Summary

Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Published: May 01, 2018
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Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +– ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

Abstract

Die Produktion von ATP durch Oxidative Phosphorylierung ist die primäre Funktion der Mitochondrien. Mitochondrien in den höheren Eukaryotes auch an cytosolischen Ca2 + Pufferung und die ATP-Produktion in Mitochondrien kann durch intramitochondrial frei Ca2 + Konzentration vermittelt werden. Ca2 + Rückhaltevermögen kann als die Fähigkeit der Mitochondrien, Kalzium in der mitochondrialen Matrix zu behalten. Kumulierte intrazellulären Ca2 + führt zu der Durchlässigkeit der inneren mitochondrialen Membran bezeichnet die Öffnung des mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), was dazu führt, das Austreten von Molekülen mit einer molekularen Gewicht weniger als 1,5 kDa. Ca2 +-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Hier beschreiben wir zwei Tests untersuchen die Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien ausgelöst. Nach bestimmten Mengen von Ca2 + werden hinzugefügt, können alle Schritte innerhalb eines Tages abgeschlossen und von einer Mikrotestplatte Leser aufgenommen. Somit können diese zwei einfachen und effektiven Assays ergriffen werden, um die Ca2 +bewerten-mitochondriale Funktionen.

Introduction

Mitochondrien sind die zellulären Hauptorgane, fast 95 % der verwendeten in den Säugetier-Zellen durch Oxidative Phosphorylierung ATP zu produzieren. Es wird berichtet, dass die abgesonderten mikromolaren Konzentration von Ca2 + von Mitochondrien, die Anwesenheit von ADP und anorganischem Phosphat ADP zu ATP-Synthese1phosphorylieren verwendet werden können. Wenn die Konzentration der cytosolischen Ca2 + einen Schwellenwert überschreitet, Mitochondrien können Aufnahme Ca2 + schnell und Ausfluss es langsam. So können die funktionierenden Mitochondrien Zustrom der erhöhten cytosolischen Ca2 +. Irrelevant für die Teilnahme an der Oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Ca2 + auch an der cytosolischen kalziumsignale teilnehmen und aktivieren den mitochondrialen Apoptose-Mechanismus durch Induktion die Eröffnung der mPTP in der inneren mitochondrialen Membran-2. Es wurde allgemein anerkannt, dass abnorme Erhöhung der intrazellulären Ca2 + mitochondriale massive Schwellung hervorrufen kann, durch die Eröffnung der mPTP-3. So, dieses Protokoll zielt darauf ab, die Funktion der Mitochondrien zu bewerten, indem Sie die Quantifizierung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-trigged mitochondriale Schwellung.

Ca2 + Rückhaltevermögen ist das Maß für die Fähigkeit der Mitochondrien zur Aufnahme zytosolischen Kalzium. Mitochondrien können Puffer freie zytosolischen Kalzium und Kalzium-abhängigen zellulären Prozesse zu regulieren, indem Calciumaufnahme in Form von inaktiven Ausscheidungen. Beeinträchtigt Ca2 + Rückhaltevermögen tritt in Stress-Erscheinungen, die mit Energie-Begrenzung und auch Neurodegenerative Krankheiten4,5. Isolierte Mitochondrien oder Digitonin-permeabilized Zellen eingesetzt werden, um die Ca2 + Rückhaltevermögen zu identifizieren, und die erhöhte Fähigkeit zu akkumulieren Ca2 + durch isolierte Mitochondrien mit dem Additonal Glutamat und Malat erfolgt nicht durch die Mitochondriale Isolierung Verfahren6. Eine betitelten Menge an Digitonin sollte verwendet werden, um die Plasmamembranen von verschiedenen Zelltypen permeabilize. Das Hexapotassium Salz der Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, Ca2 +-sensible Zelle-impermeant Licht-erregbare Sichtanzeige, wurde weit verbreiteten7. Ca2 +-Bindung grün fluoreszierenden Farbstoff ist ein Low-Affinität-Indikator und verwendet, um anzuzeigen, dass intrazelluläre freie Ca2 + Konzentrationen im steigen weiter (5 min) Stimulationen8verlängert. Diese Methode war weniger empfindlich als die radioaktive Filtertechnik aber wesentlich vereinfacht. Das zusätzliche Ca2 + Kalzium grüne Fluoreszenz erhebt und die Ca2 + Aufnahme von Mitochondrien kehrt die Fluoreszenz Baseline. Fortlaufende Ergänzungen von Ca2 + wurden vorgenommen, bis die Mitochondrien zur Aufnahme Extramitochondrial Ca2 + 9nicht. Ein Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser lässt sich regelmäßig Kalzium grüne Fluoreszenz Berichten.

Nach Ca2 + Akkumulation Mitochondrien depolarisiert, Ca2 + in das Medium abgegeben und begann anzuschwellen. Ca2 +-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Elektronenmikroskopie und die Abnahme der leichten Extinktion bei 540 nm kann verwendet werden, um die Ca2 +Messen-mitochondriale Schwellung10,11ausgelöst. Mitochondrien Volumen kann direkt durch nach vorne Winkel Lichtstreuung12, ermittelt werden, wo sinkt in die Extinktion passive Schwellung der mitochondrialen Matrix widerspiegeln.

Hier zeigen wir die Methodik zur Prüfung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y Zellen ausgelöst.

Protocol

1. Isolation von Mitochondrien Hinweis: Alle Lösungen und Geräte sollten auf 0 – 4 ° C vorgekühlt und auf Eis gehalten werden. Samen etwa 3 x 106 SH-SY5Y Zellen pro 10 cm Zelle Kulturschale. Zellkulturen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin (100 U/mL)-Streptomycin (100 µg/mL). Bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2 über Nacht behalten.Hinweis: mindestens 1-2 x 107 SH-SY5Y Zellen f?…

Representative Results

Ca2 + Rückhaltevermögen Vertreter folgendes Ergebnis:Die Ergebnisse wurden als Fluoreszenz-Werte. Mit der zusätzlichen Impulsen von Ca2 + (200 Nmols/mg mitochondrialen Proteins), die Fluoreszenz durch doppelte über dem Ausgangswert mit der Eröffnung von mPTP erhöht. 5 μM Bongkrekate (BKA), ein Inhibitor von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung oder 1 μM Atractyloside (ATR), Aktivator von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung, wurden in d…

Discussion

Wir beschrieben hier, ein einfaches und effektives Protokoll für die mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst.

Stellen Sie für die mitochondriale Isolierung sicher, dass alle Materialien und Rohre auf Eis, besonders wenn die Zellen zu homogenisieren. 0,25 % Trypsin-EDTA kann auch verwendet werden, um Zellen aus der Schale für 5 min bei 37 ° c zu lösen Nach 15-25 Schlägen ist es notwendig, die intakte Zellme…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse von Grant der herausragende Wissenschaftler von Shandong (JQ201421) und Zuschuss von NSFC (81371226).

Materials

SH-SY5Y cell line ATCC (The Global Bioresource Center) ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N Life Technologies c-3737 Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors Roche Molecular Biochemicals 4693116001
glass homogenizer Kimble Chase 9885303002
glutamate Sigma-Aldrich RES5063G-A7
malate Sigma-Aldrich 46940-U
rotenone Sigma-Aldrich R8875
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MgCl2 Sigma-Aldrich 00457
K2HPO4 Sigma-Aldrich V900050
KCl Sigma-Aldrich P9541
CaCl2 Sigma-Aldrich V900266
Varioskan flash instruments Thermo Scientific IC100E
Bongkrekate Biovision 1820-100
atractyloside Sigma-Aldrich C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium Hyclone SH30022 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum Hyclone SV30087
penicillin Sigma-Aldrich P3032
streptomycin Invitrogen 11860-038
BCA assay kit Thermo Scientific NCI3225CH
PBS Hyclone SH30256.01
10 cm cell culture dish NEST 704001

References

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Cite This Article
Li, W., Zhang, C., Sun, X. Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay. J. Vis. Exp. (135), e56236, doi:10.3791/56236 (2018).

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