Summary
Sekundære degeneration af retinal ganglion celler (RGCs) forekommer almindeligt i glaukom. Denne undersøgelse beskriver en innovativ udløsende tilgang til delvis synsnerven transection. Brugen af denne pladsbesparende udløsende tilgang udvider Modelprogrammet ansøgning, og giver mulighed for udforskning af sekundære skade mekanismer i RGCs på en ny måde.
Abstract
Tidligere undersøgelser har vist, at den sekundære degeneration af retinal ganglion celler (RGCs) forekommer almindeligt i glaukom. Delvis synsnerven transection betragtes som et nyttigt og reproducerbare model. Sammenlignet med andre synsnerven skade modeller bruges almindeligvis til at vurdere sekundære degeneration, fx komplet synsnerven transection og synsnerven crush modeller, er delvis synsnerven transection model overlegen som sondrer den primære fra sekundære degeneration i situ. Derfor, det tjener som et udmærket redskab til evaluering af sekundære degeneration. Denne undersøgelse beskriver en roman udløsende tilgang af delvis synsnerven transection af direkte adgang til området i synsnerven retrobulbær gennem orbital laterale væg af øjeæblet. Desuden præsenterer vi en nydesignet, lave omkostninger kirurgisk instrument til at bistå med transection. Som det fremgår af de repræsentative resultater skelne grænse af primære og sekundære skade områder, sikrer instrument og ny tilgang høj effektivitet og stabilitet af model ved at give tilstrækkelig plads for kirurgisk indgreb. Dette gør igen det let at adskille meningeal kappe og oftalmologiske fartøjer fra synsnerven før transection. En ekstra fordel er, at denne plads-besparelse operative fremgangsmåde forbedrer efterforskere evne til at administrere lægemidler, luftfartsselskaber eller selektiv RGC røbestoffer til stump af delvist transected synsnerven, giver mulighed for udforskning af mekanismerne bag sekundære skade i RGCs, på en ny måde.
Introduction
Sekundære degeneration forekommer almindeligt i det centrale nervesystem (CNS) efter traumatiske skader, og følgende akut og kronisk neurodegenerative sygdomme. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 død af neuroner og gliaceller som en tidlig konsekvens af primære patologiske begivenheder kaldes primær degeneration, mens sekundære degeneration refererer til død af neuroner og gliaceller, som ikke eller kun delvist er påvirket af primær skader. Sekundære degeneration af RGCs er også menes at forekomme i glaukom. 6 Yoles et al. 7 bekræftet, at sekundære skade af RGCs opstår i synsnerven skade model. De viste, at neuroner hvis axoner ikke blev såret efter en akut skade vil i sidste ende udarte på grund af degenerative miljø produceret af den skade, der omgiver disse axoner. Denne sekundære degeneration påvirker neuroner i en progressiv måde relateret til sværhedsgraden af den skade. Hidtil har fortsat de underliggende RGC skader i glaukom mekanismer uklart, især dem, der vedrører sekundære skade, hvilket resulterer i utilstrækkelige kliniske behandling. 8 , 9 , 10 derfor, det er nødvendigt at undersøge de underliggende mekanismer af sekundære degeneration af RGCs under udviklingen af glaukom. 11 indførelsen af dyremodeller for sekundære skade, der kan kvantitativt vurdere størrelse, distribution og mekanisme af sekundære degeneration af RGCs tiltrækker stadig større opmærksomhed fra forskere studerer sekundære skade af RGCs.
For at afklare dette spørgsmål, blev en rotte PONT model etableret af Levkovitch-Verbin et al. 12 at evaluere cytoskeletale skade induceret degeneration og død af RGCs. Denne model menes at udgøre et godt redskab til at udforske mekanismerne af sekundære degeneration og at identificere de potentielle neuroprotektive Agenter. Det instrument, der bruges til at generere denne model af sekundære skade er en diamant kniv med en skala til Transekttællinger kvantitativt ved at indstille dybden af abscission gennem dial-knappen for at fuldføre en kvantitativ transection i synsnerven. Stien kirurgisk tilgange fra øjeæblet opadgående eller tidsmæssige conjunctiva. Under den udløsende proces, kan nethinden og synsnerven blive påvirket af kraften af pincet, hvilket igen kan medføre primær skade. Endnu vigtigere, på grund af den begrænsede plads i udsatte synsnerven er det vanskeligt at adskille de meningeal kappe før indsnit. Det er derfor muligt at skade de oftalmologiske fartøjer under delvis synsnerven transection, hvilket resulterer i retinal iskæmi og svigt af modellen. Derudover diamantkniven er dyre, og hver brug nedsætter tip skarphed. Dette kan til gengæld påvirke dybde og effekten af modellering.
Model af sekundære degeneration af RGCs beskrevet i denne undersøgelse blev opnået gennem en ny operative fremgangsmåde fra den laterale orbital væggen af øjeæblet. Denne nye operative fremgangsmåde åbner direkte retrobulbær synsnerven omkranset af orbital muskel kegle, undgå primære skade at øjeæblet og synsnerven, når du trækker nedad eller mod den nasale laterale side af øjeæblet. Dette øger plads af kirurgisk operation under model etablering og muliggør meningeal kappe isolation før delvist transecting synsnerven. Det er vigtigt at bemærke, at utilsigtet inddragelse og skade af oftalmologiske fartøjer kan føre til svigt af modellen. Desuden, modellen giver mulighed for en opfølgende vurdering af de transfekteret celler, lægemidler og reagenser på stump af delvist transected synsnerven. Den selvstændige designet kirurgisk instrument er billige og kan blive brugt flere gange, hvilket reducerer omkostningerne ved modellering. Den sekundære skade model af RGCs etableret ved denne metode var vist sig at have god reproducerbarhed og stabilitet.
Protocol
procedurer, der involverer dyr emner blev godkendt af det institutionelle dyr pleje og bruge udvalg (IACUC) af Capital medicinske universitet. Alle kirurgiske instrumenter og løsninger blev steriliseret før operation for at begrænse mikrobiel infektion.
Bemærk: kirurgisk protokollen omfattede fem dele, nemlig anæstesi, kirurgisk tilgang, synsnerven evaluering, lukning og genoprettelse. For at hjælpe med delvis kvantitative transection af synsnerven, blev en ny, billig kirurgisk instrument designet. Alle procedurer blev gennemført efter etiske regler og den kirurgiske teknik.
1. kirurgisk teknik
- udfører eksperimenter ved hjælp af aseptisk teknik, protokoller for brug af dyr skal være institution specifikke.
- Sterilize instrumenter og materialer (løsninger, teststoffer, sporstoffer, nåle, osv.) kommer i berøring med levende væv for at forhindre infektion og skadelige virkninger på dyrs velfærd samt potentielle negative virkninger på undersøgelsen .
2. Anæstesi
- Anesthetize SD rotter ved hjælp af en veterinær isofluran vaporizer system. Bruge medicinsk grade ilt med en hastighed på 1 L/min til at fordampe isofluran gas. Placere dyret i boksen vedhæftet anæstesi og køre isofluran ved en koncentration på 4,5% indtil langsom vejrtrækning og animalske sedation.
- Skifte gasstrømmen til gasmaske vedhæftet fil og anbringe dyret på driften tabellen. Sænke isofluran koncentration til 2% og overvåge anæstesi. Større dyr (> 300 g) kan kræve en højere koncentration af isofluran. Overvåge bedøvelse under operationen, med isofluran dosis justeres i overensstemmelse hermed. Hele tiden vurdere dybde og sats på vejrtrækning, og udføre tå knivspids evaluering hvert 5 min, for at sikre fravær af dyb smerte.
- Når operationen er afsluttet, slukke for isofluran og tillader dyret at ånde ilt i flere minutter, inden det fjernes fra tabellen. Opretholde kropstemperaturen dækker dyret med en kirurgisk tæppe og/eller ved hjælp af en reguleret varme tæppe under kirurgi.
3. Selv designet kirurgisk assistent Instrument (SSAI)
- Brug en SSAI fremstillet af rustfrit stål, og hovedsagelig består af en håndholdt pole (længde, 100 mm, diameter, 9 mm) og en rillet hoved ( figur 1). Den rillede overflade af rillede hovedet er semi-cirkulært, med lodret dybde, bredde og længde af 200 µm, 500 µm og 1.000 µm, henholdsvis. Mellem de to dele er der en fælles afdeling med en længde på 50 mm. Den rillede hoved ' s kant er 300 µm bred.
Bemærk: Den rillede overflade giver mulighed for en stabilisering af den ventrale synsnerven for transection. Den dorsale synsnerven er udsat for ydre af rillen, når den ventrale side af synsnerven lægger i det; i mellemtiden, den dorsale synsnerven udsat for den rillede kant kan transected når lodret cutting udføres. Den ventrale synsnerven lagt i den rillede overflade er beskyttet af den rillede hoved ' s kant. - Opnå primære skade i RGCs svarende til kvantitativt transected optiske nerve axoner (dorsale side), mens sekundært skade ville være udført i RGCs svarende til untransected optiske nerve axoner (ventrale side) uden direkte skader.
4. Kirurgisk tilgang
- sted i højre side af rotte opad i tabellen kirurgisk med hovedet over for kirurgen. Juster den højre bane i midten af den kirurgiske synsfelt. Derefter, rense området indsnit flere gange langs den laterale øjenkrog til eksterne akustiske foramen af lige orbital huden, anvende 0,5% klorhexidin i 75% ethanol. Fjern skind mellem den laterale øjenkrog til eksterne akustiske foramen ved hjælp af iris saks.
- Gøre en hud indsnit ved hjælp af iris saks langs den laterale øjenkrog til eksterne akustiske foramen med en længde på 0,5 til 1 cm. Derefter, knivspids fascia og trække opad til at oprette en trekantet kile med 0,12 mm tandede pincet. Indsæt de lavere blade markriyor foråret saks i området indsnit og skåret åben fascia i den samme retning, shear.
- Cut fascia med markriyor foråret saks og udsætte den orbital vene. Brug skarpt savtakkede pincet klemme sider af orbital venen og stumpe åbne begge sider af indsnittet. Placere den orbital vene i retningen kirurgisk orbital muskel overflade, som er placeret til lette opfølgende handling og at undgå kirurgi relateret blødning af orbital venen.
- Bruge iris saks til at skære højre laterale øjenkrog apart langs linjen indsnit til fuldt udsætte synsfelt for stump dissektion af orbital muskler under følge op.
- Fortsæt for at klemme mappen subfascial orbital musklen, og stumpe adskille lodret i retning af hud og fascie indsnit. Separat langs siderne gradvis at nå frem til orbital dybde, indtil fremkomsten af de orbitale fedtvæv.
- Efter eksponering af de orbitale fedtvæv, ændre den rotte hoved retning fra vender kirurg lodret til højre side af kirurgen. I mellemtiden holde området konstant fugtig bruger kirurgisk eller bomuld svaberprøver indeholdende steril PBS. Denne procedure sikrer en klar vision af det kirurgiske område, samtidig med at væv, fugtig og blød.
5. Adgang til synsnerven
- afskåret orbitale fedtvæv dækker orbital muskel kegle omkring synsnerven i orbital hulrummet. Dette sikrer en bedre eksponering af den hensigtsmæssige kirurgiske metode. Holde resektion af fedtvæv begrænset for at undgå vedvarende blødning.
- Skære fedtvæv, udsætter den laterale rectus. Klemme den laterale rectus udad, og derefter klippe det med markriyor foråret saks. Hvis det fedtvæv forbliver under den laterale rectus, trække op fedt overliggende synsnerven med 0,12 mm tandede pincet og skære det med markriyor foråret saks.
Bemærk: På dette tidspunkt, bør væv kappe omkring den optiske nerve være en synlig. - Fortsæt at adskille væv kappe langs retning af synsnerven i orbital dybde, indtil samlede eksponering af synsnerven. Holde området rent ved hjælp af kirurgiske svaberprøver at rydde små mængder af blod, der opstår fra væv fjernelse.
Bemærk: Nu, synsnerven skal være synlige. - For at få adgang til det, fjerne de meningeal kappe, der omgiver nerven uden at beskadige den oftalmologiske arterie. Forsigtigt rotere kappe for at undersøge den vaskulære mønster af dura på høj forstørrelse under en drift mikroskop.
- Identificerer et område blodkar, og udføre en langsgående snit på dura. 13 rip kappe parallelt med retningen af synsnerven med 26G kanyle tip eller knifepoint af safir kirurgisk sonde omhyggeligt, at undgå skader på kar med lateral nedskæringer.
Bemærk: Den eneste levn, der dækker nerven bør være den arachnoid membrane, som er meget tynde og gennemsigtige.
- Identificerer et område blodkar, og udføre en langsgående snit på dura. 13 rip kappe parallelt med retningen af synsnerven med 26G kanyle tip eller knifepoint af safir kirurgisk sonde omhyggeligt, at undgå skader på kar med lateral nedskæringer.
- Svarende til trin 5.2, rip den araknoid membran forsigtigt med en 26G kanyle tip eller knifepoint af safir kirurgisk sonde, parallelt med retningen af synsnerven. 13
- lå synsnerven inden for instrumentet groove blidt og forsigtigt, hvilket resulterer i den dorsale synsnerven er lidt højere end den rillede hoved kant. På dette tidspunkt, Transekttællinger dorsale synsnerven over kanten af den rillede hoved platform med 26G kanyle spids eller knifepoint af safir kirurgisk sonde til at fuldføre delvis synsnerven transection.
6. Lukning og Recovery
- flytte instrument lidt dybere over lodret retning af synsnerven til gratis sidstnævnte. Fjern derefter den rillede hoved af instrumentet forsigtigt. Prøv ikke at ridse de okulære muskler eller andre væv til at undgå ekstra skade. Stump af delvis synsnerven transection kan observeres.
- Erstatte den laterale rectus, fascia og andre omkringliggende væv af øjet til deres oprindelige positioner. Derefter, sutur muskel og hudlag af kredsløb i rækkefølge. Hvis blødningen fortsætter, forsigtigt fylde med en medicinsk vat før du lukker såret, og opretholde denne i en periode. Gælder antibiotisk salve for sår til at forhindre infektion.
- Turn off isofluran kilde og give dyret til at ånde ilt i flere minutter. Ved at rotte genoplivning, forberede Termisk isolering med en opvarmet mat eller dække buret overfladen med tørre polstring. Dække dyr med tæpper, at sikre rat luftvejene passage under gendannelsesprocessen.
- Hus dyr individuelt efter operationen. Administrere post-operative analgetika efter retningslinjer fastsat af institutionelle dyrs pleje myndigheder. Nøje overvåge dyr efter kirurgi.
Representative Results
For at kontrollere succes med hensyn til etableringen af en sekundær skade model med den nye operative fremgangsmåde ved hjælp af SSAI (figur 2A), var RGCs retrogradely mærket umiddelbart efter model etablering. Formålet med denne procedure var at etiket RGCs retrogradely ved at indsprøjte en neurale tracer farvestof (3% fluorophore (f.eks.Fluorogold) i sterilt fosfat buffer saltvand) ind i den overlegne colliculus (figur 2B). Denne tilgang giver reproducerbare mærkning af levedygtige RGCs med lidt variation. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 farvestoffet vil tages retrogradely op af RGCs i nethinden og udgør en markør for levende RGCs, med axoner ikke transected i det højre øje. I mellemtiden, RGCs svarer til den delvist transected optiske nerve axoner i det højre øje ikke kunne mærkes med sporstof farvestof (figur 2 c). Som en kontrol øjet, det venstre øje uden operation, RGCs langs synsnerven af nethinden var alle mærket med fluorescerende guld farvestoffet på en retrograd måde fra den overlegne colliculus (figur 2D).
Syv dage efter delvis synsnerven transection og retrograd mærkning af RGCs, blev nethinder høstet, fast, fladtrykt og monteret. De hedder RGCs var afbildet under en fluorescerende mikroskop i afgrænsede områder af nethinden. Resultaterne af fluorescens-mærket RGCs med eller uden delvis synsnerven transection er vist i figur 3. Kun RGCs i den rigtige nethinden svarende til den untransected del af den optiske nerve var mærket med fluorescerende guld, og en klar grænse af umærket og mærket RGCs kunne være visualiseret (fig. 3A, figur 3B), demonstrere den delvise transaktions i synsnerven. Som en kontrol øjet, alle RGCs af venstre øje nethinde viste fluorescens (figur 3 c, figur 3D).
For at vurdere hvorvidt Vaskulaturen omkring synsnerven hoved og den oftalmologiske arterie, der leverer blod til entoretina blev såret og berørt under operationen, højre øje fundus var afbildet før og efter operation. Billederne viste blodforsyningen til højre øje (udløsende øje) før og 1 time efter operationen. Blod i arterierne var passende. Ingen obstruktion af venen blev observeret. Disse resultater viste, at der var ingen skader på blod levering system under operationen (figur 4A, figur 4B). Derfor, den sekundære degeneration model af RGCs blev oprettet.
Figur 1 : Fotografier af selvstændige designet kirurgisk assistent instrument, SSAI. (A) en panoramisk udsigt over den kirurgisk instrument med to hoveddele, herunder en håndholdt pole og en rillet hoved. Mellem dem er der en fælles afdeling med en længde på 50 mm. Længden af den håndholdte pole er 100 mm, og diameteren af den håndholdte pole er 9 mm. (B) en funktion af SSAI groove. Den rillede overflade af rillede hovedet er semi-cirkulære, som gør det muligt for den optiske nerve til at lægge i det, at være stabiliseret for transection. Den rillede overflade er med en lodret dybde af 200 µm og en bredde på 500 µm og en længde på 1.000 µm. Bredden på kanten af den rillede hoved er 300 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skematisk diagram over RGC mærkning på nethinden efter delvis transection af den rette synsnerven med egen designet kirurgisk assistent instrument (SSAI) og retrogradely benævner den overlegne colliculus med fluorophore. (A) den kirurgiske opfattelse af delvis rigtige synsnerven transection i rotter med egen designet kirurgisk assistent instrument (SSAI). (B) efter modellering, RGCs var mærket retrogradely ved at indsprøjte en neurale tracer farvestof (gul farve, 3% fluorophore i sterilt fosfat buffer saltvand) ind i den overordnede colliculus i hjernen. Da axoner af RGCs bor i den overlegne colliculus, tracer farvestof er taget op af RGCs retrogradely og udgør en markør for levende celler. Tværsnit i figur repræsenterer et udsnit af synsnerven. OD, opererede øje; OS, kontrol øjet uden operation. I (C), var kun RGCs svarende til den untransected del af synsnerven mærket med fluorophore. Blå repræsenterer unseparated ventrale synsnerven og de tilsvarende RGCs på nethinden; rød afspejler delvis transected dorsale synsnerven og de tilsvarende RGCs på nethinden. (D) retinal RGCs af venstre øje (kontrol øjet) uden den kirurgiske procedure var alle mærket af farvestoffet. Dorsal og ventral synsnerverne var alle mærket af farvestoffet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Hele nethinden epifluorescensmikroskop micrographs af fluorophore mærket RGCs 7 dage efter oprettelse af delvis synsnerven transection model og retrograd mærkning af den overlegne colliculus. De tilsvarende skematiske diagrammer af Fluorogold farvede RGC områder på nethinden er også præsenteret. (A) og (C) repræsenterer de skematiske diagrammer over RGCs i nethinden af retten (operative) og venstre (kontrol) øjne efter mærkning med fluorophore, henholdsvis. Gul angiver det område, der er mærket med en fluorescerende guld farvestof. Nethinden er opdelt i dorsal og ventral centrale dele. (B) og (D) repræsenterer hele retinal epifluorescensmikroskop micrographs opnået under et fluorescens mikroskop; gul repræsenterer området af RGCs mærket med fluorophore. I den kirurgiske øjet (højre øje), som vist i B, repræsenterer umærkede regionen området i RGCs svarende til synsnerven, som er delvist transected, hovedsageligt på den dorsale side af nethinden. Regionen mærket af fluorescerende guld farvestoffet er området i RGCs svarende til synsnerven, som ikke er transected og hovedsagelig koncentreret i de centrale og ventrale sider af nethinden. BounDary mellem områder af umærket og mærket RGCs er klar. Primære degeneration af RGC organer ville være begrænset til den dorsale nethinden, og alle tab af RGC organer i de centrale og ventrale nethinder kunne tilskrives sekundær degeneration. (D) hele retinal photomicrograph af venstre øje efter mærkning af RGCs med fluorophore. RGCs af venstre kontrol øjet uden kirurgisk indgreb var helt plettet af fluorophore. Skalere barer = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Præoperativ og postoperativ billeder af fundus i det højre øje fremstillet af Fundus kamera. Billede af fundus før højre øjenkirurgi i rotter, som viser god blodforsyning af fundus, arteriel fyldet, og ingen venøs tilbagevenden eller obstruktion, der (A) angiver en god retinal blod levering system. (B) billede af fundus i det højre øje 1 time efter operationen. Sammenlignet med det præoperative billede af fundus, blev ingen væsentlige ændringer observeret i retinal blodforsyning, der angiver, at blod levering system af øjeæblet ikke blev berørt under processen med modellering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Fotografier af retrobulbær synsnerven og den oftalmologiske arterie beliggende på meningeal kappe, fanget gennem den kirurgiske tilgang. Efter helt at fjerne den målrettede længde af synsnerven, blev den oftalmologiske arterie (pilespids) samtidig med de meningeal kappe af synsnerven udsat, og parallel med den optiske nerve. Skalere barer = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Skematisk diagram over primære og sekundære degeneration placeringer i synsnerven. Delvis indsnit i synsnerven blev opnået ved hjælp af selvstændige designet kirurgisk assistent instrument (pilespids). Axoner i direkte beskadigede lokaliteter (dorsale skæring site af synsnerven i tværsnit i grå) gennemgå primære degeneration, mens de indirekte beskadigede steder (central og ventrale områder af synsnerven i tværsnit i gult) gennemgå sekundære degeneration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Operative Procedure
Der er nogle punkter værdig af meddelelse ved at model konstruktion. I trin 4.2, skal kirurgisk flytning udføres omhyggeligt for at undgå at beskadige Vaskulaturen ovenfor subfascial muskel. Især, når du skærer den subkutane fascia i den ydre laterale øjenkrog, bør skarpt savtakkede pincet anvendes til at trække opad den subkutane fascia på fascia overflade vertikalt; fascia skal skæres med markriyor foråret saks for at undgå at beskadige den orbital vene på den ydre øjenkrog, hvilket kan resultere i model svigt af overdreven blødning. Trin 4.3 har fordel af potentielt at forhindre blødning ved direkte fjernelse fra blodkar. Adskillelse af orbital muskler i trin 4.5, årsagen til plukning skarpt savtakkede pincet men ikke markriyor er foråret saks at undgå kontinuerlig blødning og blødning. Musklerne er ligefremt adskilt på begge sider i retningen vinkelret i forhold til huden fascia indsnit; i mellemtiden, er de dybe muskler i kredsløb strækkes udad og perifert. Denne procedure vil afsløre dybere dele af orbital hulrummet, giver et større kirurgisk vindue og giver uhindret adgang til væv overliggende synsnerven. I de ovennævnte procedurer, hvis der opstår blødning, pres bør anvendes ved hjælp af steril kirurgiske eller bomuld svaberprøver. Mindre blødning vil stoppe efter flere sekunder af denne procedure. Formålet med trin 4.6 er at lette opfølgende operationer for at nemt at fjerne nogle fedt og separat musklerne i kredsløb muskel kegle afsløre synsnerven langs retning af synsnerven i orbital dybden.
De mest kritiske dele af den nuværende protokol er trin 5.1-5.6. Det er vigtigt ikke at beskadige Vaskulaturen omkring synsnerven hoved. Synsnerven skal være delvist transected mindst 1,5-2,0 mm fra bagsiden af øjet, at undgå skader til den oftalmologiske arterie, som trænger nerven inden for 1 mm i øjet og leverer blod til den indre nethinde. Formålet med skære den laterale rectus er at opnå bedre eksponering af synsnerven, som den laterale rectus er bred og naturligvis blokerer for visningen af den optiske nerve. I mellemtiden, for at undgå, at fjerne den oftalmologiske arterie, der er knyttet til de meningeal kappe (figur 5), er det nødvendigt at adskille og adskille dura omkring synsnerven og undersøge den vaskulære mønster af meningeal kappe, Brug af pincet til at forsigtigt rotere kappe. Desuden bør et område blodkar identificeres, giver et langsgående snit i de meningeal kappe. Det er også nødvendigt at opretholde en lille arbejde afstand fra bagsiden af øjet, at undgå del af dura, der er tæt forbundet med den oftalmologiske arterie. Nethinden er normalt gennemsigtig, og blodkar kan være klart afgrænset. I tilfælde af beskadigede retinal blodforsyning, er nethinden degenereret, fører til en mælkehvide flocculent udseende. Den glasagtige kammer i øjet og linsen vil typisk blive overskyet og med nedsat øje størrelse over tid. I denne undersøgelse bekræftet præoperativ og postoperativ billeder af fundus nogen skade til fundus blodforsyning i modellen efter anvender ovenstående trin.
Derudover kræves særlig pleje i flere trin af denne model. Når du bruger skarpe-buet-savtakkede pincet eller andre kirurgiske instrumenter til at eksponere synsnerven, skal kirurgen undgå overdreven kraft, da det kan beskadige synsnerven, øjeæblet eller oftalmologiske arterie, resulterer i primær skade og retinal iskæmi. Derudover bør blodkar omkring øjet ikke være beskadiget, for at undgå vedvarende blødning, som kan føre til svigt af modellering. SSAI anvendes i dette eksperiment kræver delikat skik. Når optiske nerve er placeret inden for instrumentet groove, skal synsnerven og rillet overflade monteres stramt at sikre god konsistens og repeterbarhed af hvert dyr model. Med praksis, kan den fuld kirurgisk procedure være afsluttet inden for 15-20 minutter pr øje, efter startpost nedskæringer.
Wang et al. 19 offentliggjort en lignende dyremodel af delvis synsnerven transection etableret ved hjælp af en synsnerven kvantitative amputator. De kirurgiske procedurer omfatter: 1) skære apart den ydre øjenkrog, suspension og om fastsættelse af den palpebral superior; 2) at undersøge synsnerven, og transecting den overlegne del af synsnerven ved hjælp af amputator; og 3) suturering bindehinde og huden. Selv om den kirurgiske procedure var relativt simple, blev følgende problemer registreret under handlingen. Selvom laterale øjenkrog snit kunne udsætte visse plads for drift, var der en uundgåelig behov for konstant strække øjeæblet for at udsætte retrobulbær synsnerven kappe, især når kirurgerne ønskede at udsætte en længere retrobulbær synsnerven kappe at lette yderligere kappe isolation; kraft for at strække øjeæblet blev større, som er tilbøjelige til at forårsage direkte trækkraft skade af øjeæblet og synsnerven. Særlig opmærksomhed ingen til blodkar, som kan skæres med synsnerven kappe, og skader på blodkar forventes at føre til mislykkede model virksomhed. De vigtigste procedurer af sekundære skade model beskrevet i denne hvidbog er: en ny operative nærme sig fra den laterale orbital væggen af øjeæblet til direkte adgang retrobulbær synsnerven omgivet af orbital muskel kegle, undgå primære skade den øjeæblet og synsnerven, når du trækker nedad eller mod den nasale laterale side af øjeæblet. Denne nye operative fremgangsmåde øger plads af kirurgisk operation under modellering, og giver mulighed for nem isolering af meningeal kappe, som er tæt forbundet med den oftalmologiske arterie, før delvis transection i synsnerven. Delvis synsnerven transection blev udført med en selvstændig designet kirurgisk instrument, der er omkostningseffektive og kan genbruges, reducere de samlede omkostninger af modellering. Rottens orbital struktur er forskellige fra dem i andre pattedyr, med orbit tættest på øjenkrog og ingen knoglestrukturen, men dækket med muskler. Den kirurgiske tilgang kunne nå den bageste del af øjeæblet uden at ødelægge den orbital knoglerne og periosteum. Gennem strenge præoperativ desinfektion og postoperativ antibiotika profylakse, var infektion, inflammation og ødem stærkt reduceret.
Selv designet kirurgisk assistent Instrument
Rotte model af delvis synsnerven transection blev etableret, benytter den selvstændig designet kirurgisk assistent instrument, hvis vigtigste funktioner er som følger. Det kan hjælpe med delvis kvantitative transection i synsnerven udsat for den rillede kant, også at sikre transection konsistens mellem forskellige dyr. Vi testet og verificeret repeterbarhed etableringsret model med SSAI. Den maksimale variationskoefficient var 1,85%, med en gennemsnitlig værdi 0,67% ±0. 44%. 20 disse resultater viser, at SSAI kunne bruges til at oprette delvise synsnerven transection modeller, med tilfredsstillende reproducerbarhed og FNiformity.
Den rillede overflade bredde og design af halvcirkel i rillen indre overflade kan have en mere fast effekt på synsnerven og gøre den rillede overflade og synsnerven lægger mere stramt også faldende eksperimentelle fejl og bivirkninger. Den rillede kant giver mulighed for en bedre beskyttelse af den optiske nerve i rillen under operationen, som ikke vil skade synsnerven i rillen, uanset de cutter skarphed. En anden fordel ved den rillede kant er crush skadesforebyggelse i synsnerven transection.
Det er hensigtsmæssigt for driften i dybe og smalle rum. Selv om den nye operative fremgangsmåde er blevet udvidet, vejen er stadig dyb, og den håndholdte pol og fælles afsnit kan bruges til at placere den rillede hoved let under synsnerven kappe til at udføre opfølgende handlinger. Når apparatet benyttes til drift, kan en bred vifte af fræsere bruges til transection, f.eks. en 26 G kanyle tip. Selv en safir kirurgisk sonde kniv kan vælges til at undgå kontusion og knuse skader forårsaget af saks. Groove overflader kan laves i forskellige vertikale dybder at fuldføre varierende grader af synsnerven skæring.
Sammenlignet med amputator i Wang har et al. SSAI en enklere struktur. Derudover er skæring skridt mere praktisk, ved hjælp af SSAI, med forbedret sammenhæng og repeterbarhed af en dyremodel. Endelig, vifte af redskaber gældende for skæring med SSAI er også bredere. Afslutningsvis, kan SSAI, hvilket gør kvantitative og ensartet snit af nerve, tjene som et effektivt instrument til oprettelse af rotte-modeller til vurdering af synsnerven transection.
Karakteristik af rotte delvis synsnerven Transection Model
Delvis synsnerven transection model er nyttige til at vurdere sekundære degeneration i RGCs. Den potentielle fordel ved denne model er evnen til at adskille primære fra sekundære degeneration præcist i situ, både i synsnerven og nethinden. De centrale og ventrale synsnerverne var mere modtagelige for sekundære skade efter delvis transection (omkring 1/3 til 1/2) af de dorsale synsnerven (figur 6). I nethinden, bør regionale placeringen af primære og sekundære skader af RGCs baseres på topografi i synsnerven svarende til retinale RGCs efter delvis transection. Hvis rotten hele nethinden er opdelt i dorsal (superior) og ventrale (lavere) dele, er sekundære og primære skader til stede i begge dele. Imidlertid bør baseret på forholdet mellem RGCs på nethinden og synsnerven axon, RGC død i ventrale nethinden hovedsageligt tilskrives sekundær skade (figur 3). 12 , 22 , 23 fordelene ved denne model Medtag: enkel og nem at betjene instrument med standardprocedurer; ingen effekt på oftalmologiske fartøjer; god reproducerbarhed og stabilitet. Denne teknik kan bruges til at transfect RGCs fra denne plads-besparelse operative fremgangsmåde ved at anvende korte interfererende RNA'er (siRNAs), plasmider, og virale vektorer til delvis synsnerven stub; Derudover kunne reagenser placeres på den delvise synsnerven stump for den selektive behandling eller mærkning af RGCs.
Generelt, primære og sekundære skader af RGCs sameksisteret efter delvis synsnerven transection i denne dyremodel, med en klar grænse i nethinden mellem de to skade typer. Selvom sammenslutningen af optiske nerve axoner og RGC placering på nethinden har brug for yderligere undersøgelse for en mere præcis sondring, denne plads-besparelse udløsende tilgang udvider anvendelsen af modellen og gør det muligt for forskere at udforske den mekanismer for sekundære skade i RGCs på en ny måde.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer, at de har ikke nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (7152038), den grundlæggende forskningsmidler til Central universiteterne i Central South University (2016zzts162) og Science Research Foundation Aier Eye Hospital gruppen af (Grant nr. AF156D11). Endelig tak Fancheng Yan Yiping Xu for den uvurderlige støtte gennem årene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
| Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
| Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
| Fluorogold | Biotium | 80014 | |
| Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
| Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
| Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
| Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
| Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
| 26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
| 10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
| 5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
| Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
| Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
| Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
| RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
| Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |
References
- Stoica, B. A., Faden, A. I. Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 7 (1), 3-12 (2010).
- Hausmann, O. N. Post-traumatic inflammation following spinal cord injury. Spinal Cord. 41 (7), 369-378 (2003).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guimaraes, J. S., et al. Mechanisms of secondary degeneration in the central nervous system during acute neural disorders and white matter damage. Rev Neurol. 48 (6), 304-310 (2009).
- Stewart, S. S., Appel, S. H. Trophic factors in neurologic disease. Annu Rev Med. 39, 193-201 (1988).
- Brubaker, R. F. Delayed functional loss in glaucoma. LII Edward Jackson Memorial Lecture. Am J Ophthalmol. 121 (5), 473-483 (1996).
- Yoles, E., Schwartz, M. Degeneration of spared axons following partial white matter lesion: implications for optic nerve neuropathies. Exp Neurol. 153 (1), 1-7 (1998).
- Nickells, R. W. From ocular hypertension to ganglion cell death: a theoretical sequence of events leading to glaucoma. Can J Ophthalmol. 42 (2), 278-287 (2007).
- Doucette, L. P., Rasnitsyn, A., Seifi, M., Walter, M. A. The interactions of genes, age, and environment in glaucoma pathogenesis. Surv Ophthalmol. 60 (4), 310-326 (2015).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Rokicki, W., Dorecka, M., Romaniuk, W. Retinal ganglion cells death in glaucoma--mechanism and potential treatment. Part II. Klin Oczna. 109 (7-9), 353-355 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. A model to study differences between primary and secondary degeneration of retinal ganglion cells in rats by partial optic nerve transection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (8), 3388-3393 (2003).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system. J Vis Exp. (51), (2011).
- Yoles, E., et al. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (13), 3586-3591 (1992).
- Fisher, J., et al. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21 (1), 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
- Li, Y., et al. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. J Clin Invest. 118 (3), 913-923 (2008).
- Tang, Z., et al. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. J Exp Med. 207 (4), 867-880 (2010).
- Wang, X., Li, Y., He, Y., Liang, H. S., Liu, E. Z. A novel animal model of partial optic nerve transection established using an optic nerve quantitative amputator. PLoS One. 7 (9), e44360 (2012).
- Yan, F. C., Li, S. N., Liu, K. G., Lu, Q. J., Wang, N. L. The establishment of a rat partial optic nerve transection model and assessment of its reproducibility. Ophthalmology in China. 22 (1), 34-37 (2013).
- Fitzgerald, M., et al. Secondary degeneration of the optic nerve following partial transection: the benefits of lomerizine. Exp Neurol. 216 (1), 219-230 (2009).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. J Neurotrauma. 27 (11), 2107-2119 (2010).
- Li, H., et al. Lycium barbarum (wolfberry) reduces secondary degeneration and oxidative stress, and inhibits JNK pathway in retina after partial optic nerve transection. PLoS One. 8 (7), 68881 (2013).
