Summary
Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.
Abstract
La produzione di ATP da fosforilazione ossidativa è la funzione primaria dei mitocondri. I mitocondri negli eucarioti superiori partecipano anche Ca citosolico2 + buffer, e la produzione di ATP in mitocondriale può essere mediata da intramitochondrial Ca2 + concentrazione libera. Capacità di ritenzione di CA2 + può essere considerata come la capacità dei mitocondri di trattenere calcio nella matrice mitocondriale. Accumulato intracellulare Ca2 + conduce alla permeabilità della membrana mitocondriale interna, definito l'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), che conduce alla perdita di molecole con un molecolare peso meno di 1,5 kDa. CA2 +-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. Qui, descriviamo due saggi per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati. Dopo determinate quantità di Ca2 + vengono aggiunti, tutti i passaggi possono essere completati in un giorno e registrati da un lettore di micropiastre. Così, queste due analisi semplice ed efficace possono essere adottate per valutare il Ca2 +-relative funzioni mitocondriali.
Introduction
I mitocondri sono i principali organi cellulari per produrre quasi il 95% del trifosfato di adenosina usato nelle cellule dei mammiferi di fosforilazione ossidativa. È stato riferito che la concentrazione micromolar sequestrata di Ca2 + dai mitocondri, la presenza di ADP e fosfato inorganico può essere utilizzato per fosforilare ADP a sintesi ATP1. Quando la concentrazione di Ca citosolico2 + supera una soglia, i mitocondri possono l'assorbimento di Ca2 + rapidamente e di efflusso e lentamente. Così, i mitocondri di funzionamento possono afflusso l'aumento citosolico Ca2 +. Irrilevante per la partecipazione nella fosforilazione ossidativa, il mitocondriale Ca2 + anche partecipare i segnali di calcio citosolico e attivare il meccanismo apoptotico mitocondriale inducendo l'apertura della mPTP nella parte interna mitocondriale membrana2. È stato ampiamente riconosciuto che l'elevazione anormale del intracellulare di Ca2 + può indurre mitocondriale gonfiamento voluminoso aprendo il mPTP3. Così, questo protocollo ha lo scopo di valutare la funzione mitocondriale di quantificare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale.
Capacità di ritenzione di CA2 + è la misura della capacità dei mitocondri di calcio citosolico di assorbimento. I mitocondri possono buffer il calcio libero citosolico e regolano i processi cellulari di calcio-dipendente dall'assorbimento di calcio sotto forma di precipitati inattivi. Capacità di ritenzione alterata Ca2 + si verifica nei fenomeni di stress associati a limitazione di energia e anche neurodegenerative malattie4,5. Mitocondri isolati o cellule della digitonina-permeabilized possono essere utilizzate per identificare la capacità di ritenzione di Ca2 + , e l'elevata capacità di accumulare Ca2 + di mitocondri isolati con il glutammato additonal e malate non avviene mediante il isolamento mitocondriale procedura6. Una quantità di Estratto titolata di digitonina deve essere utilizzata per permeabilize le membrane del plasma di diversi tipi di cellule. Il sale di hexapotassium di Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde, Ca2 +-indicatore luce-eccitabile visibile cellula-impermeant sensibile, è stato ampiamente usato7. CA2 +-associazione verde colorante fluorescente è un indicatore di bassa affinità e utilizzati per dimostrare che intracellulare Ca2 + le concentrazioni libere di continuare ad aumentare durante prolungato di stimolazioni (5 min)8. Questo metodo era meno sensibile che la tecnica di filtro radioattivo, ma è stato notevolmente semplificato. Ulteriori Ca2 + eleva fluorescenza verde di calcio e l'assorbimento di Ca2 + dai mitocondri ritorna la fluorescenza ai valori basali. Fino a quando i mitocondri non è riuscito a assorbimento extramitochondrial Ca2 + 9, sono state fatte aggiunte sequenziale di Ca2 + . Un lettore di micropiastre di fluorescenza può essere utilizzato per segnalare continuamente la fluorescenza verde di calcio.
Dopo Ca2 + accumulo, mitocondri depolarizzarono, scaricata Ca2 + nel terreno e ha cominciato a gonfiarsi. CA2 +-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. La microscopia elettronica e la diminuzione di luce assorbanza a 540 nm può essere usato per misurare il Ca2 +-innescato mitocondriale gonfiore10,11. Volume di mitocondri può essere determinata direttamente da angolo in avanti dispersione della luce12, dove diminuisce di assorbanza riflettono passiva gonfiore della matrice mitocondriale.
Qui, vi illustriamo la metodologia per esaminare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y.
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Protocol
1. isolamento dei mitocondri
Nota: Tutte le soluzioni e apparecchiature dovrebbe essere preraffreddate a 0 - 4 ° C e tenute su ghiaccio.
- Seme circa 3 x 106 SH-SY5Y cellule per piastra di coltura delle cellule di 10 cm. Cellule di cultura in alto-glucosio Dulbecco s modified medium di Eagle con 10% siero bovino fetale, penicillina (100 U/mL)-streptomicina (100 µ g/mL). Mantenere a 37 ° C in un incubatore contenente 5% CO2 durante la notte.
Nota: almeno 1-2 x 107 SH-SY5Y cellule sono necessari per ciascun test di isolamento. - Rimuovere il supporto e lavare le cellule con circa 1 mL di PBS freddo di ghiaccio in una piastra di coltura cellulare di 10cm 3 volte.
- Aggiungere nuovo 1 mL di PBS freddo ghiaccio nella piastra di coltura cellulare di 10cm e raschiare le celle aderenti in una nuova provetta da 1,5 mL. Centrifuga a 800 x g per 10 min a 4 ° C.
- Durante la centrifugazione, preparare il tampone di isolamento mitocondriale di 5 mL (250 mM saccarosio, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina ethanesulfonic acido), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) completato con 50 µ l di brodo di inibitori di proteasi soluzione (una concentrazione di 100 x; 1 compressa EDTA-libero dissolto in 500 µ l di ddH2O).
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 1 mL di tampone di isolamento mitocondriale. Incubare la provetta da 1,5 mL in ghiaccio per 30 min.
- Lisare le cellule sospese con un omogeneizzatore di vetro (15-25 colpi) su e giù manualmente sul ghiaccio.
Nota: Assicurarsi che non ci sono bolle quando le cellule sono omogeneizzate. Contare le cellule intatte e nuclei scoperti da microscopio visivamente e confermare che > rottura cellulare 90% si è verificato. - Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C per rimuovere i detriti (nuclei e restanti cellule intatte).
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 min 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 14.000 x g per 15 min 4 ° C.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet contenente i mitocondri con 1 mL di tampone di isolamento mitocondriale.
- Centrifugare la soluzione per 15 min a 4 ° C di 14.000 x g per precipitare i mitocondri.
- Il pellet di mitocondri risultante deve essere tenuto sul ghiaccio e risospesi in 50-100 media KCl μL (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1mm MgCl2, 20mm HEPES, 5mm glutammato, malate di 5 mM e 2 rotenone μM, pH 7.4) secondo il volume di pellet prima qualsiasi culo Ay.
- Utilizzare 5 μL di soluzione di mitocondriale per misurare la concentrazione di proteina mitocondriale di test standard di BCA, OD562 di misura utilizzando un lettore di piastra13.
2. la determinazione della capacità di ritenzione di mitocondriale di Ca2 +
- Preparare il supporto di KCl e aggiungere il Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde a una concentrazione finale di 0,5 μM prima dell'esperimento.
- Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in media di KCl che contengono 0,5 μM Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde in ogni piastra a 6 pozzetti bene.
- Incubare i mitocondri e il Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde nel piatto 6 pozzetti a temperatura ambiente al riparo dalla luce ambiente per 1 min. aggiungere 4 aliquote del μL di un soluzione di CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 da 20 mM 20 mM HEPES, 5mm glutammato, malate di 5 mM, pH 7.4) per ogni piastra a 6 pozzetti pozzetto usando l'automatico dispensa impostazione di introdurre 200 nmol proteina mitocondriale di Ca2 +/mg.
- Utilizzare uno spettrometro di fluorescenza per monitorare i cambiamenti di fluorescenza ogni 3 s per 2 min con una lunghezza d'onda di eccitazione di 506 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 531 nm. La piastra è dotata di agitazione a 600 rpm per 3 s tra letture controllato dal software (Figura 1).
- Aggiungere un'aliquota di ulteriori 4 μL di soluzione di 20 mM CaCl2 in ciascun pozzetto e monitorare i cambiamenti di fluorescenza ogni 3 s per 2 min. Ripetere questo passaggio finché la fluorescenza aumenta con il tempo.
Nota: I mitocondri sono sfidati con l'aggiunto Ca2 + indicato dalla registrazione maggiore fluorescenza. Quando si apre il mPTP, la fluorescenza aumenta con il tempo. - Interpretare la quantità totale di Ca2 + aggiunte fino a quando il mPTP apre come la capacità di ritenzione di Ca2 + .
3. determinazione del Ca 2 +-indotto gonfiamento mitocondriale
- Preparare il supporto di KCl prima dell'esperimento.
- Trasferire 1 mL di mitocondri isolati (0,4 mg/mL) in media di KCl in ogni piastra a 6 pozzetti bene.
- Aggiungere 10 μL di 20 mM CaCl2 soluzione acquosa (500 nmol/mg di proteina mitocondriale) nella proteina mitocondriale di innescare gonfiamento mitocondriale.
- Registrare la diminuzione di assorbanza a 540 nm ogni 3 s su un lettore di micropiastre controllato dal software per 10 min (Figura 2). Le modifiche di fluorescenza sono causate da un afflusso di soluti attraverso la membrana mitocondriale interna.
Nota: La diminuzione assorbanza a 540 nm corrisponde ai mitocondri gonfiati. Se il lettore non ha rispettato una diminuzione di assorbanza, un più lungo intervallo di lettura o di tempo di lettura può essere adottato.
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Representative Results
Rappresentante risultati di Ca2 + capacità di ritenzione:
Risultati sono stati espressi come valori di fluorescenza. Con gli ulteriori impulsi del Ca2 + (200 proteina mitocondriale nmols/mg), la fluorescenza aumentata del doppio di sopra della linea di base con l'apertura di mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inibitore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, o 1 μM atractyloside (ATR), un attivatore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, sono stati aggiunti in mitocondri isolati. L'importo del totale aggiunto Ca2 + fino a mPTP apertura indicato tramite un aumento doppio sopra la fluorescenza di base è stata interpretata come capacità di ritenzione di Ca2 + . I nostri dati hanno mostrato che la mitocondriale Ca2 + capacità di ritenzione in trattamento BKA era molto superiore a quella nel gruppo di ATR. Questi dati hanno confermato la misura adatta del mitocondriale Ca2 + capacità di ritenzione (Figura 3).
Risultati di rappresentante di Ca2 +-indotto gonfiamento mitocondriale:
I risultati sono stati espressi come variazioni percentuali di assorbanza a 540 nm contro assorbanza iniziale durante un periodo di 10 min dopo l'aggiunta di CaCl2. Attivato tramite l'aggiunta di Ca2 + (500 proteina mitocondriale nmol/mg), la capacità di assorbimento in diminuzione monitorati a 540 nm indicato i rigonfiamenti mitocondriali. Con il trattamento della BKA o ATR, la curva di taratura ha mostrato una lieve o forte diminuzione rispetto all'assorbanza iniziale, che indica che il BKA può inibire mPTP apertura mentre ATR può facilitare il mPTP apertura (Figura 4).
Figura 1: le impostazioni del software per mitocondriale Ca2 + ritenzione analisi capacità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: le impostazioni del software per mitocondriale Ca2 +-attivato dosaggio gonfiamento mitocondriale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La misura della capacità di ritenzione di Ca2 + . Extra-mitocondriali Ca2 + in mitocondri isolati è stata misurata fluorometrically con il Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde in presenza di bongkrekate di 5 μM (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) o controllo in bianco (CON). Tracce di Ca2 + ritenzione di mitocondri isolati con BKA, ATR e CON sono state misurate a 506 nm (Ex) e 531 nm (Em) su un lettore di micropiastre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La misura di Ca2 +-indotto gonfiamento mitocondriale. CA2 +-gonfiamento mitocondriale indotta di SH-SY5Y in presenza di 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) o controllo in bianco (CON) è stato espresso come una curva di calibrazione in diminuzione percentuale dell'iniziale assorbanza a 540 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice ed efficace per il mitocondriale Ca2 + ritenzione capacità dosaggio e Ca2 +-attivato dosaggio gonfiamento mitocondriale.
Per l'isolamento mitocondriale, assicurarsi che tutti i materiali e i tubi sono sul ghiaccio, soprattutto quando le cellule di omogeneizzazione. 0,25% tripsina-EDTA può essere utilizzato anche per staccare le cellule dal piatto per 5 min a 37 ° C. Dopo 15-25 colpi, è necessario osservare la membrana delle cellule intatta sotto il microscopio ed evitare la rottura della membrana dei mitocondri. Tuttavia, i mitocondri isolati che abbiamo ottenuto sono i mitocondri grezzi e mitocondri purificati possono essere ottenuti attraverso 1,0 M / 1,5 m gradiente discontinuo di saccarosio. Le caratteristiche biologiche dei mitocondri in cellule viventi sono più simili a quelli in vivo che in mitocondri isolati a causa delle concentrazioni dei componenti medie che circondano i mitocondri. La capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + o Ca2 +-innescata dosaggio gonfiamento mitocondriale è stata determinata in condizioni eccitate. Per la determinazione dei mitocondri funzionanti, succinato di 5 mM possa aggiungersi come substrati respiratori invece di glutammato e malate6.
CA2 +-associazione tintura fluorescente verde (lega Ca2 + con un'affinità di 4.29 ± 0,67 mM), è più adatto per misurare le concentrazioni micromolare di Ca2 + rispetto a più alta affinità coloranti ad esempio fura-2 7. Dopo l'aggiunta del Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde, l'incubazione deve essere inferiore a 240 s. aggiunte Successive di Ca2 + (che variano da 25-200 nmol) sono state iniettate ad intervalli di 1-3 min. Le curve di calibrazione mostrano le concentrazioni di Ca2 + che i mitocondri sono in grado di sequestrare, che indica l'assorbimento mitocondriale di impulsi di Ca2 +. In caso contrario, il Ca2 +-associazione verde colorante fluorescente è stato utilizzato anche nella segnalazione le indagini, quali intracellulare libero Ca2 + misura della concentrazione, seguente afflusso di Ca2 + e rilascio ed eccitazione multifotonica calcio Imaging di Ca2 + nei tessuti viventi.
Per la determinazione del Ca2 + -indotta mitocondriale gonfiore, gonfiore può anche essere indotta con l'aggiunta di 200 mM ATR e CaCl2. Come controllo, mitocondri potrebbero essere incubati con 1mm CsA per 5 minuti prima della misurazione, che ha inibito il mPTP apertura. La ricerca precedente ha mostrato curve di calibrazione dell'assorbanza in funzione della percentuale di mitocondri gonfiati14. E ' stato riferito che 1 mM CsA, 0,1 mM rosso rutenio, e un volume uguale di mitocondri freschi (0,5 mg/mL) può essere aggiunto nella reazione quando il gonfiore era completa. Perché CsA e rutenio rosso può inibire il mPTP apertura nei mitocondri appena aggiunto, le curve di calibrazione indicano sia i mitocondri gonfiati e non gonfia i mitocondri15. Il protocollo di gonfiamento mitocondriale al sovraccarico di Ca2 + è anche una misura efficace e diretta di Ca2 +-indotto mPTP apertura.
Dopo la scoperta del trasporto di Ca2 + dai mitocondri da mammiferi e altri vertebrati superiori più di 50 anni fa, c'è stato molta ricerca sui meccanismi e le funzioni di afflusso e di efflusso di calcio mitocondriale. I mitocondriale Ca2 + meccanismi di assorbimento contengono il Ca2 + uniporter mitocondriale, la modalità rapida o RaM e la rianodina recettore (mRyR)16. Le analisi che abbiamo descritto sopra può valutare Ca2 +-correlati la funzione mitocondriale, semplice ed efficace.
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Disclosures
X. sole sotto la supervisione degli esperimenti. Wei Li eseguito gli esperimenti. Chen Zhang e X. Sun ha scritto il libro.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da parte di grant della eccezionale scienziato dello Shandong (JQ201421) e grant da NSFC (81371226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
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