Denne protokol har til formål at beskrive en metode til at undersøge Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +– udløst mitokondrier hævelse af isolerede mitochondrier af SH-SY5Y celler trin for trin.
Produktionen af ATP ved oxidativ fosforylering er den primære funktion af mitokondrier. Mitokondrier i højere eukaryoter også deltage i cytosole Ca2 + buffer, og ATP produktion i mitokondrie kan være medieret af intramitochondrial gratis Ca2 + koncentration. Ca2 + fastholdelse kapacitet kan betragtes som mitokondrier evne til at bevare calcium i mitokondriets matrix. Akkumulerede intracellulære Ca2 + fører til permeabilitet af den indre mitokondrielle membran kaldes åbningen af mitokondrie permeabilitet overgangen pore (mPTP), hvilket fører til lækage af molekyler med en Molekylær vægt mindre end 1,5 kDa. Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse bruges til at angive mPTP åbning. Her beskriver vi to assays for at undersøge Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse i isolerede mitochondrier. Efter visse mængder af Ca2 + er tilføjet, kan alle trin udfyldes på én dag og indspillet af en mikrotiterplade læser. Således, disse to enkle og effektive assays kan vedtages for at vurdere Ca2 +-relaterede mitokondriets funktioner.
Mitokondrier er de vigtigste cellulære organer til at producere næsten 95% af ATP anvendes i de pattedyrceller ved oxidativ fosforylering. Det forlyder, at den afsondret micromolar koncentration af Ca2 + af mitokondrier, tilstedeværelse af ADP og uorganisk fosfat kan bruges til at phosphorylate ADP at syntese ATP1. Når koncentrationen af cytosole Ca2 + går over en tærskel, mitokondrier kan optagelsen Ca2 + hurtigt og efflux det langsomt. Således, de fungerende mitokondrier kan tilstrømning af øget cytosole Ca2 +. Irrelevant for deltagelse i oxidativ fosforylering, den mitokondrielle Ca2 + også tage del i de cytosole calciumsignaler og aktivere mitokondriets apoptotiske mekanisme ved at inducere åbningen af mPTP i den indre mitokondrielle membran2. Det har været almindeligt anerkendt, at unormale udvidelse af intracellulære Ca2 + kan fremkalde mitokondrie massive hævelse ved at åbne mPTP3. Således, denne protokol har til formål at vurdere den mitokondrielle funktion af kvantificere mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-trigget mitokondrier hævelse.
Ca2 + fastholdelse kapacitet er måling af mitokondrier evne til optagelse cytosole calcium. Mitokondrier kan buffer cytosole gratis calcium og regulere calcium-afhængige cellulære processer af calcium optagelse i form af inaktive bundfald. Nedsat Ca2 + fastholdelse kapacitet opstår i stress fænomener forbundet med energi begrænsning og endda neurodegenerative sygdomme4,5. Isolerede mitochondrier eller digitonin-permeabilized celler kan bruges til at identificere Ca2 + fastholdelse kapacitet, og den forhøjede evne til at akkumulere Ca2 + af isolerede mitochondrier med yderligere glutamat og malat ikke er foretaget af den mitokondrie isolation procedure6. En titreret mængden af digitonin bør anvendes til at permeabilize plasma membraner i forskellige celletyper. Hexapotassium salt af Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof, en Ca2 +-følsomme celle-impermeant synligt lys-overgearet indikator, har været udbredte7. Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof er en indikator for lav-affinitet og bruges til at vise, at intracellulære gratis Ca2 + koncentrationer fortsætter med at stige i løbet af langvarig (5 min) stimulering8. Denne metode var mindre følsomme end radioaktive filter teknik, men var stærkt forenklet. Den yderligere Ca2 + hæver calcium grønne fluorescens og Ca2 + optagelse af mitokondrier returnerer fluorescens grundlinjen. Sekventiel tilføjelser af Ca2 + blev foretaget indtil mitokondrier undladt at optagelsen extramitochondrial Ca2 + 9. En fluorescens mikrotiterplade læser kan bruges til løbende rapportere calcium grønne fluorescens.
Efter Ca2 + akkumulering, mitokondrier depolariseret, udgivet Ca2 + til mediet, og begyndte at svulme. Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse bruges til at angive mPTP åbning. Elektronmikroskopi og faldet i lys absorbans ved 540 nm kan bruges til at måle Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse10,11. Mitokondrier volumen kan bestemmes direkte ved fremadrettet vinkel lysspredning12, hvor falder i absorbansen afspejler passiv hævelse af den mitokondriets matrix.
Her viser vi metoden for at undersøge den mitokondrielle Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse i isolerede mitochondrier fra SH-SY5Y celler.
Her, vi beskrevet en enkel og effektiv protokol til mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet analysen og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse assay.
Til mitokondrie isolering, Sørg for at alle materialer og rør er på isen, især når homogenisering cellerne. 0,25% trypsin-EDTA kan også bruges til at løsne celler fra fad i 5 min ved 37 ° C. Efter 15-25 slag er det nødvendigt at observere intakt cellemembranen under mikroskop og undgå brud af mitokondrier membran. Me…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra grant af fremragende videnskabsmand af Shandong (JQ201421) og tilskud fra NSFC (81371226).
SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |