может применяться для большинства видов бактерий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка бактериальных культур.

  1. Растут всех культур в Эрленмейер колбы с коэффициентом объем культуры/колба на большинстве 1/6. В типичной экспериментальной установки растут культур в 37.0 ° C и тряски на 160 об/мин в morpholinepropanesulfonic кислоты (МОПЫ) минимальный средний 18 дополнена источника предпочтительным углерода, например 0,2% глюкозы, для по крайней мере 10 последовательных поколений перед РНК урожай.
  2. За день до урожая РНК, разбавляют перерос культуры штамма желаемого в MOPS минимальной среде таким образом, что он достигнет желаемого ОД 436 в нужный момент следующий день. Рассчитать объем перерос культуры для использования для прививки по формуле:
    Equation 1
    Примечание: здесь, ОД новых обозначает желаемого ОД 436 После инкубации, V новой обозначает объем разреженных культуры, ОД старым обозначает ОД 436 перерос культуры, разбавленным с, G обозначает количество поколений культуры будет расти, от время растворения (т 1) время она нужна на следующий день после (2 t) и может быть рассчитана как: время разница (в мин) t 1 и t 2 деленному на время поколения (в мин). Для обеспечения устойчивого состояния роста во время выборки, G должно быть ≥ 10; V старый обозначает объем вне выращивать культуры, которые должны быть переданы в средство свежий. Это уравнение является приближение, которое не учитывает любое запаздывание фазы; явление, часто наблюдается после разбавления вне выращивать культуры в свежих СМИ.
    1. Условия роста будет варьироваться в зависимости от цели эксперимента, но ограничить изменения в ячейке в tRNA уровнях и увеличить воспроизводимость результатов, (рекомендуется) растут культур устойчивое состояние до отбора проб 19.

2. Подготовка Спайк в клетки

Примечание: штамм E. coli MAS1074, который выражает selC гену selC tRNA под контролем изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG)- индуцибельной промоутер используется как штамм Спайк в.

  1. Развести перерос культуры MAS1074 к ОД 436 0,05 в MOPS минимальный средний дополняется 100 мкг/мл Ампициллин и 0,2% раствор глюкозы. Расти культуры при 37 ° C, тряски на 160 об/мин.
    Примечание: Смотрите обсуждение для использования альтернативного эталонного штамма.
  2. На од 436 ~ 0.1, добавить IPTG в конечной концентрации 1 мм побудить выражений тРНКГлу selC. Расти ОД 436 ~0.5 культуры (~ 3-4 h роста) и переместить культуры колбу в ледяной бане. Держите Спайк в ячейку культуры на льду, пока не были собраны все образцы для РНК.

3. Урожай экспериментальных образцов.

  1. Предварительно теплой (37 ° C), один максимум 100 мл колбу Эрленмейера (или аналогичный) содержащий 4 мл 10% (w/v) трихлоруксусной кислоты (TCA) для каждого образца, поместив его в ванну с подогретой водой.
    Примечание: осторожно, TCA разлагается при нагревании, производить токсичные и коррозионные газы, включая хлористый водород и хлороформе. Раствор в воде-сильная кислота; Он реагирует яростно с базами и для многих металлов. При использовании этой жидкости следует принимать надлежащие меры предосторожности.
  2. Непосредственно перед ячейка урожай, измерить и записать ОД 436 культуры.
  3. Урожая клеток, передачи 4 мл культуры подогретым флакон, содержащий TCA.
  4. Mix образца закрученного колбу руками за 5 с. смешивание с TCA немедленно отключает все ферментативную деятельность и таким образом сохраняет уровень заряда tRNAs.
    Примечание: Если несколько образцов должны быть собраны, хранить собранные образцы в ГТС на льду до тех пор, пока все пробы.

4. Добавление Спайк в клетки

Примечание: подготовка Спайк в клетки описано в шаге 2.

  1. Когда все образцы для приготовления РНК были собраны, добавить 5% Спайк в клетки (на основе OD) для каждой выборки.
    Примечание: Объем Спайк в клеточной культуры необходимо рассчитывается по формуле:
    Equation 2
    где V Спайк обозначает объем Спайк в клеточной культуры необходимо, V exp обозначает объем собранных экспериментальных клетки культуры (без TCA), ОД exp обозначает ОД 436 экспериментальной клетки культуры во время сбора урожая в ГТС. ОД Спайк обозначает ОД 436 Спайк в ячейку культуры. Если несколько образцов собирают в разных ОРВ, объем Спайк в ячейки, добавленные должны корректироваться согласно формуле выше для каждой выборки.
  2. Для количественной оценки вклада из клеток, Спайк в РНК видов интерес, подготовить образец только содержащие Спайк в клетки путем смешивания 4 мл Спайк в клетки с 4 мл TCA. Подготовить РНК из этого примера в так же, как и другие примеры.
  3. При необходимости взять другую колбу, содержащие только экспериментальный образец, без всплеска в клетки и включить его для количественной оценки вклада экспериментального образца к тРНК selC уровнях; эндогенными уровнями тРНК selC в E. coli K-12 ничтожно низкой.

5. Подготовка РНК

Примечание: протокол подготовки РНК, описанный здесь является по существу, описанного Varshney и др. 1; Чтобы избежать deacylation aminoacylated tRNAs во время очистки важно сохранить образцы в кислой рН и 0 ° C в ходе очистки. Используйте чистые стерильные трубы/колбы для хранения образцов и решения и подготовить все решения с сверхчистого (18,2 MΩ·cm удельное сопротивление) воды.

  1. Pour 8 мл каждого образца в трубу льда охлажденной центрифуге. Центрифугуйте образцы на 10 мин на 9500 x g при 4 ° C. полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте в 0,3 мл холодной 0,3 М ацетат натрия, pH 4.5 и 10 мм ЭДТА.
  2. Передача каждый образец пробки microcentrifuge холодной 1,5 мл и добавлять 0,3 мл фенола, достижение равновесного уровня с тот же буфер.
    Примечание: осторожно, фенола производит токсичных испарений и сильнокоррозионные кожу.
  3. Водоворот каждый образец 10 x 15 s с по крайней мере 1 мин между каждой вихря. Между vortexing сохранить образцы в 0 ° C. использовать частые перерывы, чтобы гарантировать, что образцы остаются холодно.
  4. Образцы центрифуги для 15 мин на 20000 x g на 4 ° C. передачи воды фаза (верхняя) для новых microcentrifuge 1,5 мл трубки. Добавление 0,3 мл холодной фенола и вихрь 4 x 15 s, как раньше.
  5. Центрифуги для 10 мин на 20000 x g на 4 ° C. Передача водной фазы к новой, холодная 1,5 мл microcentrifuge трубы, содержащие 2,5 раза объем 96% этанола (~ 750 мкл). Осадок РНК путем инкубации трубы за 1 ч, при-20 ° C, или на ночь на -80 ° C.
  6. Образцы центрифуги для 30 мин при 20000 x g на 4 ° C. удалить супернатант и тщательно добавить 1 мл холодной 70% этанола не нарушая Пелле РНК. Аккуратно перевернуть раз мыть внутренности трубок с этанолом.
    Примечание: Гранулы может быть трудно увидеть на этот шаг.
  7. Центрифуги для 10 мин на 20000 x g на 4 ° C. полностью удалить супернатант и просушите гранулы, пока слева не этанола. Ресуспензируйте гранулы, активно vortexing в 20 мкл холодной 10 натрия ацетата pH 4.5 и 1 мм ЭДТА.
    Примечание: Не чрезмерно сухие гранулы как он станет трудно Ресуспензируйте.
  8. При необходимости оценки концентрации РНК путем измерения оптической плотности на 260 Нм.
  9. Дополнительно оценить качество очищенного РНК путем электрофореза геля агарозы 20.
  10. Образцов магазина на -80 ° C.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
< класса p= «jove_title» > 6. Подготовка химически образца управления deacylated

Примечание: различать группы aminoacylated тРНК с его коллегой deacylated на северном пятно, химически deacylated аликвота подготовленный щелочной лечения. Для большинства целей, это достаточно deacylate одного образца для каждого Северная помарка.

Образец
  1. оттепель РНК на льду. Передача 4 мкл Алиготе РНК образца к новой пробке. Добавление 46 мкл трис-HCl рН 9,0. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
  2. 15 мкл натрия ацетата 0,3 М при pH 4.5 и впоследствии 125 мкл Этанол 96%. Осадок РНК в-20 ° C в течение 1 ч.
  3. Центрифуги для 30 мин при 20000 x g на 4 ° C. полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте в 4 мкл холодной 10 мм натрия ацетата рН 4,5 и 1 мм ЭДТА.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена, если образца хранится на -80 ° C.

7. Гель-электрофорез и Северный blotting

  1. смесь 4 мкл пример (необработанных или химически deacylated) с 6 мкл загрузки буфера (0,1 М ацетат натрия (рН 5,0), 8 M мочевины, 0,05% бромфеноловый синий и 0,05% ксилола cyanol).
    Примечание: Не забудьте включить образец, содержащий только Спайк в клетки, химически deacylated примеры (и без всплеска в клетки, если один был подготовлен).
  2. Загрузить образцы на 0,4 мм толщиной 6,5% геля полиакриламида (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) содержащий 8 M мочевины в 0,1 М натрия ацетата буфере (рН 5,0). Используйте 60 см длиной гели для надлежащего разделения видов tRNA.
  3. Отдельные РНК электрофорезом на 10 V/см геля на 4 ° C, до бромфеноловый синий достигает нижней части гель (~ 20 h).
  4. Области от cyanol краситель ксилол и 20 см вниз к бромфеноловый синий краситель используется для blotting (расстояние между двумя краски должна быть 25-30 см). Осторожно отделите две стеклянные пластины, так что гель остается на одном из них. Тонкий кусок фильтровальной бумаги нарезанные по размеру области желаемого blotting и размещены на верхней частью гель, который будет использоваться для blotting. Части геля, которые не охватываются фильтровальная бумага cut off и отбрасывается. Используйте фильтровальную бумагу осторожно снять гель кусок от стеклянной пластине.
    Примечание: Большой гель очень хрупкие так обращаться с осторожностью.
  5. Мембрана положительно заряженный нейлон (например, N Hybond +-мембрана) помещен na górze геля, и это electroblotted на 20 V 90 мин, с использованием 40 мм трис ацетат (рН 8.1), 2 мм ЭДТА как передачи буфера.
  6. Crosslink РНК с помощью УФ света мембраны (0.12 Дж/см 2).
    Примечание: Мембрана теперь могут храниться при комнатной температуре и протокол может быть приостановлена здесь.

8. Проектирование и проверка преобразователей

Примечание: тщательное проектирование и проверка Северная помарка зондов имеет решающее значение для получения надежных результатов и избежать нежелательных крест гибридизации с другими видами РНК.

  1. Использования коротких синтетические олигонуклеотиды как зонды. Дизайн зонд последовательность таким образом, что он является дополнением к наиболее уникальной частью последовательности tRNA интерес - это часто антикодон цикла.
    Примечание: Список предсказал tRNA последовательностей из различных организмов можно найти в геномной tRNA базы данных (GtRNAdb) 21.
  2. Отрегулируйте длину последовательности для получения прогнозируемых плавления температура 55-65 ° C.
  3. Взрыва (основной инструмент поиска местных выравнивание) выбранной последовательности против генома бактерий штамма, используемых в эксперименте, чтобы убедиться, что последовательность является уникальным для выбранного tRNA, как описано в 22.
    Примечание: В таблице 1 перечислены предлагаемые зонд последовательности для нескольких различных tRNAs E. coli K12. Если зонд является специфичным для tRNA интерес, только две полосы видны на Северная помарка (заряженных и незаряженных тРНК) и только одна полоса является видимым в полосу с deacylated образца (нетарифицируемых тРНК). Если присутствуют более чем двух полос или если дальнейшие проверки зонд специфичности, см.

9. Гибридизация Северная помарка

Примечание: В следующих шагах, мембрана последовательно гибридизированных с зондами дополняет желаемых конкретных tRNAs, включая конкретный зонд для ссылки тРНК selC.

  1. Мембрану в трубу гибридизации и добавить 6 мл раствора гибридизации (0,9 М NaCl, 0,05 М NaH 2 PO 4 (рН 7,7), 5 мм ЭДТА, 0,5% (w/v) SDS, 100 мг/мл стриженый и денатурированный ДНК спермы сельди и 5 x Denhardt ' s раствор (100 x Денхардта ' раствор s = 2% бычьего сывороточного альбумина, 2% поливинилпирролидона 40 и 2% Ficoll)).
  2. Предварительно гибридизируйте мембраны в буфере для 1 h, вращающихся на 42 ° C. Добавить 30 пмоль радиоактивных oligo ДНК-зонд 5 ' - конец - помечены с 32 P (подготовлен как описано в Sambrook и др. 23)
    Примечание: осторожно, высокоэнергетические бета выбросов от 32 P может представлять существенный кожи и глаз дозы опасности. При использовании 32 P. радиоактивных отходов следует утилизировать согласно соответствующей институциональной безопасности протоколов следует принимать надлежащие меры предосторожности.
  3. Инкубировать зонд с мембранная ночь вращается на 42 ° C. удалить зонд, с помощью одноразовых 10 мл пипетки.
    Примечание: Если хранится в холодильнике зонд может быть повторно использован.
  4. В гибридизации трубки, Промойте мембрану вскоре в 50 мл 0,3 М NaCl, цитрат натрия 30 мм, 0,1% (w/v) SDS при комнатной температуре.
    Примечание: Это первый мыть содержит много несвязанных зонд и должны быть обработаны как высокорадиоактивных.
  5. Повторить шаг 9.4 один раз, а затем переместите мембраны плоский пластмассовый контейнер или лоток, включая крышкой. Покрытие мембраны с моющим раствором (0,3 М NaCl, цитрат натрия 30 мм, 0,1% (w/v) SDS) и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
  6. Изменить моющего раствора и продолжить мойки до тех пор, пока удовлетворяющих соотношение сигнал-шум был получен (часто 3-4 изменения моющего раствора). Для обнаружения изменений чтобы отношение сигнал / шум путем измерения излучения от пустой области мембраны и сравнить его в район, где зонд гибридизированных специально для tRNA использовать трубка Гейгера-Мюллера.
  7. Для того, чтобы иметь возможность лишить зонд из мембраны после облучения, убедитесь, что (важно) мембрана не высохнуть перед процедурой зачистки. Поместите мембраны в тонкий пластиковый пакет или оберните его плотно с использованием пластиковых оберните и запечатать его в герметичный ленты или сварки. Место запечатанном мембраны на экране phosphorimaging.
    Примечание: Требуется выдержка на экране phosphorimaging определяется удельной активности зонда, количество РНК зондируемой for и эффективность гибридизация зонда, и может варьироваться; от нескольких минут до нескольких дней. С опытом работы интенсивности излучения, обнаруженные на мембрану с трубка Гейгера-Мюллера дает хорошее представление о требуемых выдержка. Для надежной количественной оценки, важно, что экран не переэкспонированных.
  8. Сканирования на экране phosphorimaging, с помощью лазерного сканера и сохраните файл в " .gel " формате.
    Примечание: Высокое соотношение сигнал-шум необходима для надежной количественной оценки. Зондирования для tRNA должно привести две группы; один содержащие aminoacylated tRNA (медленнее, миграция) и один содержащие deacylated tRNA (быстрее миграции). Смотрите Рисунок 2.

10. Зачистки мембраны

Примечание: прежде чем мембрана может быть исследован на другой tRNA, предыдущий зонд сначала должны быть удалены путем снятия мембраны.

  1. Тепла достаточно зачистки буфер (15 мм NaCl, цитрат натрия 1,5 мм, 0,1% (w/v) SDS) для покрытия мембраны и налить его над мембраной. Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
  2. Повторите шаг 10.1 пока нет излучения могут быть обнаружены с трубка Гейгера-Мюллера; мембрана теперь могут быть повторно гибридизированные следующие шаги, описанные в разделе 9.

11. Количественной оценки тРНК и зарядки уровней

  1. загрузки файла .gel в изображений программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Нарисуйте вертикальную линию вдоль каждой из полос образца таким образом, что он охватывает большую часть ширины полосы, но исключает края полосы, где сигнал может быть неравномерным, как показано на рис 3А.
  2. Визуализация графов из каждой полосы, нажав " анализ "-> " создать граф ". Вручную определить две вершины, представляющие заряженных и незаряженных tRNA от каждого Лейн, как показано на рисунке 3B.
  3. Получить графов от каждого пика, нажав " анализ "-> " района доклад " и записывать площадь под каждой из двух пиков.
  4. Когда пятно был исследован тРНК selC и по крайней мере один tRNA интерес, нормализации уровня tRNA интерес к тРНК selC.
    1. Вычислить долю tRNA, происходящих из клеток Спайк в в каждой полосе и вычесть из общего сигнала в этом переулке, используя уравнение:
      Equation 3
      Примечание: здесь, Образец тРНК = сигнал, полученные от одного Лейн мембраны зондируемой для желаемого tRNA; Пример selC = сигнал, полученные из той же полосы же мембраны, проверяемые для тРНК selC; Ref tRNA = сигнал, полученные от Лейн, содержащие только Спайк в ячейке РНК же мембраны, проверяемые для желаемого tRNA; Ref selC = сигнал, полученные от Лейн, содержащие только Спайк в ячейке РНК же мембраны, проверяемые для тРНК selC.
    2. Для нормализации, разделите исправленное значение tRNA от каждого Лейн тРНК selC сигнал от той же полосы.
      Примечание: Вклад тРНК selC сигнал от пробы клеток является незначительным (см. рис. 2, Лейн помечены "-selC ").
  5. Вычислить tRNA зарядки уровень для каждого Лейн, разделив сигнал пик, представляющих заряженных tRNA с суммой сигнала от обоих пиков (взимается + нетарифицируемых).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С помощью процедуры описано здесь, изобилие и зарядки, что уровни трех tRNAs были измерены в E. coli K-12 до и во время голода аминокислоты.

Аргинин auxotroph штамма NF9154 (Чет леи его argH Тхи mtl supE44) был выросли по крайней мере десять поколений в минимальный средний MOPS дополнена 0,4% глицерина, 50 мкг/мл треонин, лейцина, аргинин и гистидина 5 мкг/мл при 37 ° C, тряски на 160 об/мин. Аргинин голода была введена путем фильтрации культуры и ресуспендирования в свежие среднего MOPS, как выше, но без аргинин. Во время голодания аргинин синтез белков сильно уменьшается, но остается на низком уровне с помощью аргинин, выпустил в оборот существующих белков. Образцы были собраны на момент точки указано на рисунке 4. После того, как все образцы были собраны в ГТС, 5% MAS1074 Спайк в клеток, экспрессирующихselCтРНК, был добавлен в каждый образец, как показано в Рисунок 1. РНК был очищен от образцов, отделены электрофорезом и смыл на мембрану, как описано в протоколе. Мембрана был исследован тРНКargVYZQ,gltTUVWтРНК, tRNAhisRи тРНКselC, как показано на рисунке 2. Излучения сигнала от каждой Лейн был количественно определен для каждого из четырех датчиков, как показано на рисунке 3и исправленные и нормализованных, как описано в разделе 11. Результаты представлены на рисунке 4. На рисунке 4A показано, что уровни всех протестированных tRNA видов быстро уменьшаться во время голодания аминокислоты, как недавно сообщили4. Рисунок 4B , показывает, что tRNA, зарядки, уровни ведут себя, как ожидалось: заряженных часть аргинин принимая tRNA быстро падает после удаления аргинин от среднего роста, в то время как уровень заряда других tRNAs незначительно увеличиться после голода потому что взимается tRNAs накапливаются, когда уровень их разрядке на рибосомах уменьшается из-за отсутствия субстрат для синтеза белка4. Далее в период голодания, заряженных tRNA дроби уменьшается до уровня примерно до голода вследствие деградации большинства tRNA бассейна (рис. 4A), что приводит к большей скоростью по разрядке из оставшихся tRNAs на рибосомы. Напротив заряженных часть тРНКargVYZQ увеличивается по крайней мере двум причинам; 1) активации строгого ответа означает, что мРНК, не взимается tRNAarg, становится ограничивающим фактором для перевода и 2) общий пул tRNAarg является снижение (рис. 4A) так что большего часть всего тРНКarg может быть предъявлено обвинение по же небольшое количество аргинина. Этот эксперимент показывает, как одновременных измерений tRNA изобилия и уровень заряда tRNA обеспечивает высокое качество информации об условиях для синтеза белков внутри клетки.

Figure 1
Рисунок 1. Добавление Спайк клетки, чтобы образцы. В этом примере образцов из одной культуры е. coli NF915 собирают в временных рядов до и во время голода аминокислоты. Показано схематическое изображение кривой роста NF915, где синие точки указывают точки образца урожая. Логарифмическая шкала оси y. Образцы экспериментальные общество собирают, как описано в разделе 3. Схематическое изображение кривой роста штамма Спайк в MAS1074 также показано, с точкой образцов урожая указывается в виде синей точки. Для иллюстрации того, что все экспериментальные образцы ( E. coli NF915 в этом примере) получить Алиготе Спайк в клеток из одной и той же культуры ведения точки фигуры. Для каждого образца, 5% клеток Спайк в добавляются к экспериментальной клетки, рассчитывается на основании ОД клеточных культур (см. раздел 4). Впоследствии очищенной от всех образцов и используется для Северной помарки РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Люминофор тепловизор сканирования Северная помарка зондируемой для указанных tRNAs. Мембрана содержит РНК от штамм E. coli NF915 собирают в назначенное время точек до и после индукции аргинин голода (минут). Кроме того, мембрана содержит две полосы образцов, где были опущены в Спайк клетки (-selC да и - selC), и Лейн, содержащие РНК от Спайк в клетках только (selC). Пример - selC да содержит химически deacylated тРНК. Две группы, представляющие заряженных и незаряженных tRNA видов четко отделены. Спайк в клетки без Добавлено примечание незначительным сигнал отselC tRNA в переулках. Же мембрана была последовательно раздели и reprobed для tRNAs указал на левой стороне. Области в штучной упаковке в верхнее пятно указывает часть пятно, которая показана для последующего tRNA зондирований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Количественная оценка Северная помарка. изобилие tRNA измеряется с помощью программного обеспечения. (A) A один переулок от Северная помарка, видели в рисунке 2 зондируемой для тРНКargVYZQ. Верхняя и Нижняя стрелка показывают aminoacylated тРНК и deacylated тРНК, соответственно. Красные линии, проходящей параллельно с Лейн добавляются и используется для определения области для количественной оценки. (B) количественная оценка сигнала в пределах двух сломанной красные линии, видели в (A) изображается как графа, где горизонтальная ось указывает расстояние от верхней части линии в (A) (в пикселах), и вертикальная ось показывает интенсивность сигнала (СИГ). Две вершины содержащие сигнал возникая от aminoacylated тРНК и deacylated тРНК, соответственно, являются определена вручную. Данные, которые экспортируются для дальнейшего анализа является значение, соответствующее области под каждой из двух пиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Представитель результат: количественная оценка tRNA распространённостьd зарядки во время голодания аргинина уровнях. Количественная оценка полос на Северная помарка, показано на рисунке 2. (A) относительное обилие тРНКgltTUVW (красный), tRNAargVYZQ (синий) и тРНКhisR (зеленый). Уровень в ноль минут (образцы, собирают только до наступления голода) имеет значение 1. (B) зарядки уровень же три tRNAs как (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Специфика зонд Зонд последовательность
tRNAargVYZQ 5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC
tRNAgluTUVW 5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG
tRNAhisR 5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC
tRNAleuPQVT 5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC
tRNAleuU 5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG
tRNAleuW 5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC
tRNAleuX 5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA
tRNAleuZ 5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT
tRNAlysQTVWYZ 5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC
tRNAthrV 5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA
tRNAtyrTV 5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA
tRNAselC 5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC

Таблица 1. Таблица предлагаемых зонд последовательностей для выбранного tRNAs в E. coli K-12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает как одновременно измерить уровень зарядки конкретных E. coli tRNAs и сравнить относительные уровни tRNAs в различных образцах. Критические точки протокола являются 1) для обработки проб таким образом, что уровень заряда сотовой tRNA сохраняются, 2) для нормализации tRNA количества таким образом, что можно надежно по сравнению относительных уровней tRNA в различных образцах и 3) для обеспечения sp ecificity выбранных зондов для tRNAs интерес. Эти вопросы рассматриваются отдельно ниже.

tRNA очистки

TRNAs очищаются от кишечной палочки в нежный способом, которая оптимизирована для сохранения их клеточных уровень заряда. Это наш опыт, что этот протокол главным образом извлекает РНК, короче, чем 150 nt, таким образом tRNA представляет значительную часть очищенной РНК. По этой причине не рекомендуется использовать этот протокол для очистки всего РНК от кишечной палочки. Протокол, представленные здесь также должно быть подходящим для выявления и количественной оценки других РНК как малые РНК (Срна) без каких-либо дальнейших адаптации. Потому что протокол извлечения РНК обогащает для коротких последовательностей РНК она должна также найти использования, даже если Срна расследуется смирен выражается.

Нормализация Спайк в клетки

Чтобы сравнить уровни tRNA через различные образцы, необходимо нормализовать tRNA уровня до уровня стенограмме, что присутствует в том же среднее число в ячейку во всех пробах, для того чтобы исправить-образец вариации в РНК восстановление и гель загрузки. Для этой цели мы Спайк образцы с 5% ссылка клеток, которые overexpress редких тРНКselC до РНК. Спайк в метод предпочтительнее над использованием эндогенного РНК как ссылка, потому, что она допускает сравнение уровней tRNA в условиях, где нет эндогенных молекул РНК известны с уверенностью можно найти на такой же концентрации клеточных. Используя как Спайк в клетках E. coli имеет недостаток что 5% дополнительных E. coli РНК добавляется всех экспериментальных образцов, где это способствует сигнал РНК интерес. Эта предвзятость объясняется включая образец, содержащий только Спайк в клетки на каждый Северная помарка и исправляя РНК значения, как описано в шаге 11.4.1. Выражение tRNA,selC в клетках дикого типа так низко, по сравнению с другими tRNAs (см. Рисунок 2), что он не делает существенное различие в квантификации и таким образом можно пренебречь. Однако, в эталонного штамма MAS1074, где selC выражается промоутер7 T на высокой копировать плазмиду, мы оцениваем, что по крайней мере кратное больше тРНКselC производится в присутствии 1 мм ИПТГ чем вырабатываемое wildtype э. Коли K-12 ни при каких условиях. MAS1074 перестает расти после двух поколений ознакомительное IPTG. В тот момент культура культура различия в индукции тРНКselC малы, и не интерес для настоящего протокола как все аликвоты Спайк клетки для одного эксперимента взяты из той же индуцированных культуры MAS1074. Как альтернатива MAS1074 клетки организма, чьи РНК не будет cross-react с гибридизации зонда может использоваться как Спайк в клетки. Клетки Sulfolobus solfataricus успешно были использованы как Спайк в для экспериментов с E. coli tRNA4. Однако, E. coli Спайк в клетки, скорее всего, более точно отражать степень лизис клеток экспериментальной клеток, как неясно, является ли S. solfataricus лизирует с той же эффективностью, как E. coli. Кроме того растущий S. solfataricus более утомительно, как они растут на 85 ° C с поколения время ~ 16 h.

Обеспечение специфика отдельных tRNAs

Если aminoacylated и deacylated tRNA был успешно очищенный две полосы должны быть обнаружены на севере мембраны. Расстояние между двумя группами будет отличаться в зависимости от конкретных tRNA расследуется и комбинированные следствием разницы в размерах, Полярный свойства и конформации, что вызывает определенную аминокислоту, когда он связывает конкретного тРНК5 . Например расстояние между aminoacylated и deacylated tRNA больше для тРНКargVYZQ , чем это дляgltTUVWтРНК, как показано на рисунке 2. Вследствие большого объема геля, здесь используется для разделения РНК резолюция является достаточно высоким отличить заряженных tRNA от без предъявления обвинений, но и различать большинство различных tRNAs друг от друга из-за их различия в длине, последовательность состав и модификации шаблонов. Даже isoaccepting tRNAs можно выделить как показано для лейцина, принимая tRNAs2. Однако обратите внимание, что в этом исследовании не удалось различают тРНКleuPQV от tRNAЛейт, как разница в последовательности является только один G T замещения.

Если более чем две полосы появляются на севере мембраны, это может быть следствием перекрестные реакции зонда с другими РНК. Увеличение жесткости мыть шаг (шаг 9.5) путем повышения температуры может обычно решить эту проблему. Стиральные 30 мин при температуре 55 ° C обычно достаточно. Если увеличение жесткости мыть не удалить крест гибридизации, решение может быть разработать новый зонд, который дополняет другую (часто частично перекрывающихся) часть tRNA последовательности. Дополнительные полосы также может быть перенос из предыдущих зонд, вследствие недостаточной зачистки мембраны. Чтобы предотвратить это, сделать элемент полосы, обнажая мембранных перед повторной проверки. Если полосы появляются на проверку управления мембраны может понадобиться дополнительная зачистка. Это обычно возможно повторно зонд мембраны по крайней мере 8 - 10 раз, но после нескольких датчиков может быть трудно полностью раздеться. Если это так, мембрана может храниться несколько месяцев, прежде чем повторно зондирующего как 32P распадов быстро.

Дальнейшей проверки специфики зонд можно получить, выполнив Северной пятно с клетки собирают под набор условий где Стенограмма интерес, как ожидается, будут затронуты на предсказуемой основе. К примеру индуцибельной выражение tRNA из плазмида или аминокислоты голода для родственных аминокислоты, должно привести к расширенной относительное выражение уровня или более низкого уровня зарядки, соответственно, из tRNA интерес.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Марит Warrer за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана Датский Совет независимых исследований | Датский национальный исследовательский фонд [DNRF120] и естественные науки [1323-00343B].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urea Merck 57-13-6 Purity >99%
Polyacrylamide Serva 79-06-7
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) BIO-RAD 161-0201
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma 76-03-9
Phenol Merck 108-95-2
IPTG
Glucose
Sodium Acetate
EDTA
Ethanol
Tris
Hydrochloric acid
Sodium Chloride
NaH2PO4
Sodium Citrate
SDS
Herring Sperm DNA Sigma 100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 γATP Perkin Elmer
DNA oligos (probes) TAG Copenhagen
Hybond N+ membrane GE Healthcare RPN203B
Crosslinker
Electroblotter BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner GE Healthcare 28955809
Spectrophotometer
Hydridization oven
Geiger-Müller tube
Phosphor imager screen GE Healthcare
Hybridization tube
Culture Flasks
1.5 ml microcentrifuge tubes
20 ml centrifuge tubes
Name Company Catalog Number Comments
Software
ImageQuant GE Healthcare
Excel Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
  3. Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
  4. Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
  5. Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
  6. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
  7. Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
  8. Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).
  9. Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
  10. Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  11. Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
  12. Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
  13. Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  14. Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).
  15. Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
  16. McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
  17. Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
  18. Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
  19. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  20. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  21. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  22. Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
  23. Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).

Tags

Биохимия выпуск 126 Escherichia coli рибонуклеиновой кислоты некодирующих РНК РНК очистки транспортная РНК зарядки уровень aminoacylation количественного определения РНК Северная помарка.
Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., … More

Stenum, T. S., Sørensen, M. A., Svenningsen, S. L. Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56212, doi:10.3791/56212 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter