إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9
Summary
حقن (PN) برونوكلير مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) ونظام البروتين-9 المرتبطة كريسبر نوكلاس (كريسبر/Cas9) طريقة ذات كفاءة عالية لإنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا. هنا، نحن تصف البروتوكول حقن PN مفصلة لإنتاج الجينات خروج المغلوب الهامستر مع نظام كريسبر/Cas9.
Abstract
تقنية حقن (PN) pronuclear أنشئت أول مرة في الفئران لإدخال المواد الجينية الأجنبية في برونوكلي الأجنة مرحلة خلية واحدة. عرض المواد الجينية قد دمج الجينوم الجنينية وتوليد الحيوانات المحورة وراثيا مع المعلومات الجينية الأجنبية بعد نقل الأجنة حقن لتشجيع الأمهات. وعقب النجاح الذي حققه في الفئران، تم تطبيق حقن PN بنجاح في العديد من أنواع الحيوانات الأخرى. في الآونة الأخيرة، حقن السند الإذني قد استخدمت بنجاح لإدخال الكواشف مع تعديل الجينات الأنشطة، مثل نظام كريسبر/Cas9، لتحقيق التعديلات الوراثية الخاصة بالموقع في المختبر عدة ومزرعة الحيوانات. بالإضافة إلى إتقان مجموعة خاصة من microinjection المهارات اللازمة لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا بحقنه PN، الباحثين يجب أن نفهم فسيولوجية الإنجاب وسلوك الأنواع المستهدفة، لأنه يقدم كل أنواع فريدة من نوعها التحديات. على سبيل المثال، قد الأجنة الهامستر السوري الذهبي فريدة معالجة الاحتياجات في المختبر بتقنيات الحقن PN لم تكن ممكنة في هذه الأنواع حتى الاكتشافات الأخيرة من مجموعتنا. لدينا بروتوكول الحقن PN تعديل الأنواع، نجحنا في إنتاج العديد من خروج المغلوب الجينات (كو) و knockin الهامستر (كي)، التي استخدمت بنجاح للأمراض التي تصيب الإنسان النموذجي. هنا يمكننا وصف الإجراء حقن PN لإيصال المعقدة كريسبر/Cas9 إلى زيجوتيس الهامستر، وشروط التعامل مع الجنين، إجراءات نقل الأجنة، وتربية المطلوبة لإنتاج وراثيا تعديل الهامستر.
Introduction
الهمستر السوري الذهبي (Mesocricetus الذهبي) واحد من القوارض الأكثر استخداماً للبحوث الطبية الحيوية. ووفقا “وزارة الزراعة الأمريكية”، واستخدمت قداد 100,000 تقريبا في الولايات المتحدة في عام 2015، الذين يمثلون 13% استخدام مختبر مجموع الحيوانات فيما بين الأنواع المشمولة “قانون رعاية الحيوان” (http://www.aphis.usda.gov; الوصول إلى 10 مارس 2017).
الهمستر يوفر العديد من المزايا الأخرى القوارض في الدراسة لعدد من الأمراض التي تصيب الإنسان. على سبيل المثال، adenocarcinomas الأقنية البنكرياس الأنسجة من N-nitrosobis(2-oxopropyl) أمين (ميزان المدفوعات) التي يسببها في الهامستر مماثل لاورام البنكرياس البشرية، بينما يدفع أسعار صرف العلاج أساسا أورام الغدة الدرقية في الفئران والرئة وأورام الكبد في 1من الفئران. لأن الهامستر هي القوارض الصغيرة فقط وجدت لدعم النسخ متماثل غدية، وهم أيضا النموذج المفضل لاختبار العقاقير المضادة إتش2،،من34ومتجهات أونكوليتيك المستندة إلى إتش. مثال آخر حيث يقدم نموذج الهامستر ميزة على الفئران والجرذان في دراسة الدهون. البشر والهامستر معرض للتشابه الكبير في الدهون الأيضية وتحمل الجينات ترميز cholesteryl إستر نقل البروتين (التبادل)، الذي يلعب دوراً محوريا في دهن الأيض، بينما يتم التبادل غائبة في الفئران والجرذان5من كل الأنواع. بالإضافة إلى ذلك، وضع الهامستر النزفية مرض أكثر تمثيلاً لمظاهر البشرية بعد التعرض ل فيروس الإيبولا6. قداد أيضا نماذج الاختيار لدراسة تصلب الشرايين7، وسرطانات الفم8، والتهاب ميوباثيس9. في الآونة الأخيرة، كما ثبت أن الهامستر تكون عرضه للإصابة بعدوى الفيروس الأنديز وتطوير فيروس هانتا الرئوية مثل متلازمة المرض، تقديم نموذج القوارض فقط من الإصابة بالفيروس الأنديز10.
لمعالجة الحاجة غير الملباة لرواية النماذج الحيوانية الوراثية لدراسة الأمراض البشرية التي يتوفر فيها لا نموذج القوارض صغيرة يمكن الاعتماد عليها، نحن قد نجحت في تطبيق نظام كريسبر/Cas9 إلى الهامستر مؤخرا وقد أنتجت عدة أسطر من وراثيا هندسة قداد11. زيجوتيس الهامستر حساسة للغاية للأوساط البيئية أن البروتوكولات حقن PN نمواً في الأنواع الأخرى غير مناسبة. ولذلك، علينا وضع بروتوكول حقن PN الهامستر يتوافق مع المتطلبات الخاصة للتعامل مع الهامستر أجنة في المختبر. هنا، نحن تصف الإجراء حقن PN مفصلة باستخدام نظام كريسبر/Cas9 والخطوات المرافقة، من إعداد دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) لنقل الأجنة حقنه في الإناث المتلقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أفضل استغلال إمكانات الهامستر السوري الذهبي كنماذج للأمراض البشرية، قمنا بتطوير بروتوكول حقن PN لإيصال كريسبر/Cas9 معقدة لاستهداف الجينوم الهامستر. بروتوكول الحقن PN يحسن عدة متغيرات رئيسية بما في ذلك الجنين الثقافة المتوسطة، ودرجة الحرارة، والاطوال الموجية ل الضوء13. وهناك أي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
البحث عنها في هذا المنشور وأيد من “المعاهد الوطنية للحساسية” والأمراض المعدية (نييد) من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة 1R41OD021979 رقم (إلى ZW) ومنحة بحثية من 21 BioGreen الجيل القادم منح البرنامج، جمهورية كوريا، لا. PJ01107704 (إلى ZW) ولا تمنح. PJ01107703 (لايك). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو 21 بيوجرين. ونحن نشكر الدكتور نيكولاس روبل لتحرير المخطوطة.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three–Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
