Summary
Этот протокол описывает общую стратегию, для повторного создания коммерческих выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для метки бесплатный мобильный анализатор, направленных на экономию на высокой работает на основе ofmicrochip анализов затрат. Пищеварение трипсина, полоскание с этанол и вода и спиннинг шаг, который позволяет повторное использование микросхем включает в себя процесс регенерации.
Abstract
Этикетка бесплатно на основе ячеек пробирного выгодно для биохимического исследования из-за него не требует использования экспериментальных животных. Из-за его способности предоставлять более динамичной информации о клетки в физиологических условиях, чем классическая биохимических анализов этот assay лейбл бесплатно реального времени клетки, основанного на принципе электроимпедансной привлекает больше внимания в течение последних десятилетия. Однако его практического использования могут быть ограничены из-за относительно высокой стоимостью измерения, в котором дорогостоящих расходных одноразовых золотые микросхемы используются для анализатор клеток. В этом протоколе мы разработали общую стратегию для регенерации выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для анализатора в коммерческих лейбл свободных клеток. Пищеварение трипсина, полоскание с этанол и вода и спиннинг шаг включает в себя процесс регенерации. Предложенный метод был испытания и показали свою эффективность для регенерации и повторного использования коммерческих электронных плит по крайней мере три раза, который поможет исследователям сохранить на высокой стоимости работает в реальном времени клеток.
Introduction
Из-за его эффективное и менее трудоемкий процесс экспериментальной лейбл свободной ячейки-технологии на основе стал свидетелем быстрого роста за последнее десятилетие в целях как аналитической, так и отбора таких как в аспекте протеомики1,2 , препарат доставки3, и т.д.4,5 по сравнению с традиционными биохимических методов, направленных на анализ клеток, assay этикетка бесплатно реального времени клетки с прототип, разработанный Giaever и coworkers ранее6 основана на принципе регистрации изменений электрического сигнала на поверхности клеток придает микрочипы, которые допускают непрерывного измерения роста клеток или миграции в количественном выражении. Следуя этой стратегии был запущен в реальном времени ячейки электронной зондирования (RT-КЕС) системы, используя принцип электрическое сопротивление на основе обнаружения был представлен7,8 и совсем недавно коммерческой реального времени ячейки анализатор (RTCA) для лабораторных исследований9.
Главным образом, коммерческие реального времени ячейки анализатор считывает клеток вызвали сигналы электрического сопротивления, которые приводят к от физиологических изменений инкубирован клеток, включая пролиферацию клеток, миграции, жизнеспособность, морфология и соблюдение на поверхность микросхемы,1011. Такие электрические сигналы далее преобразуются Безразмерный параметр с именем индекса ячейки (CI) для оценки состояния ячейки в анализатор. Изменение сопротивления микросхемы отражает главным образом местных ионных окружающей среды покрыты клеток в интерфейсе электрода/решения. Таким образом аналитическая производительность анализатор клеток полагается на ядро зондирования блок, одноразовые микросхемы (то есть, так называемые электронные пластины, например, 96/16/8-Ну), изготовленные из выстроились золото микроэлектродов lithographically печать в нижней части скважины инкубации. Золото микроэлектродов собрать в формате круг на линия (рис. 1) и покрывают большую часть площади поверхности инкубации скважин, которые позволяют для обнаружения динамических и чувствительных прилагаемый клетки3,12,13 ,14. CI увеличит в случае более поверхности покрытия клеток на чипе и уменьшаться, когда клетки подвергаются токсикант, что приводит к апоптозу. Хотя анализатор реального времени клетки часто использовался для определения цитотоксичность11 и нейротоксичность15 и предоставить больше кинетическая информации, чем классическая конечных точек метод, одноразовые электронные пластины являются дорогостоящая Расходные материалы.
До сих пор были не доступны методы для регенерации электронных пластины, которая, вероятно, объясняется тем, что суровые регенерации условия, такие как пираньи решения или уксусной кислоты являются участие16,17, 18, которые могут изменить состояние электрических золотые микросхемы. Таким образом мягкий и эффективный метод для удаления адэрентных клеток и других веществ с поверхности золотые фишки будет желательным для процесса регенерации электронных пластины. Мы недавно разработали протокол, направленный на регенерацию одноразовых электронных плит с использованием неагрессивных реагентов и регенерированный фишки характеризовались электрохимический, а также оптические методы19. С помощью легко доступных и умеренные лабораторных реагентов, включая трипсина и этанола, мы создали общий метод для повторного создания коммерческих электронных пластину без побочных эффектов, который успешно применяется для регенерации два основных типа электронные пластины (16 и L8) используется для RTCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: В общем, процесс регенерации включает Пищеварение трипсина и полоща шаг с этанол и вода. Пищеварение время меняется в зависимости от количество ячеек, которые используются, и тип и количество ячеек, которые используются могут отличаться в зависимости от экспериментальных целях. Рекомендуется проверить регенерированный микросхемы с помощью оптических и электрохимические методы для оптимизации условий регенерации. В ходе эксперимента растворимых и нерастворимых химических веществ могут быть вовлечены, и здесь описаны эти два типичных случаев регенерации процедур.
1. Подготовка регенерации растворов
Примечание: Подготовка и обрабатывать все решения в стерильных условиях.
- Готовить свежий раствор трипсин 0.25% (g/v). Трипсина могут быть приобретены или свежеприготовленные следующим образом.
- Растворите 0,25 g трипсина в 100 мл физиологического раствора фосфатного буфера рН 7,4 (PBS).
- Перемешайте раствор, пока трипсина полностью растворится в 4 oC. перемешать раствор на низкой скорости, заботясь, чтобы избежать каких-либо формирования пузыря.
- Фильтр решение с 0,22 мкм фильтром в капюшоне биобезопасности.
- Подготовьте 75% этанола с помощью абсолютного этанола. Налить 75 мл абсолютного этанола в объемной колбу и Добавьте деионизированной воды до тех пор, пока объем достигает 100 мл. При необходимости выполнения дальнейшей стерилизации.
2. инкубации и пролиферации A549 клеток в электронных плит
Примечание: Электронные пластины типы 16 и L8 оба сделаны из выстроились золото микроэлектродов lithographically напечатаны в нижней части скважины инкубации. Электронные пластины 16 имеет 16 скважин, а электронные пластины L8 8 скважин. Уэллс электронной пластины 16 раунда пока скважин электронной пластины L8 прямоугольников со скругленными углами. Объем каждой электронной пластины 8 хорошо составляет около 830 мкл и каждый электронный планшет 16 хорошо около 270 мкл.
- Культура клеток A549
- Культура A549 клетки в Розуэлле парк Мемориальный институт-1640 среднего (RPMI 1640) дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллин стрептомицина в клеточной культуре блюдо.
- Проход клетки, когда плотность клеток достигает ~ 75% затем вымыть слоя адэрентных клеток с 1 × PBS и trypsinize с 0,25% раствор трипсина за 1 мин на 37 oC. центрифуги клетки на 179 г × 5 мин для удаления трипсина. Ресуспензируйте клетки в 10 мл среды для дальнейшего культуры или других экспериментов.
Примечание: Здесь решение клеток высокомобильна в среде обозначается как буфер подвеска клетки. - Взять 10 мкл и подсчитать ячейки с помощью Горяева. Используйте средство RPMI 1640 для дальнейшего разбавления буфер подвеска клетки подготовить 30 000-80 000 клеток/мл клеток подвеска буфер для экспериментов.
-
Распространение/цитотоксичность эксперимент и сбора данных
- Добавьте 50 мкл (150 мкл для электронных плиты L8) клеток средних каждого инкубации также электронные пластины 16 и оставить на 30 мин в области биобезопасности капот для уравновешивания. Вставка электронной пластины 16 вручную в реальном времени ячейки анализатора CO2 инкубатора на 37 oC.
- Запуск реального времени ячейки анализатор операции программы на компьютере. По умолчанию эксперимент шаблон настройки страницы, выберите «Эксперимент модель» и имя работает assay.
- На своей странице макета выберите соответствующий скважин, которые включены в эксперимент и ввести информацию, как тип, номер и наркотиков названия ячеек в поля ввода. На своей странице Расписание добавьте экспериментальные шаги, а затем выберите время работы (например, 12, 24 или 48 ч) каждый шаг и интервал сбора данных в реальном времени.
Примечание: Здесь, интервал шага 1 и 2 являются 1 мин и 15 мин после этого. - Сохраните файл и нажмите кнопку «Пуск» для измерения импеданса фон СМИ на своей странице индекса ячейки; полученные данные будут автоматически вычитаться. На своей странице хорошо граф можно посетить все хорошо кривых. На его участок страницы, добавьте скважин и график время ячейки индекса будет показан.
- Для эксперимента распространения клеток во-первых, нажмите кнопку «Пауза» для приостановки выполнения программы. Затем вынуть пластину электронных и добавьте 100 мкл A549 клеток подвеска буфера за хорошо при комнатной температуре. Оставьте пластину на 30 мин в биобезопасности капот, чтобы поселиться в нижней части скважины инкубации клеток.
- Вставка электронной пластины в реальном времени ячейки анализатор станции вручную. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы продолжить эксперимент.
Примечание: На странице сюжет, анализатор постоянно записывает значения индекса ячейки или кривых на протяжении всего эксперимента. - Когда эксперимент завершится, введите странице сюжет и откройте файл эксперимент. Затем выберите все протестированные инкубации скважины и результирующий индекс ячейки кривых, которые могут быть в среднем или нормализации в последний раз перед добавлением фармацевтических препаратов или изменения средних и уменьшить различия между анализов. На странице анализа данных можно рассчитать ЭК50 или IC50
3. регенерация электронных плит
Примечание: Для каждого полоща шаг, решение в электронных плита была тщательно перемешивают (5 - 10 раз) с помощью пипетки.
-
Случай 1: для оценки цитотоксичность анти -рак наркотиков
- Семя A549 клеток на электронные пластины как описано в разделе 2.
- Растворите в борьбе с раком наркотиков Доксорубицина гидрохлорид (DOX) в среде ячейки сначала. Медленно добавьте DOX клетки (конечная концентрация DOX-30 мкг/мл) с помощью пипетки. Запись CI, как описано в разделе 2.
Примечание: Электронный тарелка была заново сразу же после завершения эксперимента. В этом случае, как DOX растворимый химическая регенерации электронных пластины после протокол относительно прост в обращении и дополнительные действия не требуются. -
Регенерация
- Примите вне электронной пластины, содержащие клетки от станции анализатор реального времени ячейки. Место используется электронный пластины в стерильных биобезопасности капюшон при комнатной температуре и смеси питательной среды, тщательно с помощью пипетки. Пипетка, все среды.
- Промойте электронные пластины с 200 мкл деионизированной водой в 3 раза при комнатной температуре.
- Дайджест оставшиеся ячейки на электронные пластины с трипсин 0.25% свежеприготовленных для 1-2 ч (200 мкл/а) в инкубаторе на 37 oC. По завершении пищеварение mix решение инкубации, 5 - 10 раз с помощью пипетки и пипетки все решения в капюшоне биобезопасности при комнатной температуре.
- Промойте электронные пластины с 200 мкл этанола и 200 мкл воды, соответственно, следующим образом: деионизованной воды 2 раза, 100% этиловом спирте 2 раза; 75% этиловом спирте 2 раза; деионизированная вода 2 раза. Инверсия электронных пластину на стерильную марлю или папиросной бумаги декантировать оставшуюся воду при комнатной температуре.
- Ультрафиолетовой стерилизации регенерированный электронные пластины для 1-2 ч в капюшоне биобезопасности при комнатной температуре.
Примечание: Двойной объем всех решений для регенерации электронных пластины L8.
-
Случай 2: поставки наркотиков с использованием мезопористых материалов.
- Использовать стержень как мезопористых кремнеземные материалы с средней поры 5.6 как матрицы доставки наркотиков, как сообщалось ранее20Нм.
Примечание: Здесь, электронные пластины использовалась для контроля за наркотиками релиз эффект на клетки.- Добавьте мезопористых материалов в инкубации решение каждой скважины электронных плит. Как кремнеземные материалы не растворимых и осадка в электронной пластины, промойте пластины следующим образом:
- Выполните шаги 3.1.3.1-3.1.3.3, как описано для случая 1.
- Промойте микросхемы с 200 мкл деионизированной водой один раз в капюшоне биобезопасности при комнатной температуре.
- Промойте микросхемы с 200 мкл абсолютного этанола 2 раза при комнатной температуре.
- Один раз ополосните микросхемы с 200 мкл 75% этанола при комнатной температуре.
- 250 мкл 75% этанола в каждой скважине и печать электронных пластины с уплотнительной фильм при комнатной температуре.
- Спина на 114 x g на 2 мин и пустые электронные пластины. Инверсия электронных пластину на стерильную марлю или папиросной бумаги декантировать оставшуюся воду при комнатной температуре.
- Повторите шаг 3.2.5-3.2.7 раз.
- Ультрафиолетовой стерилизации регенерированный электронные пластины для 1-2 ч в капюшоне биобезопасности при комнатной температуре.
Примечание: Двойной объем всех решения, когда полоскания L8 электронных плит.
- Использовать стержень как мезопористых кремнеземные материалы с средней поры 5.6 как матрицы доставки наркотиков, как сообщалось ранее20Нм.
4. Оценка эффекта регенерации
-
Оптические характеристики регенерированный электронной поверхности
- Использование стальной ложку тщательно разбирать в нижней части инкубации также свежие и регенерации электронных пластина, которая содержит выстроил золото микроэлектродов. Ношение пластиковую перчатку, тщательно протирают микрочип содержащих часть от электронных пластину, используя стальные ложкой.
- Место обе части в центре стеклянных скольжениях микроскопа и собирать результирующий спектры комбинационного Раман Микроскоп оснащены CCD датчик21.
Примечание: Спектрометр был оснащен 633 нм лазер и спектры был записан с интервалом 30 s лазерного воздействия на длине волны в диапазоне 500-3500 см-1. Оптических изображений были получены путем Раман микроскопа с помощью 10 x глаз объектив и 50 x цели. Рисунок 1A и Рисунок 1 c также были получены с помощью установленных Раман микроскопа аппарат. - Оценки жизнеспособности прилагаемый клеток после поглощения анти рака наркотиков на свежий и регенерации электронных плит, использование конфокальный лазерный сканирующий микроскоп для мониторинга спонтанное флуоресценции DOX молекул поглощается A549.
- Для записи спонтанное флуоресценции всасывается DOX с помощью клетки (свежие и регенерации электронных пластины с A549 клетками), 63 X нефти объективные и 485 Нм как волны возбуждения.
-
Электрохимическое поведение регенерированный электродов
Примечание: Как ручной притворяться коммерческих электронных плиты является сложным и не подходит для оценки состояния поверхности электрические проверки, эффективность регенерации протокола была оценена с помощью обычных золото/стеклоуглерода электрода (СОО) как тест платформа, на которой была выполнена электрохимических импедансной спектроскопии (EIS). Диаметры Au электрода и GCE являются 3 мм. электрохимические данные были получены электрохимических анализатор с тремя электродами системой и сопротивление измерения проводились с помощью сигнала переменного тока (AC) 10 мВ амплитуда на широкий частотный диапазон от 100 кГц до 0,01 Гц.- Перед измерением польский Au электрода и GCE к зеркальной поверхности с раствора глинозема на полировки тканью, после чего sonication в воде для удаления частиц.
- Так активировать Au электрод в 0,5 М H24. Получение данных EIS голые Au электрода и СОО в 10 мм раствор электролита KCl, содержащие 1 мм K3[Fe(CN)6] как описано22.
- Подготовьте раствор клеток A549 согласно 2.1.2 и 2.1.3. Падение 10 мкл суспензии клеток на поверхности электрода АС и сто. Инкубируйте Au электрода и GCE, изменение с ячейками в 37 oC инкубатор для 3 h. получить EIS данных АС электрода и GCE, изменение с ячейками 10 мм раствор электролита KCl, содержащие 1 мм K3[Fe(CN)6].
-
Регенерировать электродов, используя протокол и мера EIS.
- Погружают электрод АС и GCE изменен с ячейками в трипсин 0.25% 0,5-2 ч. Промойте Au электрода и GCE мягко с водой 4 раза. Ополосните электроды мягко с абсолютного этанола, в 4 раза. Погружайте Au электрода и GCE в 75% этанола для ~ 5 минут сполосните фишки мягко с 75% этанола 4 раза.
- Получение данных EIS регенерированный Au электрода и СОО в раствор электролита KCl 10 мм, содержащие 1 мм K3[Fe(CN)6].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Свойств поверхности золота микросхемы: регенерации процедуры, используемые в настоящем протоколе были изложены на рисунке 1. На рисунке 2 показан микроскопических поверхности фотографии свежей и обновленной электронной пластины оптический микроскоп. Как показано на рисунке 2A и Рисунок 2 c, микроскопические наблюдения свидетельствуют, что существует практически никакой разницы в оптических свойствах микрочип поверхности между пресной и рассматривать электронные пластины. С помощью спонтанное флуоресценции доксорубицин молекул, включены в удобной для оценки состояния клетки клетки, мы наблюдали аналогичные однородности культивируемых клеток на золотые микросхемы после регенерации (Рисунок 2B и Рисунок 2D ). Кроме того инкубируют раковые клетки отображаются четко клеточной морфологии в электронной пластины, демонстрируя многократного использования чипов. Рисунок 3 показывает Раман спектры свежие и регенерации электронных плит. Практически идентичны Раман пик распределения между свежие и обработанные пластины электронных отметил процесс успешной регенерации поверхности золота микрочип. Раман сигналы электронных плит, покрытые A549 клетки были искажены в некоторой степени, вероятно из-за помех от спонтанной флуоресценции A549 клеток.
Повторно микросхемы для анализа цитотоксичности, используя RTCA: Мы также применяется протокол регенерации для тест ячейка распространения и материал цитотоксичность оценки (Рисунок 4). A549 клетки оптимальной плотности были посеяны на восстановленный электронных пластину 16 и кинетических кривых роста были зарегистрированы в реальном времени ячейки анализатор. Как показано на рисунке 4A, все результирующие кривые роста параллельных экспериментальных скважин показали надлежащей согласованности, которая указала, что состояние поверхности электрические электронной пластины 16 значительно сохранено после регенерации. Регенерированный электронные пластины L8 также была протестирована на цитотоксичность, используя мезопористых кремнеземные материалы, как показано на рисунке 4В. По сравнению с управления экспериментом, CI мезопористых материалов лечение образцов снизилась до некоторой степени, указанием небольшой цитотоксичность материалов. Дальнейшие инкапсуляции и выпуск препарата противораковых Dox мезопористых материалов вызвало резкое снижение роста кривой A549. Эти экспериментальные результаты показали согласованности с использованием свежих электронные пластины и сообщалось ранее работы19, которая проверена эффективность этого протокола предлагаемого регенерации.
Эффективность регенерации, оценены электрохимические методы: Коммерческие АС электродов и стеклоуглерода электроды были использованы как тест платформы для оценки эффективности регенерации. Рисунок 5 показывает EIS Au электроды и сто, которые были изменены с раковых клеток. Было показано, что после инкубации клеток A549 на электроде, очевидно электрона передачи сопротивления (Ret) наблюдался рост по сравнению с голыми электродов. Ret был значительно сократилось после того, как Au электрода и GCE рассматривались согласно протоколу на рисунке 5. Аналогичные изменения Ret как Au электрода и GCE отметил процесс эффективного и универсального регенерации микрочипов относительно их поверхности электрические свойства.
Рисунок 1: процесс регенерации электронных плит. В типичной регенерации запуска четыре основные шаги были вовлечены, включая инкубации клеток, а также их отряд на поверхности электронных плит, следуют промывка, спиннинг и ультрафиолетовой стерилизации шаги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: свойства поверхности электронных плит. (A) новые электронные пластины, что клетки (B) A549 были покрытием на а. (C) Regenerated электронные пластины (D) A549 клетки были покрытием на C. В случае клетки придают на золото микросхемы был использован DOX. Рисунок 2A и Рисунок 2 c были изменены с Сюй, з. и др. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: спектры комбинационного различных обращение электронных плит. (A) новые электронные пластины. (B) новые электронные пластины посеяны с A549 клетками. (C) регенерируется электронные пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: кривые роста клеток A549 на три времени регенерации электронных плит. (A) кривых параллельного роста клеток посеян на электронные пластины 16. (B) цитотоксичность тест мезопористых кремнеземные материалы на электронных плите L8 с погрешностей (стандартное отклонение, STD) зарегистрированных кривых каждого инкубации хорошо. На рисунке 4A был изменен с Сюй, з. и др. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Электрохимический импеданс спектров различных модифицированных Золотые электроды и стеклоуглерода электродов (СОО) в 10 мм раствор электролита KCl, содержащие 1 мм K3[Fe(CN)6]. (A) по-разному относиться Au электродов. (B) Разное лечение соо. Рисунок 5A был изменение fromXu, з. и др. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Чип приложений | Регенерация буфер | Стратегия восстановления |
| Поверхностного плазмон резонанс (SPR) | Пиранья решения (так сосредоточены H24/30% H2O2 = 3:1, v/v)17 | Стрип аналита и зонд, основанные на сильное окисление |
| Датчики пьезоэлектрические Microcantilever (PEMS) | Глицин-HCl смесь23,24 | отделить комплекс целевых зонд и удалить аналита |
| Высокая концентрация соли раствора (2M MgCl2 + 1,5 М трис)25 | ||
| Золото фильм | Кох 50 мм + 25% H2O226 | Окисленных органических |
Таблица 1: Краткое изложение стратегий сообщил регенерации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы кратко несколько доступных методов17,23,24,25,26 для регенерации микросхемы в таблице 1. В основном эти методы участвует относительно суровые экспериментальных условий для достижения полной регенерации чипы из-за присутствия сильной молекулы молекула взаимодействий как иммунный комплекс используется для чипов СРП. Однако эти суровые экспериментальных условиях могут быть чрезвычайно вредными для свойств поверхности выстроились золото микросхем, используемых в RTCA. Таким образом мягкий и эффективный метод были основных соображений в разработку стратегии представлены регенерации. Другие факторы, которые являются не менее важными являются экологические проблемы, поскольку эти одноразовые микросхемы часто используются вместе с целевой раковые клетки.
В этом протоколе мы представляем общий метод для регенерации коммерческих выстроились золотые микросхемы для RTCA. Наш протокол был разработан на основе Пищеварение трипсина и полоскания с этанол и вода. Дополнительные спиннинг шаги считаются эффективными в деле устранения нерастворимых частиц, используемых для анализа процесса регенерации. По сравнению с реагентов, используемых в сообщалось ранее методы, восстанавливающий трипсина реагентов и этанол легко доступны для использования в лаборатории ежедневно и эти биологические Продукция/Химические вещества характеризуются низкой токсичностью и таким образом считаются экологически чистые, которая является желательным в целях возрождения.
В этом протоколе важным шагом является Пищеварение трипсина для обеспечения производительности регенерации золотые микросхемы. Оптимизация trypsinization, включая концентрации и времени, должно быть первым приоритетом для достижения регенерации. Помимо время пищеварения, рационализировать в наш предыдущий доклад19хорошие оценки для оптимизации процесса это просто проверить свойства поверхности, с помощью оптического микроскопа.
Другой проблемой является обработка микросхем во время процесса регенерации. Как пипетки часто используется в экспериментах, внимание следует уделять персоналом не поцарапать кончик на поверхности микросхемы. Кроме того полезно предварительно стерилизуют советы, марля и ложка для обеспечения эффективности регенерации. Не в последнюю очередь, процесс регенерации должна проводиться в капотом биобезопасности, чтобы избежать любого загрязнения.
Следует отметить, что полоща процессы, участвующие в протоколе регенерации проводятся вручную, которая неизбежно приведет к предвзятости из-за различных персонала. Чтобы преодолеть это ограничение, автоматического или полуавтоматического оборудования для полоскания целей может быть специально разработаны, учитывая модульных электронных плит, используемых. Кроме того протокол регенерации был протестирован эффективными для анализов на основе ячеек. Однако при наличии сильной молекулярных взаимодействий, например образование антител антигена на стыке чипов, предлагаемая регенерации условия могут быть ограничены в значительной степени и сравнительно сильный буффер условия следует рассматривать.
В целом был протестирован текущий протокол регенерации позволяет повторное использование коммерческих золотых микросхемы, а также других ведущих электроды например Au и стеклоуглерода электродов. Мы ожидаем, что применение этого протокола будет сэкономить на высокой стоимости работает в реальном времени на основе чипа клеток. В долгосрочной перспективе на основе микрочипа анализов становится все более часто используются для протеомных и клеточного анализа и предлагаемый протокол в этом исследовании может предложить вариант для регенерации, в котором автоматического или полуавтоматического оборудования для полоскания может быть разработана и применяется в случаях накопленный одноразовые чипы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работа была поддержана национальной естественных наук фонд Китая (U1703118), проект, финансируемый приоритет академической программы развития из Цзянсу высшее образование учреждений (PAPD), Цзянсу Shuangchuang программы, открытые фонды государственного ключа Лаборатория для химиотерапии/Biosensing и хемометрике (2016015) и национальной лаборатории биомакромолекулах (2017kf05) и профессор Jiangsu Specially-Appointed проекта, Китай.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
