Summary
Pronukleär (PN) injektion av den klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) och CRISPR-associerade protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system är en mycket effektiv metod för att producera genetiskt modifierade gyllene syriska hamstrar. Häri, beskriver vi detaljerad PN injektion protokollet för produktion av genen knockout hamstrar med CRISPR/Cas9-systemet.
Abstract
Den pronukleär (PN) injektionstekniken fastställdes först hos möss att införa främmande genetisk material i pronuclei one-cellstadie embryon. Det införda genetiska materialet kan integrera i embryonala genomet och generera transgena djur främmande genetisk information efter överföring av de injicerade embryona för att främja mödrar. Efter framgångarna i möss, PN injektion har tillämpats framgångsrikt i många andra djurarter. Nyligen, PN injektion har lyckat använts att införa reagenser med gen-ändra aktiviteter, såsom CRISPR/Cas9 system att uppnå platsspecifika genetiska modifikationer i flera laboratorium samt djurarter. Förutom att behärska den speciella uppsättningen Mikroskop färdigheter att producera genetiskt modifierade djur genom PN injektion, måste forskare förstå de reproduktion fysiologi och beteende målarter, eftersom varje art presenterar unika utmaningar. Exempelvis gyllene syriska hamster embryon har unik hantering krav för in vitro- sådan att PN injektionstekniker inte var möjliga i denna art tills senaste genombrott av vår grupp. Med våra arter-modifierade PN injektion protokoll, har vi lyckats producera flera gen knockout (KO) och knockin (KI) hamstrar, som har använts framgångsrikt till modell mänskliga sjukdomar. Beskriver här vi PN injektionsproceduren för att leverera den CRISPR/Cas9 komplexa till zygoter hamster, embryo hantering villkor, embryo transfer förfaranden och djurhållning som krävs för att producera genetiskt modifierade hamstrar.
Introduction
Den gyllengula syriska hamstern (Mesocricetus auratus) är en av de mest använda gnagarna för biomedicinsk forskning. Enligt US Department of Agriculture användes ungefärligt 100.000 hamstrar i USA under 2015, vilket motsvarar 13% av totala laboratorium djur användning bland de arter som omfattas av djurskyddslagen (http://www.aphis.usda.gov; nås 10 mars 2017).
Hamster erbjuder flera fördelar jämfört med andra gnagare i studien av ett antal mänskliga sjukdomar. Exempelvis de histopatologi N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) inducerad pankreas duktal adenokarcinom i hamster är liknande till människors Pankreastumör, medan BOP behandling främst inducerar sköldkörteln tumörer hos råttor och lung och levertumörer hos möss1. Eftersom hamstrar är endast små gnagare hittade för att stödja replikering av adenoviruses, är de också modellen av val för att testa adenovirus-baserade onkolytisk vektorer och anti adenovirus droger2,3,4. Ett annat exempel vari hamster modellen erbjuder en fördel över möss och råttor är i studien av hyperlipidemi. Människor och hamstrar uppvisar stora likheter i lipid metaboliska vägar och båda arter bära den gen som kodar cholesteryl ester transfer protein (CETP), som spelar en central roll i lipid metabolismerna, medan CETP är frånvarande i möss och råttor5. Dessutom utveckla hamstrar hemorragisk sjukdom mer representativt av den mänskliga manifestation efter exponering för Ebola virus6. Hamstrar är också modeller av val för att studera ateroskleros7, muntliga carcinom8och inflammatoriska myopatier9. Nyligen har visats det också att hamstrar är mycket mottagliga för Anderna virusinfektion och utveckla hantavirus pulmonella syndrom-liknande sjukdom, ger den endast gnagare modellen av Anderna virus infektion10.
För att lösa otillfredsställda behov av nya genetiska djurmodeller studera de mänskliga sjukdomar där ingen pålitlig liten gnagare modell är tillgängliga, vi nyligen lyckats tillämpar CRISPR/Cas9 systemet till hamstern och har producerat flera rader av genetiskt bakåtkompilerade hamstrar11. Hamster zygoter är mycket känsliga för miljömässiga miljöer så att de PN injektion protokoll som utvecklats i andra arter är olämpliga. Därför utvecklade vi en PN injektion protokoll för hamster som rymmer de särskilda krav för hantering av hamster embryon in vitro. Här beskriver vi detaljerad PN injektionsproceduren med CRISPR/Cas9 systemet och medföljande stegen, från beredning av enda guide RNA (sgRNA) till överföringen av injicerade embryon till mottagarens honor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerna som beskrivs i detta protokoll godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) från Utah State University (IACUC protokoll: 2484). Hamstrar som används i detta protokoll är vuxen (6-10 veckors ålder) LVG stam gyllene syriska hamstrar. Alla hamstrar är inrymda i ett vivarium på Bioinnovation center, Utah State University. Rumstemperatur ligger vid 23 ° C och luftfuktigheten ligger på 40-50% ljus cykel ligger 14L: 10D (ljus: mörk). Om möjligt bör embryo manipulation och surugical utföras med steril teknik.
1. sgRNA och Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) förberedelse
- Syntetisera sgRNAs efter in vitro- transkription procedurerna som beskrivs i handboken för syntes kit (material tabell, tillägg 1).
- Att montera ribonucleoproteins, blanda 2 µg av Cas9 med 1 µg av sgRNA och inkubera mixen i rumstemperatur i 10-15 min. PN injektionsvätska, göra en fungerande lösning med en koncentration på 100 ng/µL Cas9 och 50 ng/µL sgRNA med 10 mM TE buffert (RNase gratis, Material tabell).
2. vasektomi förberedelse
Obs: Vasektomi utförs på manliga hamstrar vid 6-8 veckors ålder. Operationen bör utföras 10-14 dagar före första parningen. Sterilitet bekräftas av misslyckade graviditeter från parning med fertila honor. Vasektomerade hanar kan normalt användas i ett år innan de blir mindre sexuellt aktiva.
- Söva hanar av intraperitoneal (IP) injektion av ketamin/xylazin med en dos på 40 mg/kg (ketamin) och 10 mg/kg (xylazin). Bekräfta anestesi genom avsaknaden av en pedal reflex (tå nypa).
- Lägg sederad hamster i dorsala koordinationsrubbning på en torr mjukpapper. Skölj buken med tre rundor av antiseptiska behandlingar av omväxlande kirurgisk skrubba lösningar mellan 70% alkohol och povidonjod.
- Göra ett vertikalt snitt med kirurgisk sax börjar 1,5 cm kraniala att förhuden sträcker sig 1 cm på varje sida från mitten av linje (figur 1a). Incisionsfilm i huden, subkutan vävnad och linea alba tillgång till peritoneal utrymme (figur 1b).
- Gälla den caudal aspekt av pungen att tvinga testiklarna och fettvävnad ut lätt tryck. Greppa sädesledaren försiktigt med pincett och noggrant separat blodkärl från fordonslarmet med en andra uppsättning pincett (figur 1 c).
- Håll sädesledaren med pincett att bilda en ögla. Värma spetsen av en annan pincett i lågan tills det är röda, och sedan använda den för att ta bort loopen av sädesledaren. Infoga fettvävnad och testiklarna tillbaka till buken. Ta bort sädesledaren på den motsatta sidan med samma förfaranden.
- Sutur muskulaturn först, följt av suturering huden. Placera djuret på en varm platta i en bur för 30 min tills djuret återvinner. Iaktta djuret tills det återupptar normal aktivitet.
3. givare/mottagare Hamster förberedelse schema
- Övervaka och registrera brunst cykler.
Obs: Kvinnliga hamstrar har en stabil 4-dagar östruscykel som underhålls direkt efter förlossning. Kvinnor på den första dagen av estrous kan identifieras genom den ogenomskinlig, gulaktig och klibbiga flytningar (figur 2a). Kvinnor på dag 4 av estrous kan identifieras genom det genomskinliga, klibbiga slemmet (figur 2b). - För superovulation av givare hamster, superovulate könsmogna honorna (> 6 veckor) på den första dagen i östruscykel genom IP-injektion av på gravida mare serum gonadotropin (PMSG; upplösta i PBS som 50 IE/mL) (tabell 1) mellan 9-12 AM.
Obs: PMSG är för framkalla superovulation men inte för östruscykel synkronisering. - 80 - 84 h efter injektion av PMSG (dag 4, 6-8 PM), placera honorna i burar med hanar för parning. Som hamster parningar inte leder parning pluggar, säkerställa lyckade parningar genom att titta på parningar.
- Förbered pseudopregnant honor genom parning könsmogna honor på dag 4 av estrous med vasektomerade män. Tidsschema för förbereder givare och mottagare kvinnor visas i tabell 2.
Obs: Sanna dräktiga honor kan också användas som mottagare, dvs., honor med en päls färg kan särskiljas från den gyllengula färgen tovigt med samma färg fertila hanar. Valpar som härrör från embryotransfer kan identifieras baserat på coat färger. En potentiell fördel i att använda sanna dräktiga honor är att endogent producerade embryon skulle garantera lyckade graviditeter och hjälpa PN injiceras embryon att implantatet; en potentiell nackdel med sann dräktiga honor som mottagare är att PN injiceras embryon behöver konkurrera med endogent producerade embryon för implantation.
4. zygot isolering
- Förbereda odlingsmedium (HECM-9; recept beskrivs i tillägg 2), som tidigare beskrivits i McKiernan och Bavister12.
- En dag före PN injektion, förbereda zygot hantering rätter (25 µL/droppe) och en PN injektion droppe (100 µL) i locket på en 35 mm maträtt med HECM-9. Sedan täcka den medelstora droppar med mineralolja. Balans medium i en inkubator över natten under följande förhållanden: 37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 och 100% luftfuktighet.
- Samma dag som planerats för PN injektion, förbereda embryo rodnad rätter (1 maträtt/givaren hamster) med HECM-9 och lagra alla rätter i inkubatorn fram till användning.
- Euthanize superovulated hamstrar med CO2.
- Äggledaren isolering
- Placera en euthanized kvinnliga hamster i dorsala koordinationsrubbning på en kirurgiska draperi eller mjukpapper och förbereda buk med en 70% etanol spray.
- Stadigt hålla hud och magmuskelstation lager vid mittlinjen och gör ett snitt. Incisionsfilm bukhinnan för att exponera bukorganen.
- Greppa en av livmoderns horn med en fin peang och dra in vävnaden från buken. Separata livmodern från mesometrium och fett vävnad. Gör ett snitt mellan äggledaren och äggstock och ett andra snitt intill korsningen av äggledaren och livmodern (inkluderar en liten del av livmodern). Placera de två oviducts i samma färg skålen.
- Spola och samla zygoter
- Under dissektion mikroskopet, greppa sidan av livmoderns horn med en #5 Dumont pincett och infoga en hemmagjord nål (figur 3) i lumen av äggledaren från TRATTFORMIG slutet och spola i äggledaren med 300-400 µL av HECM-9 medium.
- Samla zygoter omedelbart och tvätta dem två gånger med HECM-9 medium i hantering skålen. I detta skede av utvecklingen, bör alla zygoter att vara utblottad från cumulus celler.
- Placera zygoter i en inkubator (37,5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 och 100% luftfuktighet) omedelbart efter samlingen att minimera exponering för ljus.
5. PN injektion
- Tina den Cas9/sgRNA RNP på is och underhålla anläggningen på is under hela PN injektionsprocessen.
- Ladda injektionsnålar med Cas9/sgRNA RNP lösning omedelbart före injektion experimenten. Placera den bakre änden av injektionsnålar i röret som innehåller Cas9/sgRNA RNP lösningen och låt Cas9/sgRNA RNP lösningen Fyll nålen genom kapillärkraft.
- Förbered injektionsstället maträtt och nålar. Fyll innehavaren pipetten med mineralolja till ~ 3 mm av krökningen av innehavaren nålen. Innehavaren av microinjector med spetsen på nålen horisontella till botten av skålen och Fyll spetsen på nålen med medium genom undertryck. Ställ in injektionsnålen i 10-15° vinkel motsatsen till innehavaren.
- PN injektion
- Identifiera en zygot och tillämpa en fin sug med innehavaren nålen. Helst, de manliga och kvinnliga pronuclei är inom samma brännvidd och arrangera i rak linje parallell till innehavaren.
- Tränga in i zona och manliga pronuclei (3 oclock ' position) med en injektionsnål.
- Dra ut injektionsnålen snabbt när pronucleus sväller att förhindra kärnan från att nålen och att undvika att skada pronucleus.
6. zygoter överföring till Pseudopregnant hamstrar
- Söva en pseudopregnant hamster (på samma sätt som beskrivs i avsnittet vasektomi ovan) och lägga den på en kirurgiska draperi eller torr mjukpapper i ventrala koordinationsrubbning.
- Tillämpa öga smörjmedel för ögonen på djuret att förhindra torra ögon och täcka huvudet med en trasa eller papper för att skydda ögonen från ljus. Förbereda den laterala delen av kroppen genom rakning en ca 4 x 4 cm hudområde på varje sidor av kroppen följt av Applicera 3 gånger av povidonjod scrubs och 3 gånger 70% etanol scrubs. Gör en 2 cm vertikala snitt 2 cm kaudalt till revbenet (som visas i figurerna 4a, 4b) på varje sida av baksidan av djuret.
- Greppa den fett pad med pincett och dra försiktigt tills äggledaren och livmodern blir synliga. Klämma fettet pad med en Peanger och reflektera fettet pad dorsalt över ryggraden (figur 4 c). Placera fortplantningsorganen så att livmodern röret kan brytas med en 30 gauge nål för embryoåterföring (figur 4 d).
- Tvätta de injicerade zygoter med HECM-9 i en ny maträtt. Använda nya glas pipett (diameter: ~ 150-200 µm) till lasta 10-15 zygoter. Ordna zygoter som en kedja av pärlor följt av flera luftbubblor. Sätt pipetten i öppen trängda igenom röret från steg 6.3 och blås försiktigt in i pipetten att överföra zygoter till i äggledaren. Fortsätta blåsa tills första luftbubblan släpps in i äggledaren tarmkanalen (figur 4e).
- Släppa fettet pad och återgå vävnaden till buken. Överföra ungefär samma antal (10-15) av injicerade embryon till en annan äggledaren tarmkanalen genom samma processer.
- Sutur muskulaturn och huden i 2 lager. Administrera buprenorfin-HCL (0,5 mg/kg) subkutant som post-op analgesi. Återgå hamster till en bur och placera buren på en varm pad för återvinning. Returnera buren till djur rummet när djuret är helt återhämtat sig från anestesi. Post-op analgetika ges igen sex timmar senare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs i producerar genetiskt modifierade hamstrar effektivitet beror på resultaten från följande två viktiga steg: live födelsetalen av mottagarens honor och antalet levande valpar med de avsedda genetiska modifieringar. Live nativiteten är ett direkt resultat av embryo kvalitet och skicklighet av individen utför PN injektionsstället och embryo transfer förfaranden. För att säkerställa att den utvecklande potentialen hos manipulerade embryon inte äventyras, är stor omsorg nödvändig under in vitro- hantering av hamster embryon. Vi uppnå regelbundet en live nativitet 60-80% med pseudopregnant mottagarens honor. Tabell 3 visar live födelsetal från RAG1 knockout experiment (pseudopregnant honor användes) och STAT2 knockout experiment (sant gravida kvinnor användes; Frekvenslevande i detta fall beräknades som den procentandel av kullar produceras golden valpar).
Procentandelen av genetiskt modifierade valpar produceras från PN injiceras embryon är beroende av både effektiviteten av sgRNA införa indels och framgångsrika injektion av de Cas9/sgRNA ribonucleoproteins in pronuclei. Vi hittade att sgRNA effektivitet varierar bland gen mål (opublicerade observationer). I tabell 3visas den sgRNA som utformats för STAT2 resulterade i en gen som inriktning effektivitet 88,9%, medan sgRNA för RAG1 var bara 28,6% effektiv. Figur 5 ger ett exempel på genotypning resultat från en PCR-begränsning fragment längd polymorfism (PCR-RFLP) analysen av pups från RAG1 gen inriktning. Det är viktigt att notera att vissa indels kan förekomma utanför restriktionsenzym erkännande sekvensen, sådan att PCR-RFLP kan underskatta den genmodifiering effektivitet. Subkloning PCR-produkterna till TA kloning vektorer följt av Sanger sekvensering av PCR skär är nödvändigt att exakt mäta genmodifiering effektivitet och att avslöja beskaffenhet indels.
Figur 1: Manliga Hamster vasektomi.
(a) och (b) gör en 2 cm vertikala snitt börjar 1,5 cm kraniala att förhuden utvidga cranially; c) skilja den vas aktning från den associerade testikelcancer ven och artär med två par tången; d) greppa sädesledaren med en pincett att bilda en 1 cm slinga. Värm en andra uppsättning pincett och punktskatt slingan samtidigt Parkinsonsymtomen ändarna samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: östruscykel.
(a) det flytningar som observerats på dag 1 är ogenomskinlig, gulaktig och klibbiga b) det flytningar observerbart på dag 4 är klart och klibbig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Beredning av nålen för Embryo isolering.
en) fraktur en 30 gauge nål längs röda linjen och polera spetsen tills det är platt och slät. b) gör en 30-40 ° vinkel på ~ 3 mm från spets. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Zygot överföring.
(a) och (b) gör en 2 cm långa vertikala snitt start 2 cm kaudalt till det sista revbenet (röda linjen); c) klämma fettet pad med en Peanger och reflektera vävnaden dorsalt; d) justera positionen för äggledaren tarmkanalen och penetrera ett öppet med en 30 gauge nål; e) ordna zygoter som en kedja av pärlor inom embryo transfer glaset pipett och överföra dem till äggledaren från den trängda igenom öppen. Bar = 1, 000 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5. PCR-RFLP haltbestämning av en enda kull av grundaren djur med RAG1 Indels. M: 1 Kb Plus stege. WT: vildtyp. ID 1, 3 och 7 Visa uncut band överensstämmer med RAG1 indels. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vikt (g) | PMSG (IE) | PMSG (ul) |
| < 110 | 10 | 200 |
| 110-135 | 15 | 300 |
| 135-160 | 20 | 400 |
| 160-185 | 25 | 500 |
| > 185 | 30 | 600 |
| PMSG, gravid Mares serum gonadatropin | ||
Tabell 1. PMSG gör motsvarande kroppsvikter
| Hamster | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 |
| Givare | PMSG (9-12 am) | Parning (6-8 pm) | Zygot isolering (12-1 pm) | ||
| PN injektion (1-3 pm) | |||||
| Mottagare | Parning (6-8 pm) | Embryotransfer (3-5 pm) |
Tabell 2. Tidsplan för givare/mottagare förberedelse
| Gener | Lol Embryon (PUP) | Lol Kullar (mottagare) | Lol Positiva valpar (%) |
| STAT2 | 229 (54) | 14 (19) * | 48 (88,9) |
| RAG1 | 77 (21) | 3 (3) | 6 (28,6) |
| * kvinnor tovigt med fertila hanar användes; antalet kullar som anges är endast de producerade golden valparna. | |||
Tabell 3. Effektiviteten i genen Targeting i gyllene syriska Hamster av Cas9/sgRNA systemet
| Skick och hantering | Krav | Kommentarer |
| Omgivande ljus | Stäng av alla omgivande ljus | Hamster embryon är känsliga för ljus, särskilt svalna ljus |
| Ljus vid in vitro-hantering | Mindre än 20 min PN injektionsvätska | Manipulera 15 embryon per rond att minska ljus exponering |
| Temperatur | Omgivningstemperatur: 28±0.5 oC | Hamster embryon är känslig för temperaturvariationer |
| Hanteringstemperaturen: 37,5 oC | ||
| Medium | HECM-9 | Förvara inte mer än 3 dagar |
| Kultur skick | 37,5 oC, 10% CO2, 5% O2 och 100% luftfuktighet | Balanserad övernattning i inkubator |
| Djurskötsel efter embryoöverföring | Ändra inte buren inom 5 dagar före/efter vederbörlig datum | Mottagaren kommer att kannibalisera valpar om störd; ge tillräckligt mycket foder och vatten |
Tabell 4. Unika krav på Hamster Embryo hantering och djurhållning
Tillägg 1: syntetisera sgRNA av GeneArt Precision syntes Kit. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Tillägg 2: Hamster Embryo odlingsmedium-9 (HECM-9) recept. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att bättre utnyttja möjligheter som gyllene syriska hamstrar som modeller för humana sjukdomar, utvecklade vi ett PN injektion protokoll för att leverera en CRISPR/Cas9 komplexa för att rikta hamster genomet. PN injektion protokollet optimerar flera viktiga variabler inklusive embryo odlingsmedium, temperatur och våglängder av ljus13. Det finns också flera hamster-specifika djurhantering förfaranden som måste följa för att framgångsrikt bedriva gen inriktning i hamster. Exempelvis har sexuellt mognat kvinnliga hamstrar stabil 4-dagars brunst cykler som inte kan synkroniseras med exogena hormoner (t.ex. PMSG). Alltså exakt spårning brunst cykler av varje kvinna är viktigt för både superovulation och pseudograviditet förberedelser. 30 - 60 zygoter kan produceras från en kvinnlig om hon är framgångsrikt superovulated. För att uppnå framgångsrika superovulation, är det nödvändigt att överväga artspecifika nedfall av fett. Kvinnliga hamstrar, särskilt de under 12 veckor ålder, tenderar att ha överdriven bukfett sådan att sprutans nål måste placeras korrekt för att fullt tränger fettet pad när du utför hormon injektioner. Vi har funnit att penetration halvvägs in i bukhålan uppnår det lämpligt avståndet för hormon leverans. Vi sammanfattat de unika kraven för PN injektion, hamster hantering och djurhållning i tabell 4.
PN injektionsvätska, måste antalet embryon överförts till injektion skålen för varje omgång av injektion bestämmas experimentellt att undvika utökade injektion tid. Ju längre tiden embryon kvar i skålen, desto större är chansen att de upplever överexponering för ljus. Vi rekommenderar att överföra cirka 15 embryon till injektion skålen för varje omgång av injektioner. Detta nummer har en bra balans mellan antalet omgångar av injektioner och embryona acceptabel exponering för ljus. Som både av cytoplasmisk och pronukleär membran av hamster embryon är ganska flexibla, måste betydande kraft tillämpas på injektionsnålen penetrera membranet i pronucleus. Under denna tid måste pronuclei förbli inom brännvidd.
Forskare bör överväga följande kirurgiska problem när du utför embryo transfer. Först, är det viktigt att snitt genom kroppen väggen motsvarar Förkroppsliga storleksanpassar av djuret. Om snittet är för liten, kan det resultera i extrudering av zygoter från äggledaren när de återvänder fortplantningsorganen till buken. Utöver snittet storlek, kan potentialen för extrudering av zygoter från i äggledaren minimeras genom att hantera den associera fett pad i stället för den reproduktiva vävnaden som är korrekt. När det gäller snitt storlek är det också viktigt att tänka på att större snitt kan orsaka mer stress för djuret och uppvisar en högre sannolikhet för komplikationer (t.ex. infektion sårruptur). Andra, för att minimera blödning, forskare bör ta hand för att undvika öppning av stora blodkärl vid åtkomst till buken eftersom överskott blodförlust kan öka kirurgi stress för att minska framgången för överföring av embryon, och förlänga återhämtningstiden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZW har ekonomiska intressen i Auratus Bio, LLC., ett bioteknikföretag specialiserat på att skapa genetiskt modifierade djur för biomedicinsk forskning och lantbruk.
Acknowledgments
Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av de nationella institut för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID) av det nationella Institutes of Health under award nummer 1R41OD021979 (till ZW) och ett forskningsanslag från nästa generations BioGreen 21 Program, Republiken Korea, bevilja nr. PJ01107704 (till ZW) och bevilja nr. PJ01107703 (till IK). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health eller BioGreen 21. Vi tackar Dr. Nikolas Robl för redigering manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μg/μL (~6.1 μM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
