Denne protokollen skal beskriver en metode for å undersøke Ca2 + varmekapasitet og Ca2 +– utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier av SH-SY5Y celler trinnvis.
Produksjon av ATP ved oxidative fosforylering er den primære funksjonen av mitokondrier. Mitokondrier i høyere eukaryoter også delta i cytosolic Ca2 + bufring og ATP produksjonen i mitokondrie kan være formidlet av intramitochondrial gratis Ca2 + konsentrasjon. Ca2 + oppbevaring kapasitet kan betraktes som evnen til mitokondrier beholde kalsium i mitokondrie matrisen. Akkumulert intracellulær Ca2 + fører til permeabilitet av interne mitokondrie membran, kalt åpningen av mitokondrie permeabiliteten overgangen pore (mPTP), noe som fører til lekkasje av molekyler med en molekylær vekt mindre enn 1,5 kDa. Ca2 +-utløst mitokondrier hevelse brukes til å angi mPTP åpningen. Her beskriver vi to analyser for å undersøke Ca2 + varmekapasitet og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier. Etter visse mengder av Ca2 + er lagt, kan alle trinnene fullført i en dag og registrert av en microplate-leser. Dermed disse to enkle og effektive analyser kan bli vedtatt for å vurdere Ca2 +-relaterte mitokondrie funksjoner.
Mitokondrier er de viktigste cellulære organene å produsere nesten 95% av ATP brukes i pattedyrceller av oxidative fosforylering. Det er rapportert at sequestered micromolar konsentrasjonen av Ca2 + av mitokondrier, ADP, og uorganiske fosfat kan brukes til å phosphorylate ADP syntese ATP1. Når konsentrasjonen av cytosolic Ca2 + går over en viss grense, mitokondrier kan uptake Ca2 + raskt og middelklasseinnbyggere det sakte. Dermed kan fungerende mitokondrier tilstrømningen av økt cytosolic Ca2 +. Irrelevant for deltakelse i oxidative fosforylering, den mitokondrie Ca2 + også ta del i cytosolic kalsium signaler og aktivere mitokondrie apoptotisk mekanismen av inducing åpningen av mPTP i indre mitokondrie membran2. Det har vært anerkjent at unormal rettighetsutvidelse intracellulær Ca2 + kan indusere mitokondrie massiv hevelse ved å åpne mPTP3. Derfor denne protokollen skal vurdere funksjonen mitokondrie av kvantifisere mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet og Ca2 +-trigged mitokondrie hevelse.
Ca2 + oppbevaring kapasitet er måling av evnen til mitokondrier til opptak cytosolic kalsium. Mitokondrier kan bufre cytosolic gratis kalsium og regulere kalsium-avhengige mobilnettet prosesser av kalsium opptak i form av inaktive precipitates. Nedsatt Ca2 + varmekapasitet oppstår i stress fenomener forbundet med energi begrensning og selv nevrodegenerative sykdommer4,5. Isolert mitokondrier eller digitonin-permeabilized celler kan brukes til å identifisere Ca2 + oppbevaring kapasitet og forhøyet muligheten til å samle Ca2 + av isolerte mitokondrier med ytterligere glutamat og malate påvirkes ikke av de Mitokondrielt isolasjon prosedyren6. En titrerte mengde digitonin skal brukes til å permeabilize plasma membraner av forskjellige celletyper. Hexapotassium salt av Ca2 +-bindende grønne fluorescerende farge, en Ca2 +-sensitive celle-impermeant synlig lys-nervøs indikator, har vært mye brukt7. Ca2 +-bindende grønn fluorescerende fargestoff er en lav-affinitet indikator og brukes til å vise at intracellulær gratis Ca2 + konsentrasjoner fortsetter å stige under langvarig (5 min) stimulations8. Denne metoden ble mindre sensitive enn radioaktivt filter teknikken, men ble sterkt forenklet. Den ekstra Ca2 + løfter kalsium grønne fluorescens og Ca2 + opptaket av mitokondrier returnerer fluorescensen som opprinnelig plan. Sekvensielle filer av Ca2 + ble gjort til mitokondrier kunne opptak extramitochondrial Ca2 + 9. En fluorescens microplate leser kan brukes kontinuerlig rapportere kalsium grønne fluorescens.
Etter Ca2 + opphopning, mitokondrier depolarized, utgitt Ca2 + til medium, og begynte å svelle. Ca2 +-utløst mitokondrier hevelse brukes til å angi mPTP åpningen. Elektronmikroskop og nedgangen i lys absorbans ved 540 nm kan brukes til å måle Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse10,11. Mitokondrier volum kan direkte bestemmes av fremover vinkel lysspredning12, der nedgang i absorbansen gjenspeiler passiv hevelse i mitokondrie matrix.
Her vi illustrere metodikk for å undersøke mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier fra SH-SY5Y celler.
Her vi beskrev en enkel og effektiv protokoll for mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet analysen og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse analysen.
For mitokondrie isolasjon, sikre at alle materialer og rør er på is, spesielt når homogenisere cellene. 0.25% trypsin-EDTA kan også brukes til å koble celler fra parabolen for 5 min på 37 ° C. Etter 15-25 slag er det nødvendig å observere intakt cellemembranen under mikroskopet og unngå brudd på mitokondrier membranen…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra grant fremragende vitenskapsmann Shandong (JQ201421) og støtte fra NSFC (81371226).
SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |