Summary
Pronuclear (PN) הזרקה של באשכולות באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR), מערכת CRISPR-הקשורים חלבון-9 נוקלאז (CRISPR/Cas9) היא שיטה יעילה במיוחד להפקת מהונדס גנטית אוגרים סוריים הזהב. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של הזרקת PN לייצור של אוגרים נוקאאוט גנטי עם מערכת CRISPR/Cas9.
Abstract
טכניקת ההזרקה (PN) pronuclear הוקם לראשונה בעכברים להציג חומרים גנטיים זרים לתוך pronuclei של שלב אחד-תא עוברי. החומר הגנטי הציג עשויים לשלב הגנום העוברי וצור הטרנסגניים חיות עם זרים מידע גנטי בעקבות העברת העוברים מוזרק לטפח אימהות. בעקבות ההצלחה בעכברים, הזרקת PN הוחל בהצלחה במינים בעלי חיים רבים אחרים. לאחרונה, הזרקת PN כבר בהצלחה מועסקים להציג ריאגנטים עם שינוי גנטי פעילויות, כגון מערכת CRISPR/Cas9, כדי להשיג שינויים בייעודי לאתר גנטית במעבדה מספר החווה מיני בעלי חיים. בנוסף מאסטרינג בערכה מיוחדת של מיומנויות microinjection כדי לייצר חיים מהונדסים בזריקה PN, חוקרים חייב להבין את הפיזיולוגיה של רבייה וההתנהגות של המין היעד, בגלל כל מיני מתנות ייחודיות אתגרים. לדוגמה, אוגר סורי זהוב עוברי יש ייחודי טיפול בדרישות במבחנה כזאת PN הזרקת טכניקות היו אפשריים במין זה עד פריצות דרך זה התבצעה על ידי הקבוצה שלנו. עם מינים-השתנה PN הזרקת הפרוטוקול שלנו הצלחנו לייצר מספר נוקאאוט גנטי (KO) ו knockin אוגרים (KI), אשר שימשו בהצלחה מודל מחלות אנושיות. כאן נתאר את הליך הזרקת PN מוסר את CRISPR/Cas9 מורכבים מופרות של האוגר, העובר טיפול בתנאים, נהלי ההעברה העובר ולאחר גידול הדרושה להפקת גנטית שונה אוגרים.
Introduction
האוגר הסורי הזהב (אם לדייק Mesocricetus) הוא אחד המכרסמים הנפוצה ביותר למחקר ביורפואי. על-פי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, כ-100,000 אוגרים שימשו בארצות הברית בשנת 2015, המייצג 13% השימוש בבעלי חיים המעבדה הכולל בין המינים מכוסה על ידי חוק רווחת בעלי חיים (http://www.aphis.usda.gov; לגשת מרץ 10, 2017).
האוגר מציע כמה יתרונות על פני מכרסמים אחרים במחקר של מספר מחלות אנושיות. לדוגמה, אדנוקרצינומה בלבלב histopathology של N-nitrosobis(2-oxopropyl) אמין (BOP) המושרה ductal ב אוגר דומה גידולים בלבלב האנושי, בעוד הטיפול בופ מעוררת בעיקר גידולי בלוטת התריס חולדות, ריאות, גידולים בכבד עכברים1. בגלל אוגרים למכרסמים קטנים בלבד נמצאו כדי לתמוך את השכפול של adenoviruses, הם גם המודל של בחירה עבור בדיקות oncolytic המבוסס על אדנו וקטורים, אנטי-אדנו סמים-2,-3,-4. דוגמה נוספת שבה המודל אוגר מציע יתרון על עכברים וחולדות היא במחקר של היפרליפידמיה. אוגרים ובני להפגין קווי דמיון גדול בין משעולים חילוף החומרים של השומנים, בשני המינים הם נשאים של הגן קידוד cholesteryl אסתר העברה חלבון (CETP), אשר ממלא תפקיד מרכזי השומנים שיטות ההזנה, בעוד CETP הוא נעדר עכברים, חולדות5. בנוסף, אוגרים לפתח יותר נציג של הביטוי האנושי בעקבות חשיפה וירוס האבולה6hemorrhagic המחלה. אוגרים הם גם הדגמים של בחירה עבור הלומדים טרשת עורקים7, קרצינומות אוראלי8ו דלקתיים myopathies9. . לאחרונה, זה גם הוכח כי אוגרים הם רגישים מאוד זיהום בנגיף האנדים, לפתח מחלות כמו תסמונת ריאתי הנטא וירוס, מתן המודל מכרסמים רק Andes וירוס זיהום10.
כדי לענות על הצורך קיימים מודלים גנטי הרומן ללמוד את מחלות אנושיות איפה לא אמין דגם מכרסם קטן זמין, לאחרונה הצליחו החלה מערכת CRISPR/Cas9 על האוגר ואנו יצרו מספר שורות גנטית מתוכנן אוגרים11. אוגר מופרות רגישים מאוד milieus סביבתי כזה כי הפרוטוקולים הזרקת PN פותח במינים אחרים מתאימים למחייה. לכן, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN עבור אוגר התואם את דרישות מיוחדות לטיפול אוגר העוברים בתוך חוץ גופית. כאן, אנו מתארים את ההליך הזרקת PN מפורט באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 והצעדים הנלווה, משלב הכנת מדריך בודד RNA (sgRNA) העברת העוברים מוזרק לתוך נקבות הנמען.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת יוטה (פרוטוקול IACUC: 2484). אוגרים המשמשים פרוטוקול זה הם מבוגרים (מגיל 6-10 שבועות) LVG זן הזהב אוגרים סוריים. אוגרים כל מלון את ביבר במרכז Bioinnovation, אוניברסיטת מדינת יוטה. בטמפרטורת החדר מוגדר ב 23 ° C, לחות מוגדרת ב- 40-50%, ולכן מחזור אור מוגדר 14L: 10D (בהירה: כהה). במידת האפשר, שגרות מניפולציה ו- surugical העובר צריכה להתבצע עם טכניקות סטרילי.
1. sgRNA והכנות Ribonucleoproteins (RNP) Cas9/sgRNA
- לסנתז sgRNAs ביצוע במבחנה שעתוק הפרוצדורות המתוארות במדריך של ערכת סינתזה (חומרים לטבלה, נספח 1).
- להרכיב ribonucleoproteins, לערבב 2 µg של Cas9 עם µg 1 של sgRNA, דגירה המיקס בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות. להזרקה PN, הופך הפתרון עובד-הריכוז של 100 ng/µL Cas9 ו 50 ng/µL sgRNA עם 10 מ מ טה מאגר (RNase חינם, חומרים טבלה).
2. אופן ההכנה של עיקור
הערה: הניתוח מתבצע על אוגרים זכר רוב בגיל 6-8 שבועות. הניתוח צריך להתבצע 10-14 ימים לפני ההזדווגות הראשונה. עקרות אושר על ידי הריונות כושל מ להזדווג עם נקבות פורייה. עיקור זכרים ניתן בדרך כלל במשך שנה לפני שהם הופכים פעילים מינית פחות.
- עזים ומתנגד זכרים באמצעות הזרקת בקרום הבטן (i.p.) של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים מנה של 40 מ"ג/ק"ג (קטמין) ו- 10 מ"ג/ק"ג (חריגות השירותים הווטרינריים). לאשר הרדמה על ידי חוסר רפלקס פדלים (הבוהן צביטה).
- נעוץ האוגר מסומם הגבי recumbency על נייר טישו יבש. יש לשטוף הבטן עם שלושה סבבי הטיפולים חיטוי, לסירוגין כירורגי לקרצף פתרונות בין 70% אלכוהול povidone יוד.
- עושים חתך אנכי עם מספריים כירורגיים החל 1.5 ס מ הגולגולת כדי ערלה הארכת 1 ס מ מכל צד של קו אמצע (איור 1 א'). תחתכי את העור עורית, לינאה אלבה כדי לגשת אל החלל הצפק (איור 1b).
- הפעילו לחץ עדין ההיבט סימטרית של שק האשכים כדי לאלץ את האשכים ואת רקמת השומן החוצה. לתפוס את צינור הזרע בעדינות עם מלקחיים, הפרד בזהירות את כלי הדם מן vas עם עוד זוג מלקחיים (איור 1 c).
- להחזיק את צינור הזרע עם מלקחיים ליצירת לולאה. מחממים את קצה מלקחיים נוספת בלהבה עד שזה אדום ולאחר מכן להשתמש בו כדי להסיר את הלולאה של הזרע הזרע. הכנס רקמת שומן ועל האשכים אל הבטן. הסר את צינור הזרע על הצד היריב עם אותם הליכים.
- תפר מערכת השרירים הראשון ואחריהם תפירת העור. במקום החיה על כרית חמה בכלוב במשך 30 דקות עד החיה יחלים. להתבונן החיה עד מהפעולה מפעילות רגילה.
3. תורם/נמען אוגר הכנת לוח זמנים
- צג ולהקליט מחזורים estrous.
הערה: אוגרים הנקבה יש 4 יציב-ימים של ייחום המתוחזק מיד לאחר parturition. ניתן לזהות נקבות ביום הראשון של estrous על ידי אטום, צהבהב, דביק הפרשות מהנרתיק (איור 2 א). נקבות ביום הרביעי של estrous ניתן לזהות באמצעות ריר שקוף, דביק (איור 2b). - עבור superovulation של התורם אוגר, superovulate הנקבות בגרו (> 6 שבועות) ביום הראשון של ייחום בזריקה ה-IP של גונדוטרופין סרום של סוסה הרה (PMSG; מומס ב- PBS כמו 50 IU/mL) (טבלה 1) בין 9-12 AM.
הערה: PMSG הוא עבור גרימת superovulation אך לא עבור סינכרון-ייחום. - 80 - h 84 לאחר הזרקה של PMSG (היום 4, 6-8 PM), מקום הנקבות בכלובים עם הזכרים להזדווגות. כמו אוגר matings התוצאה אינה הזדווגות מחבר, ודא matings מוצלחת על-ידי צפייה של matings.
- להכין נשים pseudopregnant על ידי הזדווגות הנקבות בגרו ביום הרביעי של estrous עם זכרים עיקור. לוח הזמנים של הכנת נקבות התורם וחתן מוצגות בטבלה מס ' 2.
הערה: נקבות בהריון אמיתי יכול לשמש גם נמענים, קרי, נשים עם צבע הפרווה להבדיל בין צבע זהוב מעוצבת עם הזכרים פורה באותו צבע. הגורים נגזר השתלת ניתן לזהות המבוססת על צבעי סמל. יתרון פוטנציאליים באמצעות נקבות בהריון אמיתי הוא עוברי endogenously המיוצר להבטיח הריונות מוצלחים ולעזור PN מוזרק עוברי להשתיל; חיסרון פוטנציאליים באמצעות נקבות בהריון אמיתי כמו נמענים היא PN מוזרק עוברי צורך להתחרות עם endogenously המיוצר העוברים להשתלה.
4. זיגוטה בידוד
- להכין תרבות בינוני (HECM-9; מתכון מתוארת תוספת 2), כפי שתואר לעיל McKiernan ו- Bavister12.
- יום אחד לפני זריקה PN, להכין זיגוטה טיפול מנות (µL 25/טיפה) ויש ירידה הזרקת PN (100 µL) במכסה של מאכל 35 מ מ עם HECM-9. לאחר מכן מכסים את הטיפות בינוני עם שמן מינרלי. שיווי משקל בינוני באינקובטור ללון בתנאים הבאים: 37.5 ° C, 10% CO2, 85% N 5% או2, 2 , ו- 100% לחות.
- יום המתוזמנת עבור הזרקה PN, להכין מאכלים שטיפה העובר (אוגר צלחת/תורם 1) עם HECM-9 ולאחסן כל המנות בחממה עד השימוש.
- המתת חסד עם CO2אוגרים superovulated.
- בידוד oviduct
- הכנס אוגר נקבה לאללה recumbency הגבי מאסו כירורגי או ממחטת נייר ולהכין את הבטן עם תרסיס אתנול 70%.
- להחזיק העור, שכבת שריר הבטן בקו האמצע וביציבות בחתך. פצעים וחתכים של הצפק לחשוף את אברי הבטן.
- לאחוז באחד הקרניים הרחם עם מלקחיים בסדר ומשכו את הרקמה מהבטן. להפריד בין הרחם לבין הרקמה mesometrium ושומן. לעשות חתך בין של oviduct ו השחלה ואת חתך השני סמוך לצומת של oviduct ואת הרחם (כולל חלק קטן של הרחם). מקם את שני oviducts בצלחת ריקון אותו.
- להוריד ולאסוף מופרות
- תחת המיקרוסקופ לנתיחה, תופס את הצד של קרן הרחם עם מלקחיים דומונט #5 להכניס מחט תוצרת בית (איור 3) לתוך לומן של oviduct אנד infundibular, לרוקן את oviduct עם 300-400 µL בינוני HECM-9.
- לאסוף את מופרות באופן מיידי ולשטוף אותם פעמיים עם HECM-9 במדיום הצלחת הטיפול. בשלב זה של התפתחות, כולן מופרות צריכה שברציונליות מתאי קומולוס.
- מקם את מופרות בתוך אינקובטור (37.5 ° C, 10% CO2, 5% או2, 85% N2 ו- 100% לחות) מיד לאחר איסוף כדי למזער את החשיפה לאור.
5. PN הזרקה
- להפשיר את RNP Cas9/sgRNA על הקרח ולשמור על המתחם על קרח במהלך התהליך הזרקת PN.
- לטעון את המחטים הזרקת Cas9/sgRNA RNP פתרון מיד לפני הניסויים הזרקה. מניחים על חלקו האחורי של המחטים הזרקה לתוך הצינור המכיל את הפתרון Cas9/sgRNA RNP ולאפשר הפתרון RNP Cas9/sgRNA כדי למלא את המחט על ידי נימיות.
- להכין את המנה הזרקת מחטים. למלא את פיפטה מחזיק שמן מינרלי כדי בתוך ~ 3 מ מ של העיקול של המחט למחזיק. למקם את המחזיק microinjector עם קצה המחט האופקי לתחתית של המנה ולמלא את קצה המחט בינונית ביניקה. הגדר את המחט זריקה בזווית של 10-15° מול בעל.
- הזרקת PN
- לזהות זיגוטה ולהחיל יניקה בסדר עם המחט למחזיק. באופן אידיאלי, pronuclei זכר ונקבה הם בתוך אותו טווח מוקד, במקביל מיושר למחזיק.
- לחדור את zona ואת זכר pronuclei (בשעה 3 עמדה) עם מחט ההזרקה.
- תיסוג המחט הזרקת במהירות ברגע pronucleus מתנפח כדי למנוע את הגרעין של הקפדה על המחט, כדי למנוע נזק של pronucleus.
6. מופרות להעביר אוגרים Pseudopregnant
- עזים ומתנגד אוגר pseudopregnant (באותה דרך בה המתוארות בסעיף הניתוח לעיל), תניח אותם על מאסו כירורגי או נייר טישו יבש recumbency הגחון.
- חומרי סיכה העין חלות על העיניים של החיה כדי למנוע יובש בעין, לכסות את הראש עם בד או נייר כדי להגן על העיניים מפני אור. הכן את הפן הלטראלי של הגוף על ידי גילוח שטח העור 4 ס"מ על 4 ס"מ על כל הצדדים של הגוף ולאחר מכן על-ידי החלת 3 פעמים של פי 3 70% אתנול קרצוף והחלוקים povidone יוד. לבצע חתך אנכי 2 ס מ 2 ס מ סימטרית הצלע האחרונה (כפי שמוצג דמויות 4a, 4b) בכל צד של החלק האחורי של החיה.
- משטח שמן עם מלקחיים ומשוך בעדינות עד oviduct של הרחם גלויים. תהדק את משטח שמן עם. טוב ומשקפים את משטח שמן dorsally מעל עמוד השדרה (איור 4 c). מקם את באיברי הרבייה כזה יכול להיות שחדר הצינור הרחם עם מחט מד 30 להעברת העובר (איור 4 d).
- לשטוף את מופרות מוזרק עם HECM-9 בתבשיל חדש. להשתמש על פיפטה מזכוכית חדש (קוטר: ~ 150-200 מיקרומטר) כדי לטעון מופרות 10-15. לארגן את מופרות כשרשרת פנינים ואחריו מספר בועות אוויר. להוסיף על פיפטה לתוך הצינור אף פתוח משלב 6.3, נשוף בעדינות לתוך פיפטה כדי להעביר את מופרות oviduct. המשיכו לנשוף עד בועת האוויר הראשון הוא שוחרר לתוך מערכת oviduct (איור 4e).
- לשחרר את משטח שמן ולחזור הרקמה אל הבטן. העברה בקירוב אותו מספר (10-15) של העוברים מוזרק עוד בדרכי oviduct על ידי התהליכים.
- תפר את מערכת השרירים והעור ב 2 שכבות. לנהל הבופרנורפין-HCL (0.5 מ ג/ק ג) subcutaneously כמו נגד כאבים לאחר הניתוח. לחזור האוגר בכלוב ולמקם את הכלוב על משטח חם להתאוששות. להחזיר את הכלוב לחדר בעלי חיים כאשר החיה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. משככי כאבים לאחר הניתוח מקבלים שוב כעבור 6 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היעילות של הפרוטוקול המתואר בהפקת אוגרים מהונדסים תלוי התוצאות של שני קריטי בשלבים הבאים: live הילודה של נקבות הנמענים ואת מספר הגורים בשידור חי עם השינויים הגנטי המיועד. קצב הילודה live הוא של תוצאות ישירות של איכות העובר את המיומנות של הפרט מבצע את הזרקת PN העובר נהלי ההעברה. כדי להבטיח כי הפוטנציאל ההתפתחותי של עוברי מניפולציה לא נפגעת, נדרשת זהירות רבה במהלך הטיפול במבחנה של העוברים אוגר. אנחנו באופן קבוע להשיג שיעור הלידה live של 60-80% עם הנקבות הנמען pseudopregnant. טבלה 3 מדגים שיעורי הילודה live מהניסוי נוקאאוט RAG1 (נקבות pseudopregnant שימשו) ועל הניסוי נוק ' STAT2 ' (נכון נקבות שחור בהריון שימשו; live הילודה במקרה זה מחושב כמו אחוז המלטות הפיק הגורים הזהב).
האחוז של הגורים מהונדסים המופק PN מוזרק עוברי תלוי בשני את היעילות של sgRNA מכריע indels, הזרקה מוצלח של ribonucleoproteins Cas9/sgRNA pronuclei. מצאנו כי יעילות sgRNA משתנה בין מטרות הגן (שלא פורסמו תצפיות). כפי שמוצג בטבלה3, הביא sgRNA מיועד STAT2 גן מיקוד יעילות של 88.9%, בזמן sgRNA עבור RAG1 היה יעיל רק 28.6%. איור 5 מספק דוגמה genotyping תוצאות PCR הגבלת שבר אורך פולימורפיזם (PCR-RFLP) וזמינותו של הגורים של RAG1 גן מיקוד. חשוב לציין כי חלק indels עלולה להתרחש מחוץ הרצף זיהוי אנזים הגבלה, כך PCR-RFLP עלול להמעיט את הגן מיקוד יעילות. Subcloning את המוצרים PCR לתוך TA שיבוט וקטורים ואחריו סנגר רצף של ה-PCR מוסיף נחוצים על הגן למדוד במדויק מיקוד יעילות וכדי לחשוף את אופי indels.
איור 1: האוגר עיקור.
a) , b) עושים חתך אנכי 2 ס מ מתחיל 1.5 ס מ הגולגולת כדי ערלה הרחבת cranially; c) להפריד את כבוד vas מן הווריד האשכים המשויך עורק עם שני זוגות של מלקחיים; d) לקלוט את הזרע עם מלקחיים ליצור לולאה 1 ס מ. מחממים עוד זוג מלקחיים, נכנסים לתמונה תוך כדי cauterizing את הקצוות בו-זמנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ייחום.
a) הפרשות מהנרתיק מובחנים יום 1 הוא אטום, צהבהב, דביק b) מקהים הפרשות מהנרתיק ביום הרביעי הוא ברור ודביק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הכנה של המחט לבידוד העובר.
) שבר של מחט בקוטר 30 לאורך הקו האדום ולהבריק את הטיפ עד שזה שטוחה וחלקה. b) להפוך את זווית 30-40 מעלות-~ 3 מ מ מהקצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: העברה זיגוטה.
a) , b) עושים חתך אנכי ארוך 2 ס מ החל 2 ס מ סימטרית כדי הצלע האחרונה (הקו האדום); c) תהדק את משטח שמן עם. טוב ומשקפים את הרקמה dorsally; d) להתאים את מיקום oviduct בדרכי ולחדור פתוח עם מחט מד 30; e) לארגן מופרות כשרשרת פנינים בתוך הזכוכית העברה העובר פיפטה, מעבירים oviduct אף פתוח. בר = 1, 000 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. ה-PCR-RFLP וזמינותו בהמלטה אחת של מייסד חיות עם RAG1 Indels. M: 1 Kb פלוס הסולם. WT: פראי סוג. מזהה 1, 3 ו-7 להראות הלהקה נימולים בקנה אחד עם RAG1 indels. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| משקל הגוף (g) | PMSG (IU) | PMSG (ul) |
| < 110 | 10 | 200 |
| 110-135 | 15 | 300 |
| 135-160 | 20 | 400 |
| 160-185 | 25 | 500 |
| > 185 | 30 | 600 |
| PMSG, gonadatropin סרום של סוסה הרה | ||
טבלה 1. PMSG אינה המתאים הגוף משקולות
| אוגר | יום 1 | יום 2 | יום 3 | יום 4 | יום 5 |
| התורם | PMSG (9-12 am) | ההזדווגות (6-8 pm) | זיגוטה בידוד (12-1 pm) | ||
| הזרקת PN (1-3 pm) | |||||
| נמען | ההזדווגות (6-8 pm) | השתלת (3-5 pm) |
בטבלה 2. הזמנים של הכנה התורם/נמען
| גנים | חחח עוברי (הגורים) | חחח המלטות (נמענים) | חחח הגורים חיובי (%) |
| STAT2 | 229 (54) | 14 (19) * | 48 (88.9) |
| RAG1 | 77 (21) | 3 (3) | 6 (28.6) |
| נקבות מעוצבת עם זכרים פורייה שימשו; מספר המלטות המצוין הוא רק הגורים הזהב שהופק האלה. | |||
בטבלה 3. היעילות של גן מיקוד ב אוגר סורי זהוב על ידי מערכת Cas9/sgRNA
| תנאי/טיפול | דרישות | הערות |
| תאורת | לבטל את כל תאורת | אוגר עוברי רגישות לאור, במיוחד כדי לקרר אור |
| אור במהלך טיפול הפרייה | פחות מ 20 דקות להזרקה PN | לתמרן עוברי 15 בכל סיבוב כדי לצמצם חשיפה קלה. |
| טמפרטורה | טמפרטורת הסביבה: 28±0.5 oC | אוגר עוברי רגישים תנודות הטמפרטורה |
| טיפול טמפרטורה: 37.5 oC | ||
| בינוני | HECM-9 | אין לאחסן יותר מ 3 ימים |
| מצב התרבות | 37.5 oC, 10% CO2, 5% O2 ו-100% לחות | באיזון בין לילה חממה |
| גידול לאחר השתלת | אל תשנה את הכלוב בתוך 5 ימים לפני/אחרי יעד תאריך | המטופל משמידה הגורים אם מופרע; לספק הזנה/מים |
בטבלה 4. לדרישות ייחודיות על אוגר העובר טיפול, גידול
תוספת 1: לסנתז sgRNA על-ידי ערכת סינתזה של דיוק GeneArt. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
תוספת 2: אוגר העובר תרבות בינוני-9 (HECM-9) המתכון. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדאי לנצל את הפוטנציאל של אוגרים סוריים הזהב כמודלים של מחלות אנושיות, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN להעברת של CRISPR/Cas9 מורכבים כדי למקד את הגנום אוגר. פרוטוקול הזרקת PN מיטוב מספר משתני מפתח לרבות העובר תרבות בינוני, טמפרטורה, אורכי גל של אור13. ישנם גם מספר הליכים ספציפיים אוגר לטיפול בבעלי חיים צריך לעקוב בהצלחה המסויים ג'ין פילוח האוגר. לדוגמה, התבגר מינית אוגרים הנקבה יש יציבה מחזורים estrous 4 ימים שאין אפשרות לסנכרן עם הורמונים אקסוגני (למשל PMSG). לפיכך במדויק מעקב אחר שמחזורי estrous כל נקבה הוא חשוב הן superovulation והן pseudopregnancy הכנה. 30 - 60 מופרות ניתן להפיק נקבה אם היא superovulated בהצלחה. כדי להשיג superovulation מוצלחת, יש צורך לשקול הפקדת תלויי מין של שומן. אוגרים הנקבה, במיוחד אלה מעל 12 שבועות של גיל, נוטים להיות בעלי עודף שומן בבטן כך מחט מזרק חייבת להיות ממוקמת כראוי לחדור באופן מלא כרית השומן בעת ביצוע הזרקת הורמונים. מצאנו כי חדירה במחצית הדרך לתוך חלל הצפק משיגה את המרחק המתאים למסירה הורמון. אנחנו סיכם הדרישות הייחודיות PN הזרקה, אוגר טיפול, גידול בטבלה4.
להזרקה PN, מספר העוברים הועבר המנה הזרקת לכל סיבוב של הזרקת להיקבע השפעול להימנע הפעם הזרקת המורחבת. ככל הזמן העוברים נותרים בצלחת, כך גדל הסיכוי שהם חווים חשיפת יתר לאור. אנו ממליצים להעביר כ 15 עוברי למנה הזרקת לכל סיבוב של זריקות. מספר זה משיג איזון טוב בין מספר סיבובים של זריקות, חשיפה נסבלים של העוברים אל האור. כמו שתי הממברנות cytoplasmic ואת pronuclear של אוגר העוברים הם גמיש למדי, כוח משמעותי חייב לחול על המחט הזרקת לחדור את הממברנה של pronucleus. במהלך תקופה זו, pronuclei חייבת להישאר בטווח מוקד.
חוקרים לשקול ניתוח הבעיות הבאות בעת ביצוע העברות העובר. ראשית, חשוב כי חתכים דרך הקיר הגוף מתאימות לגודל הגוף של החיה. אם החתך הוא קטן מדי, זה עלול לגרום ההבלטה של מופרות של oviduct כאשר חוזרים באיברי הרבייה של הבטן. בנוסף גודל החתך, ניתן למזער את הפוטנציאל לשחול של מופרות מ oviduct ע י טיפול כרית השומן משויך יותר מאשר הרקמה הרבייה נכונה. לגבי גודל החתך, חשוב גם לקחת בחשבון כי חתכים גדולים יותר עלול לגרום ללחץ נוסף לחיה, התערוכה הסתברות גבוהה יותר של סיבוכים (למשל התבקעות זיהום). שנית, כדי למזער את הדימום, חוקרים צריכים לדאוג להימנע אם כלי הדם בעת גישה הבטן בגלל איבוד דם עודף יכול להגביר את הלחץ הניתוח כדי להפחית את ההצלחה של השתלת, להאריך את זמן ההחלמה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZW יש אינטרסים כלכליים בביוגרפיה לדייק, LLC., חברה מתמחה ביצירת חיות מהונדס גנטית המחקר הביו-רפואי ויישומים חקלאיים.
Acknowledgments
מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של מכוני הבריאות הלאומיים תחת 1R41OD021979 מספר פרס (כדי ZW) ועל -ידי מענק מחקר של 21 BioGreen הדור הבא התוכנית, הרפובליקה של קוריאה, להעניק. לא. PJ01107704 (כדי ZW) ולהעניק לא. PJ01107703 (כדי IK). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נוף הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים או BioGreen 21. אנו מודים ד ר ניקולס Robl על עריכת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
