Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56250
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1, 4
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft een algemene strategie om te regenereren commerciële gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een label-vrije cel analyzer besparing op de hoge lopende kosten ofmicrochip gebaseerde tests gericht. Het regeneratieproces omvat de spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water, en een stap van spinnen, waardoor herhaalde gebruik van microchips.

Abstract

De label-vrije cel-gebaseerde bepaling is voordelig voor biochemische studie vanwege het vereist niet het gebruik van proefdieren. Vanwege haar vermogen om meer dynamische informatie verstrekken over cellen onder fysiologische omstandigheden dan klassieke biochemische tests, dit label-gratis real-time cel assay gebaseerd op het principe van elektrische impedantie is het aantrekken van meer aandacht tijdens het verleden decennium. Echter, het praktische gebruik kan worden beperkt als gevolg van de relatief dure kosten van meting, waarbij kostbare verbruikbare wegwerp gouden microchips worden gebruikt voor de cel analyzer. In dit protocol hebben we een algemene strategie om te regenereren gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een commerciële etiket-vrije cel analyzer. Het regeneratieproces omvat spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water en een spinning-stap. De voorgestelde methode is getest en aangetoond dat het effectief is voor de regeneratie en het herhaalde gebruik van commerciële elektronische platen ten minste driemaal, die onderzoekers opslaan op de hoge lopende kosten van real-time cellen zal helpen.

Introduction

Vanwege haar efficiënte en minder arbeidsintensieve experimentele proces, label-vrije cel-gebaseerde technologie is getuige geweest van snelle groei in het afgelopen decennium voor zowel analytische als screening doeleinden, zoals in het aspect van proteomics1,2 , levering3, etc.4,5 vergeleken met traditionele biochemische methoden gericht op cel analyse, real-time label-vrije cel assay met het prototype ontwikkeld door Giaever en collega's eerder6 van de drug is gebaseerd op het beginsel van de opname van wijzigingen van het elektrische signaal op het oppervlak van de cel-ingeschrevenen microchips, die het mogelijk een Continumeting van celgroei of migratie op een kwantitatieve manier maken. Naar aanleiding van deze strategie, een real-time cel elektronische sensing (RT-CES) systeem met behulp van elektrische impedantie gebaseerde detectie beginsel werd geïntroduceerde7,8 , en meer recentelijk een commerciële real-time cel analyzer (RTCA) werd gelanceerd voor laboratorium onderzoek9.

De commerciële real-time cel analyzer voornamelijk leest de cellen evoked signalen van elektrische impedantie, die uit de fysiologische veranderingen van bebroede cellen voortvloeien, met inbegrip van celproliferatie, migratie, levensvatbaarheid, morfologie en naleving van de oppervlak van microchips10,11. Deze elektrische signalen worden verder omgezet door de analyzer een dimensieloze parameter met de naam de cel Index (CI) te beoordelen van de status van de cel. De verandering van de impedantie van microchips weerspiegelt voornamelijk de Ionische omgeving van overdekte cellen op het raakvlak van de elektrode/oplossing. Dus, de analytische prestaties van de cel analyzer leunt op de kern sensing eenheid, de wegwerp microchips (d.w.z., zogenaamde elektronische platen, bijvoorbeeld, 96/16/8-well), die zijn vervaardigd van gekleed gouden microelectrodes lithographically onderaan van incubatie putten. De gouden microelectrodes monteren in een cirkel-on-line indeling (Figuur 1) en dekking van de meeste van de oppervlakte van de incubatie putten, waarmee dynamische en gevoelige detectie van gekoppelde cellen3,12,13 ,14. De CI zal vergroten in het geval van meer oppervlakte dekking van cellen op de chip en afnemen wanneer cellen worden blootgesteld aan een veroorzaken als gevolg in apoptosis. Hoewel de real-time cel analyzer vaak gebruikt is om te bepalen van cytotoxiciteit11 en neurotoxiciteit15 en meer kinetische informatie verstrekken dan eindpunten van de klassieke methode, zijn de wegwerp elektronische platen de duurste verbruiksgoederen.

Tot nu toe zijn er geen beschikbare methoden voor de regeneratie van de elektronische plaat, die waarschijnlijk wijten aan het feit dat harde regeneratie aandoeningen, zoals piranha-oplossing of azijnzuur betrokken16,17, zijn 18, die de elektrische status van gouden microchips kunnen veranderen. Een milde en efficiënte methode om te verwijderen van de Adherente cellen en andere stoffen van het oppervlak van goud chips zullen daarom wenselijk voor het regeneratieproces elektronische plaat. Onlangs hebben we een protocol gericht op het herstel van de wegwerp elektronische platen met behulp van niet-corrosieve reagentia en de geregenereerde chips werden gekenmerkt door elektrochemische evenals optische methodes19. Met behulp van gemakkelijk beschikbaar en matige laboratoriumreagentia, met inbegrip van trypsine en ethanol, hebben we een algemene methode om te regenereren de commerciële elektronische plaat zonder bijwerkingen, die goed is toegepast op het regenereren van de twee belangrijkste soorten opgericht van elektronische plaat (16 en L8) gebruikt voor RTCA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: In het algemeen, het regeneratieproces omvat spijsvertering van de trypsine en spoeldouche stap met ethanol en water. De tijd van de spijsvertering is afhankelijk van het aantal cellen die worden gebruikt, en het type en aantal cellen gebruikt kunnen verschillen afhankelijk van de experimentele doeleinden. Het is aangeraden om te controleren de geregenereerde microchips optische en elektrochemische methoden gebruiken voor het optimaliseren van de regeneratie-voorwaarden. Tijdens het experiment, oplosbare en onoplosbare stoffen kunnen worden betrokken, en hier deze twee typische gevallen van de regeneratie-procedures zijn gedetailleerd.

1. bereiding van de oplossingen van de regeneratie

Opmerking: Voorbereiden en verwerken van alle oplossingen onder steriele omstandigheden.

  1. Bereid verse trypsine-oplossing van 0,25% (g/v). Trypsine kan worden ingekocht of vers bereid als volgt.
    1. Los 0,25 g trypsine in 100 mL pH 7.4-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Roer de oplossing tot de trypsine volledig bij 4 oC. Roer de oplossing bij lage snelheid verzorgen opgelost is om te voorkomen dat de vorming van een zeepbel.
    3. Filtreer de oplossing met een 0,22 µm filter in de kap van de bioveiligheid.
  2. 75% ethanol met behulp van absolute ethanol te bereiden. Giet de absolute ethanol 75 mL in een volumetrische maatkolf en Voeg gedeïoniseerd water toe totdat het volume 100 mL bereikt. Verdere sterilisatie uitvoeren indien nodig.

2. de incubatie en proliferatie van A549 cellen in elektronische platen

Opmerking: Elektronische plaat typen 16 en L8 zijn beide gemaakt van gekleed gouden microelectrodes lithographically onderaan van incubatie putten. Elektronische plaat 16 heeft 16 wells terwijl elektronische plaat L8 8 putten. De putten van elektronische plaat 16 zijn ronde terwijl de putjes van elektronische plaat L8 afgeronde rechthoeken. Het volume van elke elektronische plaat 8 Nou is ongeveer 830 µL en elke elektronische plaat 16 Nou is ongeveer 270 µL.

  1. De cultuur van de cel van de A549
    1. Cultuur A549 cellen in Roswell Park Memorial Instituut-1640 medium (RPMI-1640) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine in de celcultuur schotel.
    2. Passage van de cellen wanneer de celdichtheid ~ 75% bereikt dan wassen het aanhangend cellaag met 1 × PBS en trypsinize met 0,25% trypsine oplossing voor 1 min bij 37 oC. Centrifuge de cellen bij 179 × g gedurende 5 min trypsine verwijderen. Resuspendeer de cellen in 10 mL medium voor verdere cultuur of andere experimenten.
      Opmerking: De oplossing van cellen geresuspendeerde in het medium is hier aangewezen als de schorsing van de cel buffer.
    3. Neem 10 µL en het nummer van de cel met een hemocytometer rekenen. Gebruik het RPMI-1640 medium om te verder verdunnen de opschorting van de cel buffer ter voorbereiding van de opschorting van de cel van 30.000-80.000 cellen/mL buffer voor de experimenten.
  2. Proliferatie/cytotoxiciteit experiment en data-acquisitie
    1. 50 µL (150 µL voor elektronische plaat L8) cel medium aan elke incubatie goed van de elektronische plaat 16 en laat het gedurende 30 min. in het biosafety kap voor evenwichtsinstelling toevoegen. Handmatig invoegen de elektronische plaat 16 in de real-time cel analyzer in de CO2 incubator bij 37 oC.
    2. Start het real-time cel analyzer werking programma op de computer. Experimenteren op zijn standaard patroon setup-pagina, selecteer "Experiment model" en de naam van de lopende assay.
    3. Selecteer de overeenkomstige putten die zijn opgenomen in het experiment en de inbreng van de informatie zoals cel type, nummer en drug namen in de invoervakken op haar pagina lay-out. Op de pagina Schedule de experimentele stappen toevoegen en selecteer vervolgens de lopende tijd (bijvoorbeeld 12, 24 of 48 uur) van elke stap en interval van real-time data-acquisitie.
      Opmerking: Hier het interval van stap 1 en 2 zijn 1 min en 15 min daarna.
    4. Sla het bestand op en klik op "Start" knop om te meten de impedantie van de achtergrond van de media op haar celindex pagina; de resulterende gegevens zal automatisch worden afgetrokken. Op de pagina goed grafiek kan alle goed krommen bezichtigd worden. Voeg op de pagina Plot wells en de grafiek van tijd-celindex wordt getoond.
    5. Voor de cel proliferatie experiment, om te beginnen klik op "Pauze" om te onderbreken van het programma. Dan nemen de elektronische plaat en voeg 100 µL A549 cel schorsing buffer per putje bij kamertemperatuur. Laat de plaat gedurende 30 minuten in de kap van de bioveiligheid te laten de cellen regelen naar de onderkant van de incubatie wells.
    6. Handmatig invoegen de elektronische plaat in de real-time cel analyzer station. Klik op de "Start" knop om verder te gaan van het experiment.
      Opmerking: Op de pagina van de Plot, de analyzer voortdurend records celindex waarden of curven gedurende het gehele experiment.
    7. Wanneer het experiment voltooid is, voert u de Plot-pagina en open het experiment-bestand. Selecteer vervolgens alle putjes van de geteste incubatie en de resulterende celindex curves die kunnen worden gemiddeld of genormaliseerd voor de laatste keer vóór toevoegen van farmaceutische geneesmiddelen of wijzigen van middellange ter vermindering van de verschillen tussen de testen. Op de pagina van de gegevensanalyse, kan EC50 of IC50 worden berekend

3. regeneratie van elektronische platen

Opmerking: Voor elke spoeldouche stap, de oplossing in de elektronische plaat werd gemengd grondig (5 - 10 keer) met behulp van een precisiepipet.

  1. Case 1: voor de beoordeling van de cytotoxiciteit van anti -kanker drug
    1. Zaad A549 cellen op de elektronische plaat zoals beschreven in sectie 2.
    2. Los eerst de anti-kanker drug Doxorubicine hydrochloride (DOX) in het medium van de cel. Voeg langzaam DOX aan de cellen (eindconcentratie van DOX is 30 µg/mL) met behulp van een precisiepipet. De CI opnemen zoals beschreven in sectie 2.
      Opmerking: De elektronische plaat gebruikt werd hersteld onmiddellijk na het experiment compleet was. In dit geval, zoals DOX een oplosbare chemische stof is, de regeneratie van de elektronische plaat volgens het protocol is relatief gemakkelijk te hanteren en geen extra stappen nodig zijn.
    3. Regeneratie
      1. De elektronische plaat met cellen van het real-time cel analyzer station nemen. Plaats van de gebruikte elektronische plaat in een steriele bioveiligheid kap bij kamertemperatuur en meng kweekmedium grondig met behulp van een pipet. Pipetteer uit alle van het medium.
      2. Spoel de elektronische platen met 200 µL gedeïoniseerd water voor 3 keer bij kamertemperatuur.
      3. De resterende cellen op de elektronische platen met 0,25% vers bereide trypsine voor 1-2 h (200 µL per putje) in een incubator bij 37 oC. verteren Wanneer de vertering is voltooid, meng de oplossing van de incubatie 5 - 10 keer met behulp van een pipet en Pipetteer uit alle de oplossing in de kap van de bioveiligheid bij kamertemperatuur.
      4. Spoel de elektronische platen met 200 µL ethanol en 200 µL water, respectievelijk, als volgt: gedeïoniseerd water 2 keer, 100% ethanol 2 maal; 75% ethanol 2 maal; gedeïoniseerd water 2 keer. Omkeren van de elektronische plaat op een steriel gaas of een papieren zakdoekje te decanteren in de resterende water op kamertemperatuur.
      5. Ultraviolet steriliseren de geregenereerde elektronische plaat voor 1-2 h in de kap van de bioveiligheid bij kamertemperatuur.
        Opmerking: Het dubbele van het volume van alle oplossingen voor de regeneratie van elektronische plaat L8.
  2. Case 2: drug levering met behulp van mesoporous materiaal.
    1. Staafvormige mesoporous silica materialen gebruikt met een gemiddelde poriegrootte van 5.6 nm als drug delivery matrices, als eerder gemeld20.
      Opmerking: Hier, de elektronische plaat werkte om te controleren van het effect van de drug-release op cellen.
      1. Voeg mesoporous materialen in de oplossing van de incubatie van elk putje van de elektronische platen. Als kiezelzuur materialen, niet oplosbaar en neerslag in de elektronische plaat zijn, spoel de plaat als volgt:
    2. Voer stappen 3.1.3.1-3.1.3.3 als beschreven voor het geval 1.
    3. Spoel de microchips met 200 µL gedeïoniseerd water eenmaal in de kap van de bioveiligheid bij kamertemperatuur.
    4. Spoel de microchips met 200 µL absolute ethanol 2 keer bij kamertemperatuur.
    5. Spoel de microchips met 200 µL 75% ethanol eenmaal bij kamertemperatuur.
    6. Voeg 250 µL van 75% ethanol in elk putje en verzegel de elektronische plaat met de verzegeling film bij kamertemperatuur.
    7. Spin bij 114 x g gedurende 2 min en leeg de elektronische plaat. Omkeren van de elektronische plaat op een steriel gaas of een papieren zakdoekje te decanteren in de resterende water op kamertemperatuur.
    8. Herhaal stap 3.2.5-3.2.7 eens.
    9. Ultraviolet steriliseren de geregenereerde elektronische plaat voor 1-2 h in de kap van de bioveiligheid bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Verdubbelen het volume van alle oplossing wanneer L8 elektronische platen spoelen.

4. beoordeling van het Effect van de regeneratie

  1. Optische kenmerken van geregenereerde elektronische plaat oppervlak
    1. Gebruik een staal lepel om zorgvuldig het demonteren van het onderste gedeelte van de incubatie goed van vers en elektronische plaat waarin geregenereerd gekleed gouden microelectrodes. Het dragen van een plastic handschoen, zorgvuldig veeg de microchip-bevattende deel van de elektronische plaat met behulp van de stalen lepel.
    2. Plaats beide delen in het midden van het glas Microscoop dia's en het verzamelen van de resulterende Raman spectra door Raman Microscoop uitgerust met een CCD detector21.
      Opmerking: De spectrometer was uitgerust met een 633 nm laser en de spectra werd opgenomen met een interval van 30 s laser blootstelling bij een golflengte in het bereik van 500-3500 cm-1. De optische beelden werden verkregen door een Microscoop Raman met behulp van een 10 x eye-lens en de 50 x doelstelling. Figuur 1A en Figuur 1 c werden ook verkregen met behulp van het geïnstalleerde apparaat Raman Microscoop.
    3. Om te beoordelen van de levensvatbaarheid van de gekoppelde cellen na opname van de anti-kanker medicijn op het verse en geregenereerde laser elektronische platen, gebruik een confocale scanning microscoop voor het controleren van de spontane fluorescentie van DOX moleculen die door de A549 geabsorbeerd.
      1. Als u wilt opnemen van de spontane fluorescentie van geabsorbeerde DOX door de cellen (vers en geregenereerde elektronische platen met A549 cellen), gebruik olie een 63 X objectieve en 485 nm als de excitatie golflengte.
  2. Elektrochemische gedrag van geregenereerde elektroden
    Opmerking: Als handmatige dissembling van een commerciële elektronische plaat is moeilijk en niet ideaal voor de beoordeling van oppervlakte elektrische toestand zoals gecontroleerd, de efficiëntie van de regeneratie van het protocol werd beoordeeld met behulp van normale goud/glazig koolstof elektrode (GCE) als een test platform, waarop de elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS) werd uitgevoerd. De diameters van de Au-elektrode en GCE beide zijn 3 mm. elektrochemische gegevens werden verkregen door een elektrochemische analyzer met een drie-elektrode-systeem en de impedantie metingen werden uitgevoerd met behulp van een signaal van de wisselstroom (AC) van 10 mV amplitude bij een breed frequentiebereik van 100 kHz tot 0,01 Hz.
    1. Vóór de meting, gepolijste de Au elektrode en GCE een spiegel-achtig oppervlak met een drijfmest aluminiumoxide op een polijst doek, gevolgd door ultrasoonapparaat in water om alle deeltjes te verwijderen.
    2. Activeren van de Au-elektrode in 0.5 M H2dus4. Het verkrijgen van gegevens van de EIS van de kale Au elektrode en GCE in 10 mM KCl elektrolyt oplossing met 1mM K3[Fe(CN)6] beschreven22.
    3. A549 cel stockoplossing volgens 2.1.2 en 2.1.3 bereiden. 10 µL celsuspensie op het oppervlak van Au elektrode en GCE neerzet. Incubeer Au elektrode en GCE bewerkt met cellen in een 37 oC incubator voor 3 h. verkrijgen EIS gegevens van de Au-elektrode en GCE bewerkt met cellen in 10 mM KCl elektrolyt oplossing met 1 mM K3[Fe(CN)6].
    4. Regenereren de elektroden met behulp van het protocol en de maatregel EIS.
      1. Onderdompelen van de Au-elektrode en GCE bewerkt met cellen in 0,25% trypsine voor 0,5-2 h. Spoel de Au elektrode en GCE zachtjes met water 4 keer. Spoel de elektroden zachtjes met absolute ethanol 4 keer. Dompel Au elektrode en GCE in 75% ethanol voor ~ 5 min. Spoel de chips zachtjes met 75% ethanol 4 keer.
      2. Het verkrijgen van gegevens van de EIS van geregenereerde Au elektrode en GCE in 10 mM KCl elektrolyt oplossing met 1mM K3[Fe(CN)6].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oppervlakte-eigenschappen van gouden microchips: de regeneratie-procedures die in dit protocol werden geschetst in Figuur 1. Figuur 2 toont de microscopische afbeeldingen van zoet oppervlaktewater en elektronische platen geregenereerd door de optische Microscoop. Zoals aangegeven in figuur 2A en figuur 2C, microscopische opmerkingen aangegeven dat er vrijwel was geen verschil in de optische eigenschappen van de microchip oppervlakte tussen vers en elektronische platen behandeld. Met behulp van de spontane fluorescentie van Doxorubicine moleculen opgenomen in de cellen die handig zijn voor de beoordeling van de toestand van de cel, waargenomen we een soortgelijk homogeniteit van gekweekte cellen op de gouden microchips na de regeneratie (figuur 2B en figuur 2D ). Bovendien, weergegeven de bebroede kankercellen een welomschreven cellulaire morfologie in de elektronische plaat aan te tonen de herbruikbaarheid van chips. Figuur 3 toont de Raman spectra van verse en geregenereerde elektronische platen. De vrijwel identieke Raman piek distributies tussen de verse en behandelde elektronische platen aangegeven een succesvolle regeneratieproces van de gouden microchip oppervlak. De Raman-signalen van elektronische platen bedekt met A549 cellen werden vervormd tot op zekere hoogte, waarschijnlijk als gevolg van de inmenging van de spontane fluorescentie van A549 cellen.

Geregenereerd microchips voor de bepaling van de cytotoxiciteit RTCA gebruiken: We zijn ook toegepast met het regeneratie-protocol voor een test van cel proliferatie en materiaal cytotoxiciteit evaluatie (Figuur 4). A549 cellen van optimale dichtheid op de geregenereerde elektronisch bord 16 waren bezaaid en kinetische groeikrommes werden geregistreerd door real-time cel analyzer. Zoals weergegeven in figuur 4A, alle van de resulterende groeikrommes van parallelle experimentele putten bleek voldoende samenhang, die aangegeven dat de oppervlakte elektrische status van elektronische plaat 16 sterk na de regeneratie behouden blijft. De geregenereerde elektronische plaat L8 werd ook getest voor gebruik van mesoporous silica materialen, zoals weergegeven in figuur 4Bvan de cytotoxiciteit. In vergelijking met de controle-experiment, de CI mesoporous materialen behandeld monsters daalde tot op zekere hoogte, met vermelding van een geringe cytotoxiciteit van de materialen. Verdere inkapseling en vrijlating van de drug van de anti-kanker van Dox door mesoporous materialen veroorzaakt een dramatische daling van de groeikromme van A549. Deze experimentele resultaten toonde consistentie met het gebruik van verse elektronische platen en met eerder gerapporteerde werk19, die de efficiëntie van deze voorgestelde regeneratie-protocol gecontroleerd.

Regeneratie efficiëntie beoordeeld door elektrochemische methoden: Commerciële Au elektroden en glazig Koolelektroden werden gebruikt als test platformen voor de evaluatie van de efficiëntie van de regeneratie. Figuur 5 toont de EIS van Au elektroden en GCE die zijn gewijzigd met kankercellen. Het bleek dat na een incubatieperiode van A549 cellen op de elektrode, werd een duidelijk toename van elektronen overdracht weerstand (Ret) waargenomen in vergelijking met die van blote elektroden. De Ret was aanzienlijk afgenomen nadat de Au elektrode en GCE werden behandeld volgens het protocol in Figuur 5. De soortgelijke wijzigingen van de Ret van zowel Au elektrode en GCE aangegeven een effectieve en universele regeneratieproces van microchips met betrekking tot hun oppervlakte elektrische eigenschappen.

Figure 1
Figuur 1: het regeneratieproces van elektronische platen. In een typische regeneratie uitgevoerd, waren vier hoofdstappen betrokken met inbegrip van cellen, alsmede hun detachement op het oppervlak van elektronische platen, gevolgd door het spoelen, spinnen en ultraviolet sterilisatie stappen aan het broeden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: de oppervlakte-eigenschappen van elektronische platen. (A) nieuwe elektronische platen (B) A549 cellen werden verguld op A. (C) Regenerated elektronische platen (D) A549 cellen werden verguld op C. In het geval van cellen verbonden op gouden microchips, werd DOX gebruikt. Figuur 2A en figuur 2C zijn van Xu, Z. et al. gewijzigd 19 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Raman spectra van verschillende elektronische platen behandeld. (A) nieuwe elektronische plaat. (B) nieuwe elektronische plaat bezaaid met A549 cellen. (C) geregenereerd elektronische plaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: A549 cel groeikrommes op drie keer geregenereerde elektronische platen. (A) parallelle groeikrommes van cellen zaadjes op elektronische plaat 16. (B) cytotoxiciteit test van mesoporous silica materialen op elektronische plaat L8 met foutbalken (standaarddeviatie, STD) van geregistreerde bochten van elke incubatie goed. Figuur 4A is van Xu, Z. et al. gewijzigd 19 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Elektrochemische impedantie spectra van verschillende bewerkt goud elektroden en glazig Koolelektroden (GCE) in 10 mM KCl elektrolyt oplossing met 1 mM K3[Fe(CN)6]. (A) Different behandeld Au elektroden. (B) verschillende behandeld GCE. Figuur 5A geweest gewijzigde fromXu, Z. et al. 19 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Chip toepassing Regeneratie buffer Regeneratie strategie
Oppervlakte plasmon resonantie (SPR) Piranha-oplossing (H2zo geconcentreerd4/30% H2O2 = 3:1, v/v)17 strip van de analyt en de sonde op basis van sterke oxidatie
Piëzo-elektrische Microcantilever sensoren (PEMS) Glycine-HCl mengsel23,24 distantiëren van de doel-sonde complex en verwijderen van de analyt
Hoge concentraties van zout oplossing (2M MgCl2 + 1.5 M Tris)25
Gouden film 50mM KOH + 25% H2O226 Geoxideerde organics

Tabel 1: Een korte samenvatting van gerapporteerde regeneratie strategieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We samengevat de verschillende beschikbare methoden17,23,24,25,26 voor het regenereren van microchips in tabel 1. Kortom, deze methoden betrokken relatief harde proefomstandigheden om het volledige herstel van de chips door de aanwezigheid van sterke molecuul-molecuul interacties zoals die van het immuun complex gebruikt voor SPR-chips. Barre omstandigheden zijn een experimentele kunnen evenwel uiterst schadelijk voor de oppervlakte-eigenschappen van gekleed gouden microchips in RTCA gebruikt. Een milde en efficiënte methode waren dus de belangrijke overwegingen bij de ontwikkeling van de strategie van de gepresenteerde regeneratie. Andere factoren die belangrijk zijn milieu-eisen, omdat deze wegwerp microchips vaak in combinatie met gerichte kankercellen gebruikt worden.

In dit protocol introduceren wij een algemene methode voor het regenereren van commerciële gekleed gouden microchips gebruikt voor RTCA. Ons protocol werd ontwikkeld op basis van trypsine-spijsvertering en spoelen met water en ethanol. Extra spinning stappen worden beschouwd als effectief in het verwijderen van de onoplosbare deeltjes gebruikt voor de assay voor het regeneratieproces. Vergeleken met de eerder gemelde methoden gebruikte reagentia, de regeneratie reagentia trypsine en ethanol zijn direct beschikbaar voor dagelijks laboratoriumgebruik en deze biologische producten/chemicaliën zijn lage toxiciteit, en worden daarom beschouwd als milieuvriendelijke, die wenselijk is voor doeleinden van regeneratie.

In dit protocol is de kritieke stap de spijsvertering van de trypsine om de prestaties van de regeneratie van gouden microchips. De optimalisatie van trypsinebehandeling, met inbegrip van de concentratie en de tijd, moet de eerste prioriteit om regeneratie. Naast de spijsvertering-tijd die in onze vorige verslag19is gerationaliseerd, is een goede beoordeling voor het optimaliseringsproces gewoon om te controleren de oppervlakte-eigenschappen met behulp van een optische Microscoop.

Een andere zorg is de behandeling van microchips tijdens het regeneratie proces. Zoals een pipet vaak in de experimenten gebruikt wordt, moet aandacht worden besteed door personeel te voorkomen krassen op de tip op het oppervlak van microchips. Bovendien, het is gunstig voor het steriliseren vooraf de tips, gaas en lepel regeneratie efficiëntie te waarborgen. Laatste, maar daarom niet minder belangrijk, het regeneratieproces moet worden verricht met een kap van de bioveiligheid aan elke besmetting te voorkomen.

Opgemerkt moet worden dat de spoeldouche processen die betrokken zijn bij het protocol van de regeneratie handmatig worden uitgevoerd, die zal onvermijdelijk leiden tot vooringenomenheid als gevolg van uiteenlopende personeel. Om deze beperking ondervangen, kunnen automatische of semi-automatische apparatuur voor het spoelen van de doeleinden aangepaste ontworpen, gezien de modulaire elektronische platen gebruikt. Het regeneratie-protocol is bovendien getest om effectief voor cel-gebaseerde testen. Echter in de aanwezigheid van sterke moleculaire interacties, zoals vorming van antilichaam-antigeen op het raakvlak van chips, de voorgestelde regeneratie voorwaarden kunnen worden beperkt tot een grote mate en relatief sterke buffer voorwaarden moeten worden beschouwd.

Globaal, is het huidige protocol van de regeneratie getest zodat het herhaalde gebruik van commerciële goud microchips, evenals andere geleidende elektroden zoals Au en glazig Koolelektroden. Wij verwachten dat de toepassing van dit protocol op de hoge lopende kosten van real-time chip gebaseerde cellen bespaart. Op de lange termijn, microchip gebaseerde testen worden steeds vaker gebruikt voor proteomic en mobiele analyse en het voorgestelde protocol in deze studie kan bieden een optie voor de regeneratie, in welke automatische of semi-automatische apparatuur voor spoelen zou kunnen worden ontworpen en toegepast in gevallen van geaccumuleerde wegwerp chips.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (U1703118), een project gefinancierd door de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu hogeronderwijs instellingen (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programma, Open fondsen van de sleutel staat Laboratorium voor Chemo/Biosensing en Chemometrie (2016015) en het nationale laboratorium van biomacromoleculen (2017kf05) en Jiangsu Specially-Appointed Professor project, China.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Stock reagents  reconstitution  Concentration used Storage
Apo-transferrin 10 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
N-acetyl cysteine 5 mg/mL in H2O  1:1,000 -20°C
Sodium selenite 2.5 mg/mL in H2O  1:25,000 -20°C
Collagen IV 200 μg/mL in PBS  1:100 -80°C
TGF-b2 20 μg/mL in PBS  1:10,000 -20°C
IL-34 100 μg/mL in PBS  1:1,000 -80°C
Ovine wool cholesterol 1.5 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparan sulfate 1 mg/mL in H2O 1:1,000 -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparin 50 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
Solutions  Recipe  Comments
Perfusion Buffer 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Use when ice-cold
Douncing Buffer 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Use when ice-cold
Panning Buffer 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
  2. Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
  3. Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
  4. Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
  5. Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
  6. Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  7. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  8. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
  9. Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
  10. Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
  11. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
  12. Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
  13. Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
  14. Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
  15. Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
  16. Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
  17. Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
  18. Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
  19. Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
  20. Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
  21. Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
  22. Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
  23. Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
  24. McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
  25. Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
  26. Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).

Tags

Biochemie kwestie 133 Label-vrije cel-gebaseerde assay regeneratie gekleed gouden microelectrodes real-time cel analyzer trypsine
Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong,… More

Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong, Y., Li, X., Chen, J., Wu, Y. Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer. J. Vis. Exp. (133), e56250, doi:10.3791/56250 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter