Pronuclei iniezione (PN) del cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) e sistema di CRISPR-collegato della proteina-9 nucleasi (CRISPR/Cas9) è un metodo altamente efficiente per produrre geneticamente criceti dorati siriani. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato di PN iniezione per la produzione di gene knockout criceti con il sistema CRISPR/Cas9.
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Articolo metodologico
Produzione di geneticamente criceti dorati siriani di pronuclei iniezione del complesso CRISPR/Cas9
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnica di iniezione pronuclei (PN) è stata fondata in topi per introdurre materiale genetici estraneo in pronuclei di embrioni in fase uno-cella. Materiale genetico introdotto può integrarsi nel genoma embrionale e generare animali transgenici con stranieri informazioni genetiche dopo il trasferimento degli embrioni iniettati per favorire le madri. Dopo il successo nei topi, iniezione di PN è stato applicato con successo in molte altre specie animali. Recentemente, iniezione PN è stato impiegato con successo per introdurre i reagenti con gene-modifica attività, quali il sistema CRISPR/Cas9, per ottenere le modifiche genetiche site-specifiche in laboratorio diversi e specie animali da fattoria. Oltre alla padronanza il set speciale di microiniezione competenze per la produzione di animali geneticamente modificati mediante iniezione di PN, i ricercatori devono capire la fisiologia della riproduzione e il comportamento delle specie bersaglio, perché ogni specie presenta unico sfide. Ad esempio, criceto siriano embrioni hanno unica gestione requisiti in vitro tale che tecniche di iniezione di PN non erano possibili in questa specie fino alle recenti scoperte dal nostro gruppo. Con il nostro protocollo per volta specie iniezione PN, siamo riusciti a produrre diversi knockout del gene (KO) e knockin criceti (KI), che sono stati utilizzati con successo per malattie umane modello. Qui descriviamo la procedura di iniezione di PN per la consegna del complesso CRISPR/Cas9 per gli zigoti del criceto, le condizioni di manipolazione dell'embrione, le procedure di trasferimento dell'embrione, e allevamento necessaria per produrre geneticamente modificati criceti.
Introduzione
Criceto siriano dorato (Mesocricetus auratus) è uno dei roditori più ampiamente usati per la ricerca biomedica. Secondo l'US Department of Agriculture, circa 100.000 criceti sono stati usati negli Stati Uniti nel 2015, che rappresentano il 13% di utilizzo degli animali di laboratorio totale tra specie contemplate dall'Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; letta 10 marzo 2017).
Il criceto offre parecchi vantaggi sopra altri roditori nello studio di un certo numero di malattie umane. Ad esempio, l'istopatologia dell'ammina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) indotto da adenocarcinomi duttali in criceto è simile a tumori pancreat....
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Protocollo
Le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Utah State University (protocollo IACUC: 2484). Criceti utilizzate nel presente protocollo sono adulti (6-10 settimane di età) LVG ceppo criceti dorati siriani. Tutti i criceti sono alloggiati in Vivario presso il centro Bioinnovation, Utah State University. Temperatura ambiente è impostato a 23 ° C, umidità è fissato al 40-50% e ciclo di luce è impostato 14:00 (luce: scuro). Quando possibile, le procedure di manipolazione e surugical di embrione devono essere eseguite con tecniche sterili.
1. sgRNA e Cas9/sgRNA ribonuc....
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Risultati
L'efficienza del protocollo descritto nella produzione di criceti geneticamente dipende dai risultati delle seguenti due fasi critiche: il tasso di nati vivi di femmine destinatario e il numero di cuccioli dal vivo con delle modificazioni genetiche previste. Il tasso di natalità è un risultato diretto della qualità degli embrioni e l'abilità dell'individuo di eseguire l'iniezione di PN e procedure di trasferimento dell'embrione. Per garantire che il potenziale inerente allo sviluppo degli.......
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Discussione
Per sfruttare meglio il potenziale di criceti dorati siriani come modelli della malattia umana, abbiamo sviluppato un protocollo di iniezione PN per la consegna di un CRISPR/Cas9 complesso per impostare come destinazione il genoma di criceto. Il protocollo di iniezione PN ottimizza diverse variabili chiave, tra cui il terreno di coltura dell'embrione, la temperatura e lunghezze d'onda della luce13. Ci sono anche parecchie procedure di gestione animale criceto-specifica che è necessario seguire per.......
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Dichiarazioni
ZW ha interessi finanziari in Auratus Bio, LLC., una società di biotecnologie specializzata nella creazione di animali geneticamente ingegnerizzati per applicazioni agricole e ricerca biomedica.
Ringraziamenti
Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal istituti nazionali di Allergy and Infectious Diseases (NIAID) dei National Institutes of Health, sotto il 1R41OD021979 numero premio (a ZW) e di un assegno di ricerca dal 21 BioGreen Next-Generation Programma, Repubblica di Corea, concedere no. PJ01107704 (a ZW) e concedere no. PJ01107703 (per IK). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health o BioGreen 21. Ringraziamo il dottor Nikolas Robl per il manoscritto di editing.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μ g/μ L (~6.1 μ M) |
| GeneArtTM Kit di sintesi di precisione | Invitrogen | A29377 | Per la sintesi di sgRNA |
| Albumina da siero umano | Sigma | A1653 | Per terreno di coltura |
| Illuminatore | Nikon | NI-150 | Per il trasferimento di embrioni |
| Incubatrice | New Brunswick | Galaxy 14S | Per la coltivazione di embrioni |
| Microforge | Narishige | PB-7 | Per fare aghi per iniezione |
| Microscopio | Nikon | ECLIPSE Ti-S | Per microiniezione |
| Microscopio | invitrogen | SMZ745T | Per il trasferimento di embrioni |
| Olio minerale | Sigma | M1840 | Tenere al buio |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | Per la superovulazione |
Riferimenti
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K.
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Ristampe e permessi
