Summary

Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Published: May 01, 2018
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Summary

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +– desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

Abstract

A produção de ATP por fosforilação oxidativa é a principal função das mitocôndrias. Mitocôndrias em eucariontes superiores também participam citosólico Ca2 + buffer, e a produção de ATP em mitocondrial pode ser mediada por intramitocondrial grátis Ca2 + concentração. Capacidade de retenção do CA2 + pode ser considerada como a capacidade das mitocôndrias de reter cálcio na matriz mitocondrial. Ca2 + pistas intracelulares acumuladas para a permeabilidade da membrana mitocondrial interna, denominado a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), menos de 1,5 kDa de peso que leva para o escapamento de moléculas com um molecular. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Aqui, descrevemos dois ensaios para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas. Depois de certas quantidades de Ca2 + são adicionados, todos os passos podem ser concluídos em um dia e gravados por um leitor de microplacas. Assim, estes dois ensaios simples e eficazes podem ser adoptados para avaliar a Ca2 +-relacionado funções mitocondriais.

Introduction

As mitocôndrias são os principais órgãos celulares para produzir cerca de 95% do ATP usado nas células de mamíferos por fosforilação oxidativa. É relatado que o sequestrado micromolar concentração de Ca2 + pela mitocôndria, a presença de ADP e fosfato inorgânico pode ser usado para fosforilar ADP a síntese de ATP1. Quando a concentração de citosólico Ca2 + vai acima de um limite, a mitocôndria pode absorção Ca2 + rapidamente e efluxo isso lentamente. Assim, as mitocôndrias funcionamento podem influxo o aumento citosólico Ca2 +. Irrelevante para a participação na fosforilação oxidativa, o mitocondrial Ca2 + também participar os sinais de cálcio citosólico e ativar o mecanismo de apoptose mitocondrial induzindo a abertura do mPTP no interno mitocondrial membrana2. Foi amplamente reconhecido que elevação anormal de intracelular Ca2 + pode induzir edema maciça mitocondrial abrindo o mPTP3. Assim, o presente protocolo tem por objetivo avaliar a função mitocondrial através da quantificação da capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-trigged inchaço mitocondrial.

CA2 + capacidade de retenção é a medição da capacidade das mitocôndrias de cálcio citosólico de captação. As mitocôndrias podem buffer o cálcio citosólico livre e regulam processos celulares de cálcio-dependente pela absorção de cálcio na forma de precipitados inativos. Capacidade prejudicada Ca2 + retenção ocorre em fenômenos de estresse associados com limitação de energia e de4,de doenças neurodegenerativas até5. Mitocôndrias isoladas ou células digitonin-permeabilizado podem ser usadas para identificar a capacidade de Ca2 + de retenção, e a elevada capacidade de acumular Ca2 + por mitocôndrias isoladas com o glutamato additonal e malato não é efectuada pelo procedimento de isolamento mitocondrial6. Uma quantia titulada de digitonin deve ser usada para permeabilize as membranas de plasma de diferentes tipos de células. O sal de hexapotassium de Ca2 +-ligação corante fluorescente verde, uma Ca2 +-impermeant-célula visível luz-excitável indicador sensível, tem sido amplamente utilizado7. CA2 +-ligação verde tintura fluorescente é um indicador de baixa afinidade e usado para mostrar que intracelular livre Ca2 + concentrações continuarem a subir durante a prolongada de estímulos (5 min)8. Este método era menos sensível do que a técnica de filtro radioativo mas foi bastante simplificado. O adicional Ca2 + eleva a fluorescência verde do cálcio e da Ca2 + adopção pelas mitocôndrias retorna a fluorescência de base. Adições sequenciais de Ca2 + foram feitas até as mitocôndrias não conseguiram captação extramitochondrial Ca2 + 9. Um leitor de microplacas de fluorescência pode ser usado para relatar continuamente a fluorescência verde de cálcio.

Após o acúmulo de Ca2 + , mitocôndrias despolarizada, liberado Ca2 + para o meio e começaram a inchar. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Microscopia eletrônica e a diminuição da luz absorbância em 540 nm pode ser usado para medir o Ca2 +-desencadeada mitocondrial inchaço10,11. Volume de mitocôndrias pode ser diretamente determinada pelo ângulo frente espalhamento de luz12, onde diminui em absorvância reflete passivo inchaço da matriz mitocondrial.

Aqui, podemos ilustrar a metodologia para examinar a capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y de células.

Protocol

1. isolamento de mitocôndrias Nota: Todas as soluções e equipamentos devem ser pré-resfriado a 0 – 4 ° C e mantidos no gelo. Semente cerca de 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultura de células de 10 cm. Células de cultura em alta-glicose Dulbecco modificada do meio de águia com 10% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µ g/mL). Manter a 37 ° C numa incubadora contendo 5% CO2 durante a noite.Nota: pelo menos 1-2 x 10<…

Representative Results

Resultados de representante de Ca2 + capacidade de retenção:Os resultados foram expressos em valores de fluorescência. Com os pulsos adicionais de Ca2 + (proteína mitocondrial nmols/mg 200), a fluorescência aumentada o dobro acima da linha de base com a abertura do mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), um inibidor de Ca2 +-induzida mPTP abertura, ou 1 μM atractyloside (ATR), um ativador de Ca2 +-induzida mPTP abertura, foram adiciona…

Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para o mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-disparado o ensaio de inchamento mitocondrial.

Para o isolamento mitocondrial, certifique-se de que todos os materiais e os tubos são no gelo, especialmente quando homogeneizando as células. 0,25% do trypsin-EDTA também pode ser usado para destacar células do prato por 5 min a 37 ° C. Depois de 15-25 cursos, é necessário observar a membrana celular inta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi suportado por concessões do subsídio do cientista proeminente de Shandong (JQ201421) e bolsa da NSFC (81371226).

Materials

SH-SY5Y cell line ATCC (The Global Bioresource Center) ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N Life Technologies c-3737 Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors Roche Molecular Biochemicals 4693116001
glass homogenizer Kimble Chase 9885303002
glutamate Sigma-Aldrich RES5063G-A7
malate Sigma-Aldrich 46940-U
rotenone Sigma-Aldrich R8875
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MgCl2 Sigma-Aldrich 00457
K2HPO4 Sigma-Aldrich V900050
KCl Sigma-Aldrich P9541
CaCl2 Sigma-Aldrich V900266
Varioskan flash instruments Thermo Scientific IC100E
Bongkrekate Biovision 1820-100
atractyloside Sigma-Aldrich C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium Hyclone SH30022 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum Hyclone SV30087
penicillin Sigma-Aldrich P3032
streptomycin Invitrogen 11860-038
BCA assay kit Thermo Scientific NCI3225CH
PBS Hyclone SH30256.01
10 cm cell culture dish NEST 704001

References

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Cite This Article
Li, W., Zhang, C., Sun, X. Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay. J. Vis. Exp. (135), e56236, doi:10.3791/56236 (2018).

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