Summary
Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.
Abstract
Het protocol presenteert een facile, efficiënte en veelzijdige methode ter voorbereiding van de chitosan gebaseerde hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. De hydrogel is bereid door oplossingen van glycol chitosan mengen met een gesynthetiseerde benzaldehyde beëindigd polymeer gelator en hydrogels efficiënt in enkele minuten bij kamertemperatuur worden verkregen. Door verschillende verhoudingen tussen glycol chitosan, polymeer gelator en water inhoud, zijn veelzijdige hydrogels met verschillende gelering tijden en stijfheid verkregen. Wanneer beschadigd zijn, kan de hydrogel zijn optredens en modulus, als gevolg van de omkeerbaarheid van de dynamische imine obligaties als crosslinkages terugkrijgen. Deze zelfstandige healable eigenschap kunt de hydrogel als injecteerbare omdat het zichzelf genezen van geperste stukken aan een integraal bulk hydrogel na de injectie proces worden kan. De hydrogel is ook multi inspelen op veel bio-actieve prikkels als gevolg van verschillende evenwichtsinstelling statussen van de dynamische imine obligaties. Deze hydrogel werd bevestigd als bio-compatibel, en L929 muis fibroblast cellen waren ingesloten volgende standaardprocedures en de celproliferatie was gemakkelijk beoordeeld door een kweekproces 3D cel. De hydrogel kan bieden een verstelbare platform voor verschillende onderzoek waar een fysiologische nabootsen van een 3D-omgeving voor cellen is geprofiteerd. Samen met haar multi responsieve, zelf healable en injecteerbare eigenschappen, de hydrogels potentieel toepasbaar als meerdere dragers voor drugs en cellen in toekomstige bio-medische toepassingen.
Introduction
Hydrogels zijn kruisverwijzende polymeermaterialen met grote hoeveelheden water en zachte mechanische eigenschappen, en zij zijn gebruikt in vele toepassingen van de bio-medische1,2. Hydrogels kan bieden een zachte en natte omgeving, die zeer vergelijkbaar met de fysiologische omgeving voor cellen in vivo is. Daarom, hydrogels uitgegroeid tot een van de meest populaire steigers voor 3D cel cultuur3,4. Vergeleken met de cultuur van de cel van de petrischaal 2D, 3D-celkweek beschikt over geavanceerde snel om aan te bieden dat een extracellulaire matrix (ECM) geïmiteerd communicatie voor cellen te contacteren en te assembleren voor de proliferatie en differentiatie doeleinden5. Daarnaast kon hydrogels die natuurlijke polymeren bevatten bio-compatibel en bevordering van omgevingen voor cellen vermenigvuldigen en onderscheiden3bieden. Hydrogels afgeleid van synthetische polymeren hebben de voorkeur voor hun eenvoudige en duidelijke onderdelen, welke uitsluiten van complexe invloeden zoals eiwitten van dierlijke oorsprong of virussen. Hydrogels die gemakkelijk worden voorbereid en hebben een consistente eigenschap hebben onder alle hydrogel kandidaten voor 3D-celkweek, altijd de voorkeur. De faciliteit aan te passen van de hydrogel eigenschappen aanpassen aan verschillende onderzoek eisen is belangrijk als goed6.
Hier introduceren we een facile voorbereiding van een glycol chitosan gebaseerde hydrogel met behulp van dynamische imine chemie, die een veelzijdige hydrogel platform voor 3D cel cultuur7wordt. Bij deze methode worden bekende bio-compatibele glycol chitosan gebruikt om frames van de hydrogel van netwerken. De amino groepen zijn reageerde met een polyethyleenglycol benzaldehyde beëindigd als het polymeer gelator dynamische imine obligaties vormen als crosslinkages van hydrogels8. Dynamische imine obligaties kunnen vormen en ontleden omkeerbaar en servicegerichte omgeving, waarmee de hydrogels met mechanisch verstelbare kruisverwijzende netwerken9,10,11. Vanwege de hoge water inhoud, bio-compatibele materialen, en instelbare mechanische krachten, is de hydrogel met succes toegepast als een steiger voor L929 cellen in 3D cel cultuur12,13. Het protocol hier een overzicht van de procedures, met inbegrip van polymeer gelator synthese, hydrogel voorbereiding cel insluiten en 3D cel kweken.
De hydrogel toont ook verschillende andere functies als gevolg van de dynamische imine-crosslinkages, met inbegrip van haar multi inspelen op verschillende bio-stimuli (zuur/pH, vitamine B6 afgeleide pyridoxal, eiwit papaïne, enz.), wat erop duidt dat de hydrogel kon worden geïnduceerde te ontleden onder fysiologische omstandigheden8. De hydrogel is ook zelf healable en injecteerbare, wat betekent de hydrogel kan worden beheerd via een minimaal invasieve injectie-methode en een voordeel in drugs- en cel leveringen14,15. Door toevoeging van functionele additieven of specifieke vooraf ontworpen polymeer gelators, de hydrogel compatible bij het verkrijgen van specifieke eigenschappen zoals magnetische, temperatuur, pH responsieve, etc.16,17, die kan voldoen aan een breed scala van onderzoek eisen. Deze eigenschappen onthullen de potentiële capaciteit van de hydrogel als een injectable meerdere vervoerders voor drugs en cellen in zowel in vitro en in vivo biomedisch onderzoek en toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Gebruik de juiste veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van experimenten van de chemie, met inbegrip van het gebruik van een zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, beschermende handschoenen, laboratoriumjas, enz.). Het protocol vereist standaard cel behandeling technieken (steriliseren, herstel van de cel, cel passaging, bevriezing van de cel, cel kleuring, etc.).
1. voorbereiding van de Hydrogels
- synthese van benzaldehyde beëindigd di-matiemaatschappij polyethyleenglycol (PEG DF)
- pre desiccation PEG polymeer
- Weeg 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol) Breng dit in een kolf met ronde bodem (250 mL), en het toevoegen van tolueen (100 mL).
Opmerking: Andere pinnen met verschillende molecuulgewichten kan werken voor de hydrogel vorming maar zal leiden tot verschillende stijfheid. - Verwarm de oplossing door een warmte-pistool (of een warmhoudplaat ongeveer 40 ° C) mild om te helpen met het oplossen van alle de polymeren. Nadat alle de polymeren ontbinden, gebruiken een verdamper te verwijderen van alle de oplosmiddelen. Herhaal deze los en droog proces tweemaal om de gedroogde PEG polymeren.
Let op: Dit moet worden uitgevoerd in een zuurkast met uiterste zorg. Tolueen is ontvlambaar.
- Weeg 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol) Breng dit in een kolf met ronde bodem (250 mL), en het toevoegen van tolueen (100 mL).
- Benzaldehyde beëindiging reactie van PEG
- een magneetroerder en tetrahydrofuraan (THF, 100 mL) Voeg aan de maatkolf en ontbinden van PEG met behulp van een roerder. 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6,0 mmol) en 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0,6 mmol) opeenvolgend toevoegen aan de oplossingen voor alle de lichamen volledig ontbinden.
- Toevoegen N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) aan de oplossing, en een droogrek buis dat gevuld is met watervrij CaCl 2 aan de maatkolf toe te voegen. De reactie onder roeren houden bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) voor ongeveer 12 h.
- Na reactie proces
- uitfilteren van de wit-lichamen in de oplossing door vacuüm gegenereerd nadat de reactie is voltooid. Giet de oplossing in koude diethylether (500 mL) onder roeren om het neerslaan van de witte lichamen. Verzamelen van alle de witte lichamen door filter en droog de lichamen in een zuurkast.
- De witte lichamen in THF weer los, uitfilteren van eventuele onoplosbare witte vaste stoffen, giet de oplossing in verse koude diethylether neerslaan van de witte lichamen en droog het. Herhaal dit proces twee tot drie keer, en plaats dan de witte lichamen in een vacuüm drogen oven (20 ° C, 0.1 mbar) hen volledig drogen. Het witte poeder als het eindproduct verzamelen: benzaldehyde beëindigd DF PEG.
- pre desiccation PEG polymeer
- Voorbereiding van hydrogels
- wegen van verschillende hoeveelheden DF PEG (0.11 g, 0.028 mmol 0,22 g, 0.055 mmol; 0.44 g, 0.110 mmol) in een buis (10 mL), Voeg gedeïoniseerd water (5,0 mL) en een vortex of magneetroerder gebruiken om te helpen Los van het polymeer.
- Los glycol chitosan (0.495 g, 6.18 x 10 -3 mmol) in gedeïoniseerd water (15,0 mL) in een buis (50 mL), en een draaikolk voor een paar minuten kunt meng de chitosan oplossing (3 wt %).
- Voeg de glycol chitosan oplossing (0,2 mL, 3 wt %) en DF PEG oplossingen (0,2 mL) opeenvolgend in een buis (2,0 mL). Gebruik een draaikolk te mengen de oplossingen homogeen voor formulier hydrogels in enkele minuten. Volg de ratio's in tabel 1 te maken van verschillende mechanische voordelen hydrogels.
Opmerking: Gebruik de buis-inverterende methode om te bepalen of de hydrogel reeds heeft gevormd.
- Reologie analyses
- reologie analyses op een roterende rheometer met een parallelle staalplaat uitvoeren (diameter: 20 mm). Verspreid voor de gelering test, glycol chitosan oplossing (0,2 mL, 3 wt %) op een lagere plaat. Vervolgens Voeg DF PEG waterige oplossingen (0,2 mL, 2 wt %) ontkleuring gelijkmatig over het oppervlak van de oplossing chitosan en meng met een pipet snel. Lager naar beneden de bovenste plaat en beginnen te test
- Voor hydrogel ' s stijfheid test, snijd een hydrogel in een cirkel (diameter: 20 mm) en het meten van de opslag-modulus (G ') waarden versus frequentie analyses op 1% belasting. Typische G ' waarden op 6.3 rad s − 1 zijn vermeld in tabel 1.
Opmerking: De reologie analyses van de hydrogel 0.5 h uitvoeren na de vorming van de hydrogel om dynamische binding stabilisatie van de hydrogel. - Voor de hydrogel ' s zelf healable eigenschap testen, een hydrogel in stukken gehakt en de stukken bij elkaar komen om te self-heal naar een integraal stuk. Knip het stuk hydrogel zodat een cirkel (diameter: 20 mm) en zet het op de rheometer voor het uitvoeren van de analyse van de reologie.
2. 3D cel teelt in Hydrogels
- voorbereiding van hydrogel gelering oplossingen
- wegen DF PEG (0.44 g, 0.11 mmol) in een steriele buis (4,0 mL), toevoegen in cel voedingsbodems (RPMI-1640, 2.0 mL), en met een vortex of roerder helpen ontbinden van het polymeer om te verkrijgen van de polymeeroplossing (20% van de wt). Laden van de oplossing in een injectiespuit (10,0 mL) en vervolgens het steriliseren door het passeren van een micron bacteriën-nulspanningsveilig filter (0,22 µm).
- Wegen de glycol chitosan (0.165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) in een steriele buis (15,0 mL), Voeg in cel kweekmedia (RPMI-1640, 4,0 mL) en vortex te helpen oplossen van het polymeer om te verkrijgen van de glycol chitosan oplossing (4.0 wt %). Laden van de oplossing in een injectiespuit (10,0 mL) en filteren met een bacteriën-nulspanningsveilig filter van 0,22 µm.
- Cel teelt in hydrogels
Let op: voeren alle celopmaak verwante procedures in de kap van een weefselkweek. Basiskennis van steriele techniek wordt verwacht.- Voorbereiding van celsuspensie
- cultuur L929 cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, 5% penicilline (10 mL) in een Petri schotel (diameter 10 cm), en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2. Het medium veranderen elke dag vóór gebruik.
- Oogst de L929 cellen met PBS met trypsine (0,025 w/v %) en EDTA (0,01% w/v), vervolgens centrifugeren (70 x g, 5 min) en resuspendeer de cellen in het RPMI-1640 medium (1,0 mL). De cel tellen met behulp van de standaardwerking van bloed-tellen van bestuur uitvoeren Resuspendeer de cellen zo aanpassen van de concentratie van de cel op ~ 3,75 × 10 6 cellen/mL.
- Cel inkapseling in hydrogels
- de L929 cel schorsingen (0.4 mL, 3,75 x 10 6 cellen mL -1) mengen met glycol chitosan oplossing (0.4 mL) in een buis (4,0 mL) door vortex. Pipetteer van de L929/glycol chitosan oplossing (0,8 mL) in het midden van een confocal petrischaal (diameter 2,0 cm). Pipetteer de DF PEG oplossingen (0,2 mL) in de dezelfde schotel, en zachtjes Pipetteer Meng de oplossing te induceren hydrogel vorming.
Opmerking: De hydrogel vorming beoordelen door het kantelen van de petrischaal. - Voor directe celcultuur, voegt u extra hoeveelheden RPMI-1640 voedingsbodems (1,0 mL) op de top van de hydrogel. Zet de cel ingesloten hydrogels (1,0 mL 1.5 wt % glycol chitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 6 cellen mL -1) in een incubator (37 ° C, 5% CO 2) en het medium veranderen elke dag. Voorbereiden van cel imaging op dag 1, 3, 5 en 7 na cel inkapseling.
- de L929 cel schorsingen (0.4 mL, 3,75 x 10 6 cellen mL -1) mengen met glycol chitosan oplossing (0.4 mL) in een buis (4,0 mL) door vortex. Pipetteer van de L929/glycol chitosan oplossing (0,8 mL) in het midden van een confocal petrischaal (diameter 2,0 cm). Pipetteer de DF PEG oplossingen (0,2 mL) in de dezelfde schotel, en zachtjes Pipetteer Meng de oplossing te induceren hydrogel vorming.
- Voor de 3D na celcultuur in hydrogels na injectie, bereiden cel geladen hydrogel (1,0 mL, zie stap 2.2.2) in een injectiespuit (10,0 mL, 48 G naald). Na de hydrogel vormen, injecteren de hydrogel langzaam in een petrischaal voor confocal imaging. Voeg een extra bedrag van voedingsbodems (1,0 mL) op de top van de hydrogel en wijzig het elke dag. Zet de petrischaal in een incubator (37 ° C, 5% CO 2) en voor te bereiden voor imaging daarna.
Let op: Controleer en volg het protocol inzake werking van een injectiespuit.
- Voorbereiding van celsuspensie
- Cel rentabiliteit
- Confocal observatie
- Spoel de hydrogels met PBS (1,0 mL) voor twee keer. Vlek de hydrogels met fluoresceïne DIACETAAT (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) en propidium jodide (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) oplossingen voor 15 min. Na kleuring, het verwijderen van alle de oplosmiddelen.
- Observeren de hydrogels met behulp van een confocal microscoop onder excitatie golflengten van 488 nm en 543 nm te visualiseren levende en dode cellen, respectievelijk. Z-stacks via elke 2 µm-diepte van de hydrogels voor het valideren van een gelijkmatige verdeling van de cellen in de hele nemen.
Opmerking: FDA vlekken levende cellen terwijl PI dode cellen vlekken.
- Degraderen de hydrogel (1,0 mL) met azijnzuur (HAc, 3% van de v, 1,0 mL) voor 5 min en Pipetteer in een buis (4,0 mL). Verzamelen van cellen door centrifuge (70 x g, 5 min) en resuspendeer de cellen in het kweekmedium cel van RPMI-1640 (1,0 mL). Uitvoeren van cel tellen met behulp van een bloed tellen bestuur.
- Confocal observatie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Figuur 1is een schematische presentatie van dit protocol betreffende hydrogel voorbereiding en het gebruik ervan als 3D-celkweek aangeboden. Informatie van de inhoud en de ratio's bereid met verschillende mechanische sterkte van de hydrogel is samengevat in tabel 1. De hydrogel's zelf healable en reologie eigenschap presenteert de hydrogel van stijfheid van opslag modulus versus frequentie test in Figuur 2. De confocal beelden van de cel en de cel nummers met dagen van de cultuur in hydrogels worden gepresenteerd in Figuur 3, bevestiging van de levensvatbaarheid van de cellen en celproliferatie via 3D-celkweek. Figuur 4 presenteert microscopie, confocal afbeeldingen en analyse van cel proliferatie tarieven voor cellen ingebed in hydrogels die injectie en na cultuur geleden. Levensvatbaarheid van de hoge cellen en celproliferatie blijkt dat de cellen die zijn ingesloten in de hydrogel geen destructieve schade geleden en door na cultuur herstellen kon, die van de hydrogel injectiecapaciteit aangeeft.
Figuur 1 : Voorbereiding van de hydrogel en het gebruik ervan als 3D-celkweek. (A) Hydrogel voorbereiding; (B) cel schorsing voorbereiding; (C) 3D-celkweek in hydrogels met of zonder injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Hydrogel stijfheid. Opslag modulus G' ten opzichte van de oorspronkelijke frequentie van (A) en (B) zelf genezen hydrogels. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : 3D-celkweek in de hydrogel. (A) 3D confocal beelden van L929 cellen ingebed in stijve sterkte hydrogel (Green: levende cellen; Rood: dode cellen); (B) cel resultaten van L929 cellen tellen ingebed in de hydrogel na cel inkapseling aangeduid door tegelijk. Schaal bar = 300 µm. gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : 3D na celcultuur in hydrogel na injectie. (A) A Schematische afbeelding van injectie en na cultuur een hydrogel cel-geladen. Invoegen: Microscopie beelden van cellen ingebed in hydrogels vóór injectie (links) en na na celkweek voor 7 dagen (midden en rechts). Schaal bar = 100 µm; (B) Confocal beelden van L929 cellen ingebed in een stijve sterkte hydrogel en post gekweekte na injectie (Green: levende cellen; Rood: dode cellen), schaal bar = 300 µm; (C) A vergelijking van de koers van de proliferatie van cellen gekweekt in hydrogels met of zonder injectie na inkapseling. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SD. (aangepast van referentie12; Copyright © 2017 Elsevier). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Hydrogel stijfheid | Zachte | Medium | Stijf |
| Glycol chitosan (mg) | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| DF PEG (mg) | 4.4 | 8.8 | 17,6 |
| Gelator polymeergehalte (wt %) | 1 | 2 | 4 |
| Gedeïoniseerd water (mL) | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| Gelaion tijd (min) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (Pa)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * getest onder frequentie 6.3 rad s-1, 1% met een parallelle plaat stam (diameter 20 mm) op een roterende rheometer. |
Tabel 1: Informatie van hydrogels bereid met verschillende mechanische sterkte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hydrogel gepresenteerd in dit protocol (Figuur 1) bestaat uit twee hoofdonderdelen: de natuurlijke polymeer glycol chitosan en een synthetische benzaldehyde beëindigd polymeer gelator DF PEG, die beide biocompatibel materiaal. Synthese van DF PEG wordt gepresenteerd met behulp van een one-step wijziging reactie. PEG met molecuulgewicht 4.000 werd gekozen in dit protocol in de zorgen van de oplosbaarheid, wijziging efficiëntie, evenals hydrogel stijfheid. Een aantal hydrogels met verschillende mechanische sterkte werden opgesteld op basis van verschillende vaste inhoud en ratio's van glycol chitosan en DF PEG. Homogene hydrogels snel ontstonden in minuten door het mengen van gelering oplossingen onder kamertemperatuur, hoewel de gelering snelheid ook door verdunde oplossingen vertragen kan. Reologie test was werkzaam voor de evaluatie van de mechanische sterke punten van verschillende hydrogels. De modules van de opslag (G') van de hydrogels bleken ongeveer afwijken van 900 Pa (zacht), 2.100 Pa (medium) tot 4.700 Pa (stijve) (tabel 1 en figuur 2A). Dit wordt bijgedragen aan de hogere dichtheid van het crosslinking door toevoeging van meer polymeer gelators in het netwerk van hydrogel, wat resulteert in hogere opslag modulus (grotere stijfheid). De zichzelf healable eigenschap wordt tevens bevestigd door de terugwinning van de de hydrogel modulus (figuur 2B). Het is bekend dat ECM stijfheid verschilt voor verschillende weefsels, dus de hydrogel kon bieden instelbare mechanische signalen en voldoen aan verschillende onderzoek door gevarieerde verhoudingen tussen glycol chitosan en DF PEG polymeer gelators18.
De cellen van de L929, een typische muis fibroblast cellijn met in vivo milieu weefsel stijfheid van ~ 5.600 pa19, werd gebruikt als een cel model moet worden ingesloten in de hydrogel. Na de inkapseling van de cel in hydrogels, het kan worden gemakkelijk waargenomen dat de cellen in de hydrogels bleek extreem hoge levensvatbaarheid (> 99%) tijdens het proces van de cultuur, bevestiging van het uitstekende biocompatibiliteit de chitosan gebaseerde hydrogel. Een opmerkelijke toename van de celdichtheid in de hydrogel geïmpliceerd dat deze hydrogel proliferatie van de cellen van de L929 zelfs zonder extra toegevoegde groeifactoren (figuur 3A) konden steunen. Na 7 dagen in de cultuur in de hydrogel steeg het celaantal 300% (figuur 3B). Het is gemeld dat cellen gekweekt in de steigers kon onderscheiden na mechanische signalen20,21, wat zou kunnen betekenen dat verder onderzoek met behulp van deze methode 3D hydrogel cultuur.
Het inplanteren van cellen met injecteerbare hydrogels heeft opgedaan onvergelijkbare voordelen aanzienlijk vergroten van de efficiëntie van de levering en de levensvatbaarheid van de cellen van de geïmplanteerde14. Binnen een dynamische imine kruisverwijzende netwerk kon de hydrogel self-heal na injectie. De zichzelf healable eigenschap kunt de hydrogel als injecteerbare, hetgeen potentiële toepassingen voor de hydrogels als injecteerbare meerdere vervoerders impliceert. Als u wilt verder evalueren deze hydrogel als de drager van een injecteerbare cel, werd een injectie nabootsen en post kweken experiment uitgevoerd. De cel ingesloten hydrogel was geladen in een spuit en weggedrukt door middel van een naald 48 G in een petrischaal, gevolgd door een 7 dagen na het kweken van proces met cel levensvatbaarheid en proliferatie tarief studeerde.
Zoals blijkt uit figuur 4A, kon de squished hydrogel stukken self-heal hervorming van een geïntegreerde hydrogel ongeveer 1 h na de injectie, wat handig is bij de levering van de cel. Voor cellen in de hydrogel, in vergelijking met vond de afbeelding net na inkapseling (figuur 4A, links invoegen), de celdichtheid steeg dramatisch na 7 dagen (figuur 4A, midden invoegen). In de uitgebreide visie, een meer gedetailleerde cel-fissional proces waarin sommige cellen worden aangetroffen in twee verdeeld te worden (figuur 4A, rechts invoegen), direct bevestigd door 3D celproliferatie in de hydrogel. Figuur 4B toont de confocal beelden van de live-dode cel tests na injectie en na cultuur experiment. De dichtheid van de geïnjecteerde cellen toegenomen natuurlijk met een levensvatbaarheid van de hoge cellen (> 99%), aan te tonen de succesvolle celproliferatie in de 3D hydrogel na injectie. Om te leren dat of de injectie beïnvloed de snelheid van de cel proliferatie, een vergelijking van de analyse van de kwantitatieve statistieken voor de cel proliferatie tarieven in hydrogels met of zonder injectie werd uitgevoerd (figuur 4C). De snelheid van de cel proliferatie na injectie, bleef hoewel licht gedaald, in een hoog niveau (~ 75%), en het celaantal steeg met 145% relatief na 7 dagen in de cultuur in de hydrogel, die aangeeft dat de shearing force tijdens injectie een observabele heeft beperkte negatieve invloed op de celproliferatie.
We beschreven een typische procedure van deze toepassing hydrogel maar onderzoekers het protocol aan specifiek onderzoek vereisten kunnen wijzigen. Polymeer gelators hebben belangrijke invloeden op de hydrogel en zijn gemakkelijk aanpasbaar. Bijvoorbeeld, kan de stijfheid van deze hydrogel gemakkelijk worden gemanipuleerd door verschillende ratio's van glycol chitosan en DF PEG gelator. Ondertussen, kan het gebruik DF PEG andere molecuulgewichten ook moeten vervullen deze doelstelling. We gebruikten PEG 4K in dit protocol, maar PEG 2K tot 10K kan ook werken. Bij het gebruik van andere pinnen, is het belangrijk om te controleren de gelering tijd en stijfheid specifiek. Andere functionele polymeer gelators kunnen ook werken als de onderzoekers synthese vaardigheden ter voorbereiding specifieke functionele benzaldehyde-beëindigd polymeren17.
Dit protocol heeft verscheidene beperkingen. Ten eerste, als gevolg van de dynamische structuur, de stijfheid van deze hydrogel is beperkt in vergelijking met een covalente binding kruisverwijzende hydrogel. Een tegenkomen mislukkingen te bereiden hydrogels met teveel van een ontwerp van de elasticiteitsmodulus. Ten tweede, deze hydrogel is bio-afbreekbaar, waarbinnen de langetermijnkweek van de cel binnen de hydrogel te beperken. Ten derde, de hydrogel biedt een 3D kruisverwijzende teelt omgeving met verspreiding zorgen. Tot op heden, zijn de meeste van de bio-analyses gebaseerd op 2D cultuur. De 3D structuur zouden kunnen belemmeren verdere cel gerelateerde in vivo studies.
Bij het gebruik van dit protocol, zijn er verschillende kritische stappen te volgen. In de eerste plaats tijdens de synthese van het polymeer gelator DF PEG is uitdroging heel belangrijk. Ten tweede, bij het uitvoeren van cel-gerelateerde procedures, steriele operatie is cruciaal. Ten derde, de kleuring tijd moet goed worden gecontroleerd in de hydrogels om mooie confocal beelden.
Kortom, het protocol van Madrid introduceerde een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels, die worden toegepast als een platform voor 3D-celkweek en instelbare mechanische signalen voor verschillende onderzoeken kan bieden. Het is al toegepast in gebieden met betrekking tot de drug delivery, celtherapie, en tumor chemotherapie, die niet alleen getuigt van zijn prestaties, maar ook het potentieel voor biomedische ap verhoogtplications.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de National Science Foundation of China (21474057 en 21604076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S.
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
