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Biochemistry

Régénération des microélectrodes or rangés, équipé d’un analyseur de cellule en temps réel

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56250
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1, 4
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit une stratégie générale pour régénérer des microélectrodes or déployèrent commerciales équipés pour un analyseur de cellules libres étiquette visant à économiser sur les haute marche frais ofmicrochip analyses. Le processus de régénération comprend la digestion trypsique, lavage à l’éthanol et l’eau et une étape de filature, ce qui permet une utilisation répétée des micropuces.

Abstract

Le test de base de cellules exempt d’étiquette est avantageux pour étude biochimique à cause de cela ne nécessite pas l’utilisation des animaux d’expérimentation. En raison de sa capacité à fournir des informations plus dynamiques sur les cellules dans des conditions physiologiques que les tests biochimiques classiques, cette analyse de cellules exempt d’étiquette en temps réel basée sur le principe de l’impédance électrique est d’attirer plus d’attention au cours des dernières décennie. Toutefois, son utilisation pratique peut être limitée en raison du coût relativement coûteux de la mesure, où coûteux consommables jetables or micropuces sont utilisés pour l’analyseur de la cellule. Dans ce protocole, nous avons développé une stratégie générale pour régénérer déployèrent microélectrodes or équipés d’un analyseur de commercial cellule exempte d’étiquette. Le processus de régénération comprend la digestion trypsique, lavage à l’éthanol et l’eau et une étape de filature. La méthode proposée a été testée et démontrée son efficacité pour la régénération et l’utilisation répétée des plaques électroniques commerciaux au moins trois fois, qui aidera les chercheurs enregistrer sur la cherté en cours d’exécution des essais sur des cellules en temps réel.

Introduction

Grâce à son efficace et moins fastidieux processus d’expérimentation, technologie exempte d’étiquette sur les cellules a connu une croissance rapide ces dix dernières années à des fins analytiques ainsi que la projection comme dans l’aspect de la protéomique1,2 , livraison3, etc.4,5 comparé avec des méthodes biochimiques traditionnelles visant à l’analyse cellulaire, analyse de cellules libres étiquette en temps réel avec le prototype développé par Giaever et collaborateurs précédemment6 de drogue est basé sur le principe de l’enregistrement des modifications du signal électrique sur la surface de la cellule-attachée puces électroniques, qui permettent une mesure continue de la croissance cellulaire ou de migration de manière quantitative. Suite à cette stratégie, une cellule en temps réel (RT-CES) système utilisant le principe de détection impédance électrique était introduite7,8 et, plus récemment, un analyseur commercial cellule en temps réel (RTCA) de détection électronique a été lancée laboratoire de recherche9.

L’analyseur de la cellule en temps réel commercial principalement lit les signaux évoqués LiPo de l’impédance électrique, entraînant des changements physiologiques des cellules couvés, y compris la prolifération cellulaire, migration, viabilité, la morphologie et l’adhérence sur le surface de micropuces10,11. Ces signaux électriques est également convertis par l’analyseur dans un paramètre sans dimension nommé la cellule Index (CI) pour évaluer l’état de la cellule. Le changement de l’impédance des micropuces reflète principalement l’environnement ionique des cellules couvertes à l’interface électrode/solution. Par conséquent, les performances analytiques de l’analyseur de cellules s’appuie fortement sur l’unité de détection de base, les micropuces jetables(p. ex., ce qu’on appelle plaques électroniques, par exemple, 96/16/8 puits), qui sont faites de microélectrodes or rangés lithographically imprimé au bas du puits de l’incubation. Des microélectrodes or assemblent sous forme de cercle en ligne (Figure 1) et couvrent la majeure partie de la surface des puits d’incubation, qui permettent une détection dynamique et sensible de cellules attachées3,12,13 ,,14. Le CI augmentera dans le cas de couverture plus de la surface des cellules sur la puce et diminue lorsque les cellules sont exposées à un substance toxique, aboutissant à l’apoptose. Bien que l’analyseur en temps réel cellulaire a été fréquemment utilisé pour déterminer la cytotoxicité11 et neurotoxicité15 et fournir plus d’informations cinétiques que la méthode classique de points de terminaison, les plaques électroniques jetables sont les plus coûteuses consommable.

Jusqu'à présent, il n’y a eu aucune méthodes disponibles pour la régénération de la plaque électronique, qui est probablement dû au fait que des conditions de régénération dure, comme solution de piranha ou acide acétique sont impliqués16,17, 18, qui peuvent altérer l’État électrique de puces or. Par conséquent, une méthode douce et efficace pour enlever les cellules adhérentes et autres substances de la surface des puces or sera souhaitable pour le processus de régénération de la plaque électronique. Nous avons récemment mis au point un protocole visant à la régénération des plaques électroniques jetables, utilisant des réactifs non corrosifs et les puces régénérées sont caractérisés par des méthodes électrochimiques ainsi qu’optique19. En utilisant des réactifs de laboratoire facilement disponible et modérée comme la trypsine et éthanol, nous avons établi une méthode générale pour régénérer la plaquette commerciale électronique sans entraîner d’effets indésirables, qui est appliquée avec succès pour régénérer les deux principaux types de la plaque électronique (16 et L8) utilisé pour RTCA.

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Protocol

Remarque : en général, le processus de régénération comprend la digestion trypsique et étape de rinçage à l’eau et l’éthanol. Le temps de digestion change selon le nombre de cellules utilisées et le type et le nombre de cellules utilisées peuvent différer selon les fins expérimentales. Il est conseillé de vérifier les micropuces régénérées à l’aide de méthodes optiques et électrochimiques afin d’optimiser les conditions de la régénération. Pendant l’expérience, produits chimiques solubles et insolubles peuvent être impliqués, et ici ces deux cas typiques des procédures de régénération sont détaillées.

1. préparation des Solutions de régénération

NOTE : Préparer et gérer toutes les solutions dans des conditions stériles.

  1. Préparer la nouvelle solution de trypsine de 0,25 % (g/v). La trypsine peut être achetée ou fraîchement préparée comme suit.
    1. Dissoudre 0,25 g de trypsine dans 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4.
    2. Agiter la solution jusqu'à ce que la trypsine est entièrement dissous à 4 oC. remuer la solution à basse vitesse, en prenant soin d’éviter toute formation de bulles.
    3. Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 µm dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques.
  2. Préparer 75 % d’éthanol à l’aide d’éthanol absolu. Verser 75 mL d’éthanol absolu dans une fiole jaugée et ajouter de l’eau désionisée jusqu'à ce que le volume s’élève à 100 mL. Effectuer une stérilisation supplémentaire si nécessaire.

2. l’incubation et la prolifération des cellules A549 en plaques électroniques

Remarque : La plaque électronique types 16 et L8 sont tous deux fabriqués de microélectrodes or rangés, lithographically imprimés au bas du puits de l’incubation. Plaque électronique 16 a 16 puits, tandis que la plaque électronique L8 a 8 puits. Les puits de la plaque électronique 16 sont rondes alors que les puits de la plaque électronique L8 sont rectangles arrondis. Le volume de chaque plaque électronique 8 est bien environ 830 µL et chaque plaque électronique 16 est bien environ 270 µL.

  1. Culture de cellules A549
    1. Plat de pénicilline-streptomycine dans la culture de cellule cellules A549 en culture dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 %.
    2. Les cellules de passage lorsque la densité cellulaire ~ 75 % puis laver la couche de cellules adhérentes avec 1 × PBS et trypsinize avec la solution de trypsine de 0,25 % pendant 1 min à 37 oC. centrifuger les cellules à 179 × g pendant 5 min enlever la trypsine. Remettre en suspension les cellules dans 10 mL de milieu pour mise en culture ou autres expériences.
      Remarque : La solution de cellules resuspendues dans le milieu est ici désignée comme le tampon de suspension cellulaire.
    3. Retirez 10 µL et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Utiliser le milieu RPMI-1640 à diluer davantage la mémoire tampon de suspension cellulaire pour préparer le tampon de suspension cellulaire 30 000-80 000 cellules/mL pour les expériences.
  2. Prolifération/cytotoxicité experiment et acquisition de données
    1. Ajouter (50 µL 150 µL pour plaque électronique L8) cellule de milieu à chaque incubation puits de la plaque électronique 16 et laisser pendant 30 min dans la prévention des risques biotechnologiques hotte pour l’équilibration. Insérer manuellement la plaque électronique 16 dans l’analyseur en temps réel de cellules dans un incubateur à 37 oC. CO2
    2. Lancez le programme d’opération analyseur portable en temps réel sur l’ordinateur. Sur sa valeur par défaut expérimenter page de configuration de modèle, sélectionnez « Expérience modèle » et nommez le test en cours d’exécution.
    3. Dans sa mise en page, sélectionnez les puits correspondants qui figurent dans l’expérience et de saisir l’information comme les noms de type et nombre de drogues de la cellule dans les zones d’édition. Sur sa page d’annexe, ajouter les étapes expérimentales, puis sélectionnez le temps d’exécution (p. ex., 12, 24 ou 48 heures) de chaque étape et l’intervalle d’acquisition des données en temps réel.
      Note : Ici, l’intervalle de l’étape 1 et 2 sont 1 min et 15 min après.
    4. Enregistrez le fichier et cliquez sur le bouton « Start » pour mesurer l’impédance de fond des médias sur sa page d’Index de la cellule ; les données obtenues seront automatiquement déduites. Sur sa page bien graphique, toutes les courbes bien peuvent être visités. Sur sa page d’intrigue, ajoute wells et le graphique de l’index de temps-cellule seront affichera.
    5. Pour l’expérience de la prolifération cellulaire, tout d’abord cliquez sur le bouton « Pause » pour interrompre le programme. Puis retirez la plaque électronique et ajouter 100 µL A549 cellule suspension de tampon / puits à température ambiante. Laisser la plaque pendant 30 min dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques pour laisser les cellules se déposent au fond du puits de l’incubation.
    6. Insérer manuellement la plaque électronique dans la station d’analyseur portable en temps réel. Cliquez sur le bouton « Démarrer » pour poursuivre l’expérience.
      Remarque : Sur la page de l’intrigue, l’analyseur en continu enregistre courbes tout au long de l’expérience ou les valeurs d’Index de la cellule.
    7. Lorsque l’expérience est terminée, accédez à la page de l’intrigue et ouvrez le fichier de l’expérience. Puis sélectionnez tous les puits testés d’incubation et les courbes de cellule Index résultantes peuvent être en moyenne ou normalisées pour la dernière fois avant d’ajouter des produits pharmaceutiques ou changer de milieu afin de réduire les variations entre les essais. Sur la page d’analyse des données, CE50 ou CI50 peut être calculée

3. régénération des plaques électroniques

Remarque : Pour chaque étape de rinçage, la solution de la plaque électronique était bien mélangée (5 à 10 fois) à l’aide d’une pipette.

  1. Cas 1 : pour l’évaluation de la cytotoxicité des anti -médicament contre le cancer
    1. Cellules A549 de semences sur la plaque électronique tel que décrit à l’article 2.
    2. Dissoudre d’abord le chlorhydrate de doxorubicine anticancéreux (DOX) dans le milieu cellulaire. Ajouter lentement DOX aux cellules (concentration finale de DOX est 30 µg/mL) à l’aide d’une pipette. Enregistrer le CI tel que décrit à l’article 2.
      Remarque : La plaque électronique utilisée est régénérée immédiatement après que cette expérience soit complète. Dans ce cas, comme DOX est un produit chimique soluble, la régénération de la plaque électronique suivant le protocole est relativement facile à manipuler, et aucune des étapes supplémentaires ne sont nécessaires.
    3. Régénération
      1. Sortez la plaque électronique contenant des cellules de la gare d’analyseur portable en temps réel. Placer la plaque électronique utilisée dans une hotte de biosécurité stérile à la température ambiante et mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette de milieu de culture. Pipetter tous le moyen.
      2. Rincer les plaques électroniques avec de l’eau 200 µL d’eau désionisée pendant 3 fois à température ambiante.
      3. Digérer les cellules restantes sur les plaques électroniques avec la trypsine 0,25 % fraîchement préparé pendant 1-2 h (200 µL/puits) dans un incubateur à 37 oC. Une fois la digestion terminée, mélanger la solution d’incubation 5 - 10 fois en utilisant une pipette et la pipette sur toute la solution dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques à la température ambiante.
      4. Rincer les plaques électroniques avec 200 µL éthanol et 200 µL d’eau, respectivement, comme suit : eau désionisée 2 fois, 100 % éthanol 2 fois ; 75 % éthanol 2 fois ; eau désionisée 2 fois. Il faut inverser la plaque électronique sur une gaze stérile ou un papier de soie de décanter l’eau à température ambiante.
      5. Rayons ultraviolets stérilisent la plaque électronique régénérée pendant 1-2 h dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques à la température ambiante.
        NOTE : Doubler le volume de toutes les solutions pour la régénération de la plaque électronique L8.
  2. Cas 2 : administration de médicaments à l’aide de matériaux mésoporeux.
    1. Utiliser des matériaux de silice mésoporeuse bâtonnet avec une porosité moyenne de 5,6 nm comme matrices de livraison de médicaments, comme indiqué précédemment20.
      NOTE : Ici, la plaque électronique a été utilisée pour contrôler l’effet de médicaments à libération sur les cellules.
      1. Ajouter des matériaux mésoporeux dans la solution d’incubation de chaque puits des plaques électroniques. Comme matériaux de silice ne sont pas solubles et précipité dans la plaque électronique, rincez la plaque comme suit :
    2. Effectuez les étapes 3.1.3.1-3.1.3.3 comme pour le cas 1.
    3. Rincer les micropuces avec 200 µL désionisée eau une fois dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques à la température ambiante.
    4. Rincer les puces électroniques à l’éthanol absolu de 200 µL 2 fois à température ambiante.
    5. Rincer les micropuces avec 200 µL 75 % d’éthanol une fois à température ambiante.
    6. Ajouter 250 µL d’éthanol 75 % dans chaque puits et sceller la plaque électronique avec le film à température ambiante.
    7. Tourner à 114 x g pendant 2 min et vider la plaque électronique. Il faut inverser la plaque électronique sur une gaze stérile ou un papier de soie de décanter l’eau à température ambiante.
    8. Répétez l’étape 3.2.5-3.2.7 une fois.
    9. Rayons ultraviolets stérilisent la plaque électronique régénérée pendant 1-2 h dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques à la température ambiante.
      NOTE : Doubler le volume de solution tous lorsque rinçage L8 plaques électroniques.

4. Evaluation de l’effet de régénération

  1. Caractéristiques optiques de la surface de la plaque électronique régénérée
    1. Utiliser un acier cuiller pour démonter soigneusement la partie inférieure de l’incubation bien des produits frais et régénéré la plaque électronique qui contient des rangées microélectrodes or. Porter un gant en plastique, essuyez soigneusement la partie micropuce contenant de la plaque électronique à l’aide de la cuillère en acier.
    2. Placez les deux pièces au centre des lames de verre et collecter les spectres Raman résultants de Microscope Raman équipé d’un détecteur de CCD21.
      Remarque : Le spectromètre était équipé d’un laser à 633 nm et les spectres a été enregistré à un intervalle de 30 s laser l’exposition à une longueur d’onde de l’ordre de 500-3500 cm-1. Les images optiques ont été obtenues par un Microscope Raman à l’aide d’un objectif d’oculaires 10 x et 50 x objectif. Figure 1 a et 1 de la Figure sont aussi obtenues à l’aide de l’appareil de Microscope Raman installé.
    3. Afin d’évaluer la viabilité de cellules attachées après absorption de médicament anticancéreux sur la fraîche et régénérée plaques électroniques, utilisez un confocal laser microscope à balayage pour surveiller la fluorescence spontanée de DOX molécules absorbées par A549.
      1. Pour enregistrer la fluorescence spontanée de DOX absorbé par les cellules (fraîche et régénérée électronique plaques avec cellules A549), utilisation un 63 X d'huile objective et 485 nm comme la longueur d’onde d’excitation.
  2. Comportement électrochimique d’électrodes régénérées
    Remarque : Comme manuel de dissimulation d’une plaquette commerciale électronique est difficile et n’est pas idéal pour l’évaluation de l’État électrique surface que vérifié, l’efficacité de la régénération du protocole a été évaluée en utilisant l’électrode de carbone vitreux/or normal (GCE) comme test plateforme, sur laquelle la spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE) a été réalisée. Le diamètre de l’électrode de l’UA et la CME est 3 mm. électrochimique ces données ont été obtenues par un analyseur électrochimique avec un système de trois électrodes et les mesures d’impédance ont été réalisées à l’aide d’un signal de courant alternatif (AC) d’une amplitude 10 mV à une large bande passante de 100 kHz à 0,01 Hz.
    1. Avant la mesure, polir l’électrode Au et la CME à une surface réfléchissante, avec un coulis d’alumine sur un chiffon à lustrer, suivie par sonication dans l’eau pour enlever toutes les particules.
    2. Activer l’électrode Au 0,5 M H2SO4. Obtenir des données d’étude d’impact environnemental de l’électrode Au nu et la CME dans 10 mM solution d’électrolyte KCl contenant 1mM K3[Fe(CN)6] comme décrit22.
    3. Préparer la solution mère de cellules A549 selon 2.1.2 et 2.1.3. Déposer 10 µL de la suspension cellulaire à la surface de l’électrode de l’UA et de la CME. Incuber les électrodes Au et GCE modifiés avec des cellules dans un incubateur à C o37 pendant 3 h données EIS obtenir de l’électrode Au et GCE modifiée avec les cellules 10 mM solution d’électrolyte KCl contenant 1 mM K3[Fe(CN)6].
    4. Régénérer les électrodes à l’aide du protocole et la mesure EIS.
      1. Plonger l’électrode Au et GCE modifié avec cellules à 0,25 % de trypsine pour 0,5 à 2 h. Rincer l’électrode Au et la CME doucement avec de l’eau 4 fois. Rincer les électrodes doucement avec de l’éthanol absolu 4 fois. Plonger l’électrode Au et GCE dans 75 % éthanol pendant environ 5 min. Rincer les puces doucement avec de l’éthanol 75 % 4 fois.
      2. Obtenir des données EIS d’électrode Au régénérée et la CME dans la solution d’électrolyte KCl 10 mM contenant 1mM K3[Fe(CN)6].

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Representative Results

Propriétés de surface des puces or: les procédures de régénération utilisées dans le présent protocole ont été décrits dans la Figure 1. La figure 2 montre le microscopique surface des images des produits frais et régénéré plaques électroniques par le microscope optique. Comme illustré à la Figure 2 a et 2 de la Figure, microscopique observations ont révélé qu’il y a pratiquement aucune différence dans les propriétés optiques de la puce de surface entre frais et traités plaques électroniques. En utilisant la fluorescence spontanée des molécules de doxorubicine inclus dans les cellules de pratiques pour l’évaluation de l’état de la cellule, nous avons observé une homogénéité similaire de cellules cultivées sur les puces or après la régénération (Figure 2 b et Figure 2D ). En outre, les cellules cancéreuses couvés affichent une morphologie cellulaire bien définie dans la plaque électronique démontrant la réutilisabilité des puces. La figure 3 montre le Raman spectres des plaques électroniques fraîches et régénérées. Les distributions de pic Raman pratiquement identiques entre les plaques électroniques fraîches ou traitées indiquent un processus de régénération réussie de la surface de la puce or. Les signaux Raman électronique plaques recouvertes de cellules A549 furent déformées dans une certaine mesure, probablement en raison de l’interférence de la fluorescence spontanée des cellules A549.

Régénéré de puces pour le test de cytotoxicité en utilisant RTCA : Nous avons également appliqué le protocole de régénération pour un test de cellule prolifération et matériel evaluation de la cytotoxicité (Figure 4). Les cellules A549 de densité optimale ont été ensemencés sur la plaque électronique régénérée 16 et courbes de cinétique de croissance ont été enregistrées par l’analyseur de cellules en temps réel. Comme illustré à la Figure 4 a, toutes les courbes de croissance qui en résulte des parallèles puits expérimentaux ont montré la consistance adéquate, qui a indiqué que l’État électrique surface de plaque électronique 16 est grandement conservée après la régénération. La plaque électronique régénérée L8 a également été testée pour la cytotoxicité à l’aide de matériaux de silice mésoporeuse, comme illustré à la Figure 4 b. Par rapport à l’expérience de contrôle, le CI d’échantillons de traitement des matériaux mésoporeux a diminué dans une certaine mesure, indiquant une faible cytotoxicité des matériaux. Autre encapsulation et la libération du médicament anticancéreux de Dox par des matériaux mésoporeux provoqua une diminution dramatique de la courbe de croissance de A549. Ces résultats expérimentaux ont montré la cohérence avec l’aide des plaques électroniques fraîches et avec celles rapportées antérieurement19, qui a vérifié l’efficacité du présent protocole proposé de régénération.

Efficacité de régénération évaluée par des méthodes électrochimiques : Commercial Au électrodes et électrodes de carbone vitreux ont été utilisés comme plateformes de test pour l’évaluation de l’efficacité de la régénération. La figure 5 montre les électrodes de l’étude d’impact environnemental de l’UA et la CME qui ont été modifiés avec les cellules cancéreuses. On a montré que, après une incubation de cellules A549 sur l’électrode, une augmentation évidente de la résistance de transfert électronique (retraité) a été observée par rapport à celle des électrodes nues. La retraité a été fortement diminuée après que l’électrode Au et la CME ont été traités selon le protocole à la Figure 5. Les changements semblables de Ret de l’électrode Au et la CME ont indiqué une régénération efficace et universelle des micropuces au sujet de leurs propriétés électriques de la surface.

Figure 1
Figure 1 : le processus de régénération des plaques électroniques. Une régénération typique exécute, quatre grandes étapes ont participé notamment en incubant les cellules ainsi que leur détachement à la surface des plaques électroniques, suivie du rinçage, essorage et étapes de stérilisation ultraviolet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : les propriétés de surface des plaques électroniques. (A) nouvelles plaques électroniques cellules A549 (B) ont été cultivées sur a. (C) Regenerated électronique plaques A549 (D) , les cellules ont été cultivées sur C. Dans le cas de cellules attachées sur puces or, DOX a été utilisé. Figure 2 a et 2 de la Figure ont été modifiés de Xu, Z. et al. 19 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : spectre Raman de différents traités plaques électroniques. (A) nouvelle plaque électronique. (B) nouvelle plaque électronique ensemencée avec des cellules A549. (C) régénéré la plaque électronique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : courbes de croissance de cellules A549 sur trois fois les plaques électroniques régénérées. (A) les courbes de croissance parallèle des cellules ensemencées sur plaque électronique 16. Test de cytotoxicité (B) des matériaux de silice mésoporeuse sur plaque électronique L8 avec barres d’erreur (écart-type, STD) des courbes enregistrées de chaque incubation bien. Figure 4 a a été modifié par Xu, Z. et al. 19 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Spectre d’impédance électrochimique de différents modifiés électrodes en or et des électrodes de carbone vitreux (GCE) à 10 mM de solution d’électrolyte KCl contenant 1 mM K3[Fe(CN)6]. (A) différents traités électrodes UA. (B) les différents traités GCE. Figure 5 a a été mis à jour le fromXu, Z. et al. 19 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Application de la puce Tampon de régénération Stratégie de régénération
Résonance plasmonique de surface (SPR) Solution de Piranha (concentré H2SO430 % H2O2 = 3:1, v/v)17 dépouiller l’analyte et la sonde basée sur l’oxydation forte
Capteurs piézoélectriques MICROCONSOLE (SEMP) Glycine-HCl mélange23,24 dissocier le complexe de la sonde de la cible et l’éliminer de l’analyte
Fortes concentrations en sel solution (2M MgCl2 + 1,5 M Tris)25
Film d’or 50mM KOH + 25 % H2O226 Composés organiques oxydés

Tableau 1 : Un bref résumé des stratégies de régénération signalés.

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Discussion

Nous avons résumé plusieurs méthodes disponibles17,23,24,25,26 pour régénérer les micropuces dans le tableau 1. Fondamentalement, ces méthodes impliqués relativement rudes conditions expérimentales pour atteindre la régénération complète de puces à cause de la présence d’interactions molécules molécule forte telle que celle du complexe immunitaire utilisé pour les puces de la SPR. Toutefois, ces rudes conditions expérimentales peuvent être extrêmement nocifs pour les propriétés de surface des rangées puces or utilisés dans RTCA. Par conséquent, une méthode douce et efficace ont été les principales considérations dans l’élaboration de la stratégie de régénération présenté. D’autres facteurs qui sont tout aussi importantes sont les préoccupations environnementales, puisque ces micropuces jetables sont fréquemment utilisés ainsi que de cellules cancéreuses ciblées.

Dans ce protocole, nous présentons une méthode générale pour régénérer commerciales déployèrent puces or utilisés pour RTCA. Notre protocole a été développé selon la digestion trypsique et rinçage à l’eau et l’éthanol. Étapes de rotation supplémentaire sont considérés comme efficaces pour éliminer les particules insolubles utilisés pour le test pour le processus de régénération. En comparaison avec les réactifs utilisés dans les méthodes rapportées antérieurement, la trypsine réactifs et l’éthanol sont facilement disponibles pour utilisation en laboratoire tous les jours et ces produits biologiques/chimiques sont peu toxiques et sont donc considérées comme respectueux de l’environnement, qui est souhaitable aux fins de la régénération.

Dans ce protocole, l’étape critique est la digestion trypsique pour assurer l’exécution de régénération des puces or. L’optimisation de la trypsinisation, y compris la concentration et du temps, devrait être la première priorité pour atteindre la régénération. Sans compter que le temps de digestion qui est rationalisé dans notre précédent rapport19, une bonne évaluation pour le processus d’optimisation est simplement pour vérifier les propriétés de surface à l’aide d’un microscope optique.

Une autre préoccupation est la manipulation des puces pendant le processus de régénération. Comme une pipette est fréquemment utilisée dans les expériences, attention devrait être rémunérée par le personnel pour éviter d’égratigner la pointe sur la surface des puces. En outre, il est utile de stériliser avant les conseils, gaze et cuillère pour assurer l’efficacité de la régénération. Enfin et surtout, le processus de régénération doit être pratiquée sur une hotte de sécurité biologique pour éviter toute contamination.

Il est à noter que les rinçage processus impliqués dans le protocole de régénération sont effectuées manuellement, qui provoquera inévitablement biais dû à différentes du personnel. Pour contourner cette limitation, les équipements automatiques ou semi-automatiques pour le rinçage des fins pourraient être personnalisé conçu, considérant les plaques électroniques modulaires utilisés. En outre, le protocole de régénération a été testé pour être efficace pour des analyses cellulaires. Toutefois, en présence de fortes interactions moléculaires, tels que la formation d’anticorps-antigène à l’interface de jetons, les conditions de régénération proposée peuvent être limitées dans une large mesure et des conditions relativement forte tampon sont à considérer.

Dans l’ensemble, le protocole actuel de régénération a été testé afin de permettre l’utilisation répétée de puces or commerciales, ainsi que d’autres électrodes conductrices comme UA et électrodes de carbone vitreux. Nous espérons que l’application de ce protocole permettra d’économiser sur le coût élevé en cours d’exécution des essais sur des cellules de puce en temps réel. À long terme, essais de micropuces devenant plus fréquemment utilisées pour l’analyse protéomique et cellulaire et le protocole proposé dans cette étude peut offrir une option de régénération, dans lesquelles l’équipement automatique ou semi-automatique pour rinçage pourrait être conçue et appliquées en cas de puces jetables accumulés.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le travail a été soutenu par Natural Science Fondation nationale de Chine (U1703118), un projet financé par le fonds ouverts de la clé de l’état de priorité académique programme développement de Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programme Laboratoire de chimio/biodétection et chimiométrie (2016015) et le Laboratoire National de Biomacromolecules (2017kf05), professeur de Jiangsu Specially-Appointed projet, Chine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Stock reagents  reconstitution  Concentration used Storage
Apo-transferrin 10 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
N-acetyl cysteine 5 mg/mL in H2O  1:1,000 -20°C
Sodium selenite 2.5 mg/mL in H2O  1:25,000 -20°C
Collagen IV 200 μg/mL in PBS  1:100 -80°C
TGF-b2 20 μg/mL in PBS  1:10,000 -20°C
IL-34 100 μg/mL in PBS  1:1,000 -80°C
Ovine wool cholesterol 1.5 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparan sulfate 1 mg/mL in H2O 1:1,000 -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparin 50 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
Solutions  Recipe  Comments
Perfusion Buffer 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Use when ice-cold
Douncing Buffer 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Use when ice-cold
Panning Buffer 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. 

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References

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Essai libre Label basés sur les cellules de biochimie numéro 133 régénération arrayed microélectrodes or analyseur de cellules en temps réel la trypsine
Régénération des microélectrodes or rangés, équipé d’un analyseur de cellule en temps réel
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Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong, Y., Li, X., Chen, J., Wu, Y. Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer. J. Vis. Exp. (133), e56250, doi:10.3791/56250 (2018).

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