Summary
Her beskriver vi en letkøbt forberedelse af chitosan-baserede injicerbare hydrogels ved hjælp af dynamiske imine kemi. Metoder til at justere den hydrogel mekanisk styrke og dens anvendelse i 3D cellekultur præsenteres.
Abstract
Protokollen præsenterer en letkøbt, effektiv og alsidig metode for at forberede chitosan-baserede hydrogels ved hjælp af dynamiske imine kemi. Hydrogel er fremstilles ved at blande løsninger af glycol chitosan med en syntetiseret benzaldehyd opsagt polymer gelator, og hydrogels fremstilles effektivt i flere minutter ved stuetemperatur. Af varierende forhold mellem glycol chitosan, polymer gelator og vand indhold, er alsidig hydrogels med forskellige gellation gange og stivhed opnået. Når beskadiget, kan hydrogel inddrive sine optrædener og modulus, på grund af reversibilitet af de dynamiske imine obligationer som crosslinkages. Denne selvstændige healable egenskab aktiverer hydrogel skal injicerbar, da det kan være selvstændige helbredt fra klemt stykker til en integreret bulk hydrogel efter injektion proces. Hydrogel er også flere modtagelig hen til mange bio-aktive stimuli på grund af forskellige ækvilibrering statusser for dynamisk imine obligationer. Denne hydrogel blev bekræftet som bio-kompatible, og L929 mus fibroblastceller blev integreret følgende standardprocedurer og celleproliferation var let vurderet af en 3D celle dyrkning proces. Hydrogel kan tilbyde en justerbar platform for forskellige forskning hvor en fysiologisk efterligner af et 3D miljø for celler er nydt. Sammen med sin multi lydhør, selv healable og injicerbar egenskaber, kan hydrogels potentielt kunne anvendes som flere luftfartsselskaber for lægemidler og celler i fremtidige bio-medicinske anvendelser.
Introduction
Hydrogels er krydsbundet polymer materialer med store mængder vand og bløde mekaniske egenskaber, og de har været brugt i mange bio-medicinske programmer1,2. Hydrogels kan tilbyde en blød og våde miljø, som er meget lig de fysiologiske omgivelser for celler i vivo. Derfor er hydrogels blevet en af de mest populære stilladser for 3D celle kultur3,4. I forhold til 2D petriskål cellekultur, har 3D cellekultur avancerede hurtigt for at tilbyde en ekstracellulære matrix (ECM) efterlignede mikromiljø for cellerne til at kontakte og samle for spredning og differentiering formål5. Derudover kunne hydrogels indeholdende naturlige polymerer tilbyde bio-kompatible og fremme miljøer for celler til at formere sig og differentiere3. Hydrogels stammer fra syntetiske polymerer er at foretrække for deres enkle og klare komponenter, som udelukker komplekse påvirkninger som animalsk oprindelse proteiner eller virus. Blandt alle hydrogel kandidater til 3D cellekultur er hydrogels, der er let at tilberede og har en konsekvent ejendom altid foretrukket. Mulighed for at justere den hydrogel egenskaber til at passe forskellige forskningsbehov er vigtigt som godt6.
Her vil vi præsentere en letkøbt forberedelse af en glykol chitosan-baserede hydrogel ved hjælp af dynamiske imine kemi, som bliver en alsidig hydrogel platform for 3D celle kultur7. I denne metode anvendes velkendte bio-kompatible glycol chitosan at etablere rammer for hydrogel's netværk. Dens amino grupper er reageret med et benzaldehyd opsagt polyethylenglycol som polymer gelator at danne dynamisk imine obligationer som crosslinkages af hydrogels8. Dynamisk imine obligationer kan danne og nedbrydes reversibelt og lydhørt til omgivelserne, tilføre hydrogels med mekanisk indstillelig crosslinked netværk9,10,11. På grund af sin høje vand indhold, bio-kompatible materialer og justerbar mekaniske styrker er hydrogel anvendt med succes som et stillads til L929 celler i 3D celle kultur12,13. Protokol her beskriver de procedurer, herunder polymer gelator syntese, hydrogel forberedelse, integrering af celle og 3D celle dyrkning.
Hydrogel viser også flere andre funktioner på grund af dens dynamiske imine crosslinkages, herunder dens multi lydhør over for forskellige bio-stimuli (syre/pH, vitamin B6 afledte pyridoxal, protein papain, etc.), der angiver, at hydrogel kunne være induceret for at nedbrydes under fysiologiske forhold8. Hydrogel er også selv healable og injicerbar, hvilket betyder hydrogel kunne administreres via en minimal invasiv injektion metode og få en fordel i stof og celle leverancer14,15. Ved at tilføje funktionelle tilsætningsstoffer eller specifikke foruddesignede polymer gelators, hydrogel er kompatible hen til opnå specifikke egenskaber ligesom magnetisk, temperatur, pH lydhør, etc.16,17, som kunne opfylde et bred vifte af forskningsbehov. Disse egenskaber afsløre den hydrogel potentielle kapacitet til at være en injicerbar flere luftfartsselskaber for lægemidler og celler i både in vitro og i vivo bio-medicinske forskning og anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
forsigtighed: Rådfør dig med alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Skal du bruge passende sikkerhedspraksis ved udførelse af kemi eksperimenter, herunder brug af et stinkskab og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, beskyttende handsker, laboratoriekittel, osv.). Protokollen kræver standard celle håndtering teknikker (sterilisering, celle opsving, celle passaging, celle frysning, celle farvning, etc.).
1. forberedelse af Hydrogels
- syntese af benzaldehyd opsagt di-functionalized polyethylen glycol (DF PIND)
- pre udtørring af PLØK polymer
- vejer 4.00 g PIND (MW 4.000, 1.00 mmol), overføre det ind i en rund bund kolbe (250 mL), og tilføje toluen (100 mL).
Bemærk: Andre pinde med forskellig Molekylær vægt kan arbejde for hydrogel dannelse, men vil føre til forskellige stivhed. - Opvarmes opløsningen af en varmepistol (eller en varmeplade omkring 40 ° C) mildt at hjælpe opløse alle polymerer. Når alle polymerer opløses, bruge en fordamper til at fjerne alle opløsningsmidler. Gentag dette opløses og tørre processen to gange for at gøre den tørrede PIND polymerer.
Forsigtig: Dette skal udføres i et stinkskab med ekstrem omhu. Toluen er brandfarligt.
- vejer 4.00 g PIND (MW 4.000, 1.00 mmol), overføre det ind i en rund bund kolbe (250 mL), og tilføje toluen (100 mL).
- Benzaldehyd opsigelse reaktion af PIND
- Kolben tilsaettes en magnetomrører og tetrahydrofuran (THF, 100 mL) og opløse PIND ved hjælp af en omrører. Tilføje 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) og 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) sekventielt til løsninger til at opløse alle legemer helt.
- Tilføj N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) til løsningen, og tilføje en tørring rør, der er fyldt med vandfri CaCl 2 kolben. Holde reaktion under omrøring ved stuetemperatur (~ 20 ° C) for omkring 12 h.
- Efter reaktionen proces
- bortfiltrere de hvide legemer genereret i løsning af vakuum efter reaktionen er færdig. Hæld opløsningen i kolde diethylether (500 mL) under omrøring for at faelde de hvide legemer. Indsamle alle de hvide legemer af filter og tørre faste stoffer i et stinkskab.
- Opløses de hvide legemer i THF igen, filter til at udelukke enhver uopløselige hvide legemer, hæld opløsningen i frisk kold diethylether at udfælde de hvide legemer og tørre det. Gentag denne proces to til tre gange, og derefter placere de hvide legemer i et vakuum tørring ovn (20 ° C, 0,1 mbar) til at tørre dem helt. Indsamle de hvide pulver som det endelige produkt: benzaldehyd opsagt DF PIND.
- pre udtørring af PLØK polymer
- Udarbejdelse af hydrogels
- vejer forskellige mængder af DF PIND (0,11 g, 0,028 mmol 0,22 g 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) i en tube (10 mL), der tilsættes deioniseret vand (5,0 mL) og bruge en vortex eller magnetomrører til at hjælpe opløse polymeren.
- Opløses glycol chitosan (0.495 g, 6.18 x 10 -3 mmol) i ionbyttet vand (15,0 mL) i et rør (50 mL), og bruge en vortex i et par minutter til at homogenisere chitosan løsning (3 wt %).
- Tilføje glycol chitosan løsning (0,2 mL, 3 wt %) og DF PIND løsninger (0,2 mL) sekventielt i en tube (2,0 mL). Bruge en vortex for at blande løsninger administrationsprocedurerne til form hydrogels i flere minutter. Følg nøgletal i tabel 1 for at hydrogels af forskellige mekaniske styrker.
Bemærk: Bruge metoden invertering af rør til at afgøre, om hydrogel har allerede dannet.
- Reologi analyser
- foretage reologi analyser på en roterende rheometer med en parallel stålplade (diameter: 20 mm). Gellation testen, spredes glycol chitosan løsning (0,2 mL, 3 wt %) på en lavere plade. Derefter tilsættes DF PIND vandige opløsninger (0,2 mL, 2 wt %) jævnt dråbevis chitosan løsning overfladen og blande med en pipette hurtigt. Lavere ned den øverste plade og begynde at test.
- For hydrogel ' s stivhed test, skåret en hydrogel i en cirkel (diameter: 20 mm) og måle opbevaring modulus (G ') værdier kontra frekvens analyser på 1% belastning. Typiske G ' værdier på 6,3 rad s − 1 er angivet i tabel 1.
Bemærk: Foretage reologi analyser af hydrogel 0,5 h efter hydrogel dannelsen at sikre dynamiske bond stabilisering af hydrogel. - For hydrogel ' s selvstændig healable ejendom test, skåret en hydrogel til stykker og samle brikkerne til self-heal til en integreret brik. Derefter skæres hydrogel stykke for at gøre en cirkel (diameter: 20 mm) og sætte det på rheometer til at udføre reologi analyse.
2. 3D celle dyrkning i Hydrogels
- forberedelse af hydrogel gellation løsninger
- vejer DF PLØK (0,44 g, 0,11 mmol) i en steril tube (4,0 mL), tilføje i celle kultur medier (RPMI-1640, 2.0 mL), og bruge en vortex eller omrører til at hjælpe opløse polymer for at opnå polymer løsningen (20 wt %). Indlæse løsningen i en sprøjte (10,0 mL) og derefter sterilisere det ved, at det gennem en micron bakterier-retentive filter (0,22 µm).
- Vejer glycol chitosan (0.165 g, 2,06 x 10 -3 mmol) i en steril tube (15,0 mL), tilføje i celle Kulturmedier (RPMI-1640, 4,0 mL) og vortex at hjælpe opløse polymer for at opnå glycol chitosan løsning (4.0 wt %). Indlæse løsningen i en sprøjte (10,0 mL) og filtrere det med en 0,22 µm bakterier-retentive filteret.
- Celle dyrkning i hydrogels
forsigtighed: udføre alle celle beslægtede procedurer i en vævskultur hætte. Grundlæggende kendskab til steril teknik forventes.- Udarbejdelse af cellesuspension
- kultur L929 celler i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS, 5% penicillin (10 mL) i en Petri parabol (diameter 10 cm), og der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2. Ændre medium hver dag inden brugen.
- Høst L929 cellerne med PBS, som indeholder trypsin (0,025 w/v %) og EDTA (0,01% w/v), derefter centrifugeres (70 x g, 5 min) og genopslæmmes celler i RPMI-1640 medium (1,0 mL). Udføre celle optælling ved hjælp af standard drift af blod-optælling board. Cellerne for at justere den celle koncentration til genopslæmmes ~ 3.75 × 10 6 celler/mL.
- Celle indkapsling i hydrogels
- Mix L929 celle suspensioner (0,4 mL, 3,75 x 10 6 celler mL -1) med glykol chitosan løsning (0,4 mL) i et rør (4,0 mL) af vortex. Der afpipetteres L929/glycol chitosan løsning (0,8 mL) i midten af en Konfokal petriskål (diameter 2,0 cm). Afpipetteres DF PIND løsninger (0,2 mL) i den samme skål, og forsigtigt afpipetteres for at blande opløsningen og fremkalde hydrogel dannelse.
Bemærk: Vurdere hydrogel dannelse ved at vippe petriskålen. - For direkte cellekultur, tilføje ekstra mængder af RPMI-1640 kultur medier (1,0 mL) oven på hydrogel. Sætte celle indlejret hydrogels (1,0 mL, 1,5 wt % glycol chitosan, 4.0 wt % DF PIND, 1,5 × 10 6 celler mL -1) i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) og ændre mediet hver dag. Forberede celle imaging på dag 1, 3, 5 og 7 efter celle indkapsling.
- Mix L929 celle suspensioner (0,4 mL, 3,75 x 10 6 celler mL -1) med glykol chitosan løsning (0,4 mL) i et rør (4,0 mL) af vortex. Der afpipetteres L929/glycol chitosan løsning (0,8 mL) i midten af en Konfokal petriskål (diameter 2,0 cm). Afpipetteres DF PIND løsninger (0,2 mL) i den samme skål, og forsigtigt afpipetteres for at blande opløsningen og fremkalde hydrogel dannelse.
- For 3D efter cellekultur i hydrogels efter injektion, forberede celle indlæst hydrogel (1,0 mL, se trin 2.2.2) i en sprøjte (10,0 mL, 48 G nål). Efter hydrogel former, injicere hydrogel langsomt i en petriskål for Konfokal billeddannelse. Tilføje et ekstra beløb af kultur medier (1,0 mL) oven på hydrogel og ændre det hver dag. Sætte petriskålen i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) og forberede imaging bagefter.
Forsigtig: Kontroller og følg sikkerhed operation protokol af en sprøjte.
- Udarbejdelse af cellesuspension
- Celle levedygtighed og analysen
- Konfokal observation
- Skylles hydrogels med PBS (1,0 mL) for to gange. Pletten hydrogels med Fluorescein diacetat (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) og propidium Iodid (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) løsninger til 15 min. Efter farvning, fjerne alle opløsningsmidler.
- Overholde hydrogels ved hjælp af en Konfokal mikroskop under excitation bølgelængder af 488 nm og 543 nm at visualisere live og døde celler, henholdsvis. Tage z-stakke gennem hver 2 µm dybde af hydrogels til at validere en jævn fordeling af celler i hele.
Bemærk: FDA pletter levende celler, mens PI pletter døde celler.
- Nedbrydes hydrogel (1,0 mL) med eddikesyre (HAc, 3 v %, 1,0 mL) til 5 min og pipette til en tube (4,0 mL). Indsamle celler af centrifuge (70 x g, 5 min) og genopslæmmes celler i RPMI-1640 cellekulturmedium (1,0 mL). Foretage celle optælling ved hjælp af en blod tælle bestyrelsen.
- Konfokal observation
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk præsentation af denne protokol på hydrogel forberedelse og dens brug som 3D cellekultur tilbydes i figur 1. Oplysninger af hydrogel indholdet og nøgletal tilberedt med forskellige mekaniske styrker er opsummeret i tabel 1. Hydrogel's egen healable og reologi egenskab præsenterer den hydrogel stivhed af opbevaring modulus kontra frekvens test i figur 2. Celle Konfokal billeder og celle numre med dage af kultur i hydrogels er præsenteret i figur 3, bekræftelse af cellernes levedygtighed og celleproliferation via 3D cellekultur. Figur 4 præsenterer mikroskopi Konfokal billeder og analyse af celle spredning satser for celler indlejret i hydrogels, lidt injektion og efter kultur. Høj cellernes levedygtighed og celleproliferation angiver at de celler, der er indlejret i hydrogel lidt ingen ødelæggende skade og kunne genoprette ved efter kultur, der angiver den hydrogel injektionsydelse.
Figur 1 : Udarbejdelse af hydrogel og dets anvendelse som 3D cellekultur. (A) Hydrogel forberedelse; (B) celle suspension forberedelse; (C) 3D cellekultur i hydrogels med eller uden injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hydrogel stivhed. Opbevaring modulus G' versus hyppigheden af (A) originale og (B) selv helet hydrogels. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : 3D cellekultur i hydrogel. (A) 3D Konfokal billeder af L929 celler integrerede i stive styrke hydrogel (grøn: levende celler; Rød: døde celler); (B) celle tælle resultaterne af L929 celler indlejret i hydrogel efter celle indkapsling betegnes dengang. Skalalinjen = 300 µm. Data præsenteret som gennemsnit ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : 3D efter cellekultur i hydrogel efter injektion. (A) A skematisk billede af injektion og efter kultur af en celle-belæsset hydrogel. Indsæt: Mikroskopi billeder af celler indlejret i hydrogels før injektion (venstre) og efter efter cellekultur i 7 dage (midten og højre). Skalalinjen = 100 µm; (B) Konfokal billeder af L929 celler indlejret i en stiv styrke hydrogel og post kulturperler efter injektion (grøn: levende celler; Rød: døde celler), skalalinjen = 300 µm; (C) en sammenligning af spredning sats af celler dyrkes i hydrogels med eller uden injektion efter indkapsling. Data præsenteres som gennemsnit ± SD. (Adapted fra reference12; Copyright © 2017 Elsevier). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Hydrogel stivhed | Blød | Medium | Stiv |
| Glykol chitosan (mg) | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| DF PIND (mg) | 4.4 | 8.8 | 17,6 |
| Polymer gelator indhold (wt %) | 1 | 2 | 4 |
| Deioniseret vand (mL) | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| Gelaion tid (min) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (Pa)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * testet under frekvens 6,3 rad s-1, stamme 1% ved hjælp af en parallel plade (diameter 20 mm) på en roterende rheometer. |
Tabel 1: Oplysninger om hydrogels tilberedt med forskellige mekaniske styrker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydrogel præsenteret i denne protokol (figur 1) har to hovedkomponenter: naturlige polymer glycol chitosan og en syntetisk benzaldehyd opsagt polymer gelator DF PIND, som er både biokompatible materialer. Syntese af DF PIND er præsenteret ved hjælp af en et-trins ændring reaktion. PEG med molekylevægt 4.000 blev valgt i denne protokol i bekymringer af opløselighed, modifikation effektivitet samt hydrogel stivhed. En serie af hydrogels med forskellige mekaniske styrker blev udarbejdet ved hjælp af forskellige fast indhold og nøgletal glycol chitosan og DF PIND. Homogen hydrogels blev hurtigt dannet i minutter ved at blande gellation løsninger under stuetemperatur, selvom gellation hastigheden kan også bremse af fortyndede opløsninger. Reologi test var ansat til at evaluere de mekaniske styrke af forskellige hydrogels. Opbevaring moduli (G') af disse hydrogels fandtes der ca afviger fra 900 Pa (blød), 2.100 Pa (medium) til 4.700 Pa (stiv) (tabel 1 og figur 2A). Dette er bidraget til den højere crosslinking tæthed ved at tilføje flere polymer gelators i hydrogel netværk, hvilket resulterer i højere opbevaring modulus (større stivhed). Egenskaben selv healable bekræftes også af genopretningen af den hydrogel modulus (figur 2B). Det er kendt at ECM stivhed er forskellig for forskellige væv, dermed hydrogel kunne tilbyde justerbar mekaniske stikord og opfylde forskellige krav af varieret nøgletal mellem glycol chitosan og DF PIND polymer gelators18.
L929 celler, en typisk mus fibroblast cellelinie med i vivo miljø væv stivhed af ~ 5.600 pa19, blev brugt som en celle model at blive indlejret i hydrogel. Efter den celle indkapsling i hydrogels, det kan nemt observeres at cellerne i hydrogels viste ekstremt høje levedygtighed (> 99%) under hele kultur, bekræfter den fremragende biokompatibilitet af chitosan-baserede hydrogel. En bemærkelsesværdig stigning i celle tæthed i hydrogel underforstået, at denne hydrogel kan støtte udbredelsen af L929 celler endnu uden ekstra-tilføjet vækstfaktorer (figur 3A). Efter 7 dage i kultur i hydrogel steget celle antallet 300% (figur 3B). Det forlyder, at celler dyrkes i stilladser kunne differentiere følgende mekaniske stikord20,21, hvilket kan indebære yderligere forskning ved hjælp af denne 3D hydrogel kultur metode.
Implanterer celler med injicerbar hydrogels har fået uforlignelige fordele høj grad styrke levering effektivitet og levedygtighed af den implanterede celler14. Inden for et dynamisk imine crosslinked netværk kunne hydrogel self-heal efter injektion. Egenskaben selv healable muliggør hydrogel er injicerbare, der indebærer potentielle anvendelsesmuligheder for hydrogels som injicerbar flere luftfartsselskaber. For at yderligere evaluere denne hydrogel som en injicerbar celle carrier, blev en injektion-efterligne og post dyrkningsbaserede eksperiment udført. Celle indlejret hydrogel blev indlæst i en sprøjte og presset ud gennem en 48 G kanyle ind i en petriskål, efterfulgt af en 7-dages post dyrkning proces med celle levedygtighed og spredning sats studerede.
Som vist i figur 4A, kunne squished hydrogel stykker self-heal for at reformere en integreret hydrogel om 1 h efter injektion, som er nyttige i celle levering. For celler i hydrogel, sammenlignet med tog billedet lige efter indkapsling (figur 4A, venstre Indsæt), celle tætheden øges drastisk efter 7 dage (figur 4A, midterste Indsæt). I den udvidede vision, en mere detaljeret celle-fissional proces, hvor nogle celler findes at være delt i to (figur 4A, rigtige Indsæt), direkte bekræftet af 3D celledelingen i hydrogel. Figur 4B viser Konfokal billederne af de levende døde celle assays efter injektion og efter kultur eksperiment. Tætheden af de injicerede celler forøget naturligvis med en høj cellernes levedygtighed (> 99%), demonstrerer den vellykkede celledelingen i den 3D hydrogel efter injektion. At lære om injektion påvirket spredning cellehastighed, en sammenligning af kvantitativ statistik analyse for celle spredning priser i hydrogels med eller uden injektion var udført (figur 4 c). Celle spredning sats efter injektion, forblev selv faldt en anelse, på et højt niveau (~ 75%), og den celle nummer øget 145% relativt efter 7 dage i kultur i hydrogel, der viser, at klipning kraft under injektion har en observerbare begrænset negativ indflydelse på celledelingen.
Vi beskrevet en typisk procedure af denne hydrogel program men forskere kan ændre protokollen passer til specifikke forskningsbehov. Polymer gelators har væsentlig indflydelse på hydrogel og er nemt redigerbare. For eksempel, kunne stivhed af denne hydrogel manipuleres let af forskellige nøgletal glycol chitosan og DF PIND gelator. I mellemtiden, brug DF PIND af andre Molekylær vægt kunne også opfylde dette mål. Vi brugte PIND 4K i denne protokol, men PIND 2K og 10K kan også arbejde. Når du bruger andre pinde, er det vigtigt at overvåge gellation tid og stivhed specifikt. Andre funktionelle polymer gelators fungerer muligvis også, hvis forskerne har syntese færdigheder til at udarbejde specifikke funktionelle benzaldehyd-afsluttet polymerer17.
Denne protokol har flere begrænsninger. For det første på grund af den dynamiske struktur er stivhed af denne hydrogel begrænset sammenlignet med en kovalente bånd crosslinked hydrogel. Man kan støde på fejl at forberede hydrogels med for højt et modulus design. For det andet er denne hydrogel biologisk nedbrydeligt, hvilket begrænser den langsigtede cellekultur inden for hydrogel. For det tredje tilbyder hydrogel en 3D crosslinked dyrkning miljø, der har diffusion bekymringer. Til dato, er de fleste af bio-analyser baseret på 2D kultur. 3D-struktur kan hæmme yderligere celle relateret i vivo undersøgelser.
Når du bruger denne protokol, er der flere vigtige skridt til at følge. For det første under syntesen af polymeren gelator DF PIND er dehydrering meget vigtigt. For det andet, når du udfører celle-relaterede procedurer, sterile operation er kritisk. For det tredje bør den farvning tid kontrolleres godt i hydrogels at få nice Konfokal billeder.
I Resumé indført protokollen en letkøbt forberedelse af chitosan-baserede injicerbare hydrogels, som anvendes som en platform for 3D cellekultur og kunne tilbyde justerbar mekaniske stikord for forskellige undersøgelser. Det er allerede blevet anvendt i områder vedrørende medicinafgivelse, celleterapi og tumor kemoterapi, som ikke blot er et bevis på sin præstation, men også øger sit potentiale for biomedicinsk apaccepterer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Science Foundation of China (21474057 og 21604076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
