Summary

Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת Assay ו- Ca2 +-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

Published: May 01, 2018
doi:

Summary

פרוטוקול זה שואפת לתאר שיטה לבחון על Ca2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca – עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות של המיטוכונדריה מבודד של SH-SY5Y תאים צעד אחר צעד.

Abstract

הפקת ATP על ידי זרחון חמצוני הוא התפקיד העיקרי של המיטוכונדריה. במיטוכונדריה פרוקריוטים גבוה יותר גם להשתתף cytosolic Ca2 + אגירה, ייצור ATP ב מיטוכונדריאלי יכול להיות מתווכת על-ידי intramitochondrial חינם Ca2 + ריכוז. Ca2 + שמירה קיבולת יכול היה להיחשב ליכולת של המיטוכונדריה לשמור על הסידן המטריצה מיטוכונדריאלי. שהצטברו תאיים Ca2 + מוביל החדירות של קרום מיטוכונדריאלי הפנימי, כינה את הפתיחה של חדירות מיטוכונדריאלי המעבר נקבובית (mPTP), כשבסופו לדליפת של מולקולות עם מולקולרית משקל kDa פחות מ- 1.5. Ca2 +-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. כאן, אנו מתארים שני מבחני לבחון על Ca2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד. לאחר כמויות מסוימות של Ca2 + מתווספים, כל השלבים ניתן יהיה להשלים ביום אחד, שהוקלט על ידי קורא microplate. לפיכך, מבחני שני אלה פשוט ויעיל ניתן לאמץ להעריך Ca2 +-הקשורים פונקציות מיטוכונדריאלי.

Introduction

המיטוכונדריה הם האיברים הסלולר העיקרי לייצר כמעט 95% מ- ATP המשמש בתאים בתרבית של זרחון חמצוני. הוא דיווח כי הריכוז micromolar מוחרמת של Ca2 + על ידי המיטוכונדריה, הנוכחות של ADP, פוספט אורגניים ניתן להשתמש כדי phosphorylate ADP סינתזת ATP1. כאשר הריכוז של Ca cytosolic2 + עובר מעל לסף מסוים, המיטוכונדריה יכול ספיגת Ca2 + במהירות, בזרימת אותו לאט לאט. לפיכך, המיטוכונדריה מתפקדת יכול זרם מוגברת cytosolic Ca2 +. לא רלוונטי-ההשתתפות זרחון חמצוני, מיטוכונדריאלי Ca2 + גם לקחת חלק אותות cytosolic סידן ו להפעיל את מנגנון מיטוכונדריאלי אפופטוטיים להיפגע על ידי גרימת הפתח של mPTP הפנימי מיטוכונדריאלי ממברנה2. זה הוכרה נרחב חריג על ידי העלאת Ca תאיים2 + יכול לגרום נפיחות מסיבית מיטוכונדריאלי על-ידי פתיחת mPTP3. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הפונקציה מיטוכונדריאלי מאת לכימות על Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת ו Ca2 +-trigged מיטוכונדריאלי נפיחות.

Ca2 + שמירה התפוסה היא מידת היכולת של המיטוכונדריה ספיגת הסידן cytosolic. המיטוכונדריה ניתן מאגר הסידן חינם cytosolic, לווסת סידן תלוית תהליכים תאיים על ידי ספיגת הסידן בצורה של פוחת משקעים לא פעיל. Ca לקוי2 + שמירה קיבולת מתרחשת מתח תופעות הקשורות באנרגיה הגבלה,4,של מחלות ניווניות אפילו5. המיטוכונדריה מבודד או תאים digitonin permeabilized יכול לשמש כדי לזהות את Ca2 + השמירה קיבולת, ואת היכולת מוגברות לצבור Ca2 + על ידי המיטוכונדריה מבודד עם נוספים גלוטמט, בנויים לא מושפע על ידי בידוד מיטוכונדריאלי נוהל6. כמות titrated של digitonin צריך לשמש permeabilize של ממברנות פלזמה של סוגי תאים שונים. Hexapotassium מלח Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט, Ca2 +-אינדיקטור רגיש תא-impermeant אור-טמפרמנט גלוי, היה בשימוש נרחב7. Ca2 +-איגוד ירוק הפלורסנט מחוון נמוך-זיקה ולא להשתמש בו כדי להראות כי תאיים חינם Ca2 + ריכוזים ימשיכו לעלות במהלך ממושך (5 דקות) stimulations8. שיטה זו היה פחות רגיש יותר הטכניקה מסנן רדיואקטיבי, אולם היה לפשוט מאוד. נוספים Ca2 + מעלה סידן ירוק פלורסצנטיות, Ca2 + תפיסה על ידי המיטוכונדריה ומחזירה את קרינה פלואורסצנטית בסיסית. תוספות רציפים של Ca2 + נעשו עד המיטוכונדריה נכשלה ספיגת extramitochondrial Ca2 + 9. קורא microplate קרינה פלואורסצנטית ניתן לדווח באופן רציף על ידי קרינה פלואורסצנטית סידן ירוק.

לאחר צבירת2 + Ca, המיטוכונדריה depolarized שוחרר Ca2 + לתוך המדיום, החלה להתנפח. Ca2 +-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. מיקרוסקופ אלקטרוני ו של הפחתת ספיגת האור-540 nm יכול לשמש כדי למדוד את Ca2 +-עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות10,11. המיטוכונדריה נפח יכול להיקבע באופן ישיר על ידי קדימה זווית פיזור אור12, איפה ירידות ספיגת לשקף פסיבית נפיחות של המטריקס מיטוכונדריאלי.

כאן, אנחנו להמחיש את המתודולוגיה לבחון על Ca מיטוכונדריאלי2 + שמירה קיבולת ו2 +Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מתאי SH-SY5Y.

Protocol

1. בידוד של המיטוכונדריה הערה: כל פתרונות וציוד צריך להיות precooled 0 – 4 מעלות צלזיוס, נשמרים על קרח. זרעי בערך 3 x 106 SH-SY5Y תאים לכל מאכל תרבות תא 10 ס מ. התרבות התאים Dulbecco גבוהה-גלוקוז המתואמת של הנשר בינוני עם סרום שור עוברית 10%, פניצילין (100 U/mL)-סטרפטומיצין (100 µg/mL). לשמור על 3…

Representative Results

תוצאות נציג של Ca2 + שמירה קיבולת:התוצאות היו הביע כערכים זריחה. עם פולסים נוספת של Ca2 + (200 nmols/mg מיטוכונדריאלי חלבון), ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברת על ידי כפול מעל הבסיס עם פתיחת mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), מעכב של Ca2 +-induced mPTP הפתיחה, או atractyloside μM 1 (ATR), activator Ca2 …

Discussion

כאן, אנו המתואר פרוטוקול פשוטה ויעילה מיטוכונדריאלי Ca2 + שמירה קיבולת assay, Ca2 +-עוררה מיטוכונדריאלי assay נפיחות.

הבידוד מיטוכונדריאלי, ודא כי כל חומרי, צינורות הם על קרח, במיוחד כאשר homogenizing את התאים. 0.25% טריפסין-EDTA יכול לשמש גם כדי לנתק תאים מן המנה למשך 5 דקות ב 37 º C. לא…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מענק של מדען מצטיין של שאנדונג (JQ201421), מענק NSFC (81371226).

Materials

SH-SY5Y cell line ATCC (The Global Bioresource Center) ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N Life Technologies c-3737 Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors Roche Molecular Biochemicals 4693116001
glass homogenizer Kimble Chase 9885303002
glutamate Sigma-Aldrich RES5063G-A7
malate Sigma-Aldrich 46940-U
rotenone Sigma-Aldrich R8875
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MgCl2 Sigma-Aldrich 00457
K2HPO4 Sigma-Aldrich V900050
KCl Sigma-Aldrich P9541
CaCl2 Sigma-Aldrich V900266
Varioskan flash instruments Thermo Scientific IC100E
Bongkrekate Biovision 1820-100
atractyloside Sigma-Aldrich C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium Hyclone SH30022 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum Hyclone SV30087
penicillin Sigma-Aldrich P3032
streptomycin Invitrogen 11860-038
BCA assay kit Thermo Scientific NCI3225CH
PBS Hyclone SH30256.01
10 cm cell culture dish NEST 704001

References

  1. Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
  2. Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
  3. Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
  4. Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
  5. Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
  6. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  7. Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
  8. Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
  9. Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
  10. Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
  11. Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
  12. Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
  13. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
  14. Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
  15. Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
  16. Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).

Play Video

Cite This Article
Li, W., Zhang, C., Sun, X. Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay. J. Vis. Exp. (135), e56236, doi:10.3791/56236 (2018).

View Video