Summary
Sekundær degenerasjon av netthinnen ganglieceller (RGCs) oppstår vanligvis i glaukom. Denne studien beskriver en innovativ operative tilnærming for delvis synsnerven transection. Bruk av denne plassbesparende operative utvider modellens program utvalg, og gjør utforskning av sekundær skade mekanismer i RGCs på en ny måte.
Abstract
Tidligere studier har vist at sekundære degenerering av netthinnen ganglieceller (RGCs) oppstår vanligvis i glaukom. Delvis synsnerven transection regnes som en nyttig og reproduserbar modell. Sammenlignet med andre synsnerven skade modeller brukes ofte for å vurdere sekundære degenerasjon, f.eks komplett synsnerven transection og synsnerven knuse modeller, er delvis synsnerven transection modellen bedre som den skiller primære fra sekundær degenerasjon i situ. Derfor, det fungerer som et utmerket verktøy for å vurdere sekundære degenerasjon. Denne studien beskriver en ny operative tilnærming av delvis synsnerven transection av direkte tilgang til området av synsnerven retrobulbar gjennom orbital laterale veggen av øyeeplet. Dessuten, presenterer vi en nydesignede, lavpris kirurgisk instrument hjelpe med transection. Som vist av representant resultatene i atskillende grensen av primære og sekundære områder, sikrer ny tilnærming og instrument høy effektivitet og stabilitet av modellen tilbyr tilstrekkelig plass for kirurgisk operasjon. Dette gjør i sin tur det enkelt å skille meningeal skjede og ophthalmica fartøy fra synsnerven før transection. En ekstra fordel er at denne plassbesparende operative forbedrer den etterforskere muligheten til å administrere narkotika, operatører eller Selektiv RGC tracers i stampe av delvis transected synsnerven, slik at utforskningen av mekanismene bak sekundær skade i RGCs, på en ny måte.
Introduction
Sekundær degenerasjon skjer vanligvis i sentralnervesystemet (CNS) etter traumatisk skader, og følgende akutte og kroniske nevrodegenerative sykdommer. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 død neurons og gliacellene som en tidlig konsekvens av primære patologisk hendelser som kalles primære degenerasjon, mens sekundære degenerasjon refererer til døden av neurons og gliacellene, som eller bare delvis ikke påvirkes av primær skade. Sekundær degenerasjon av RGCs er også antatt å skje i glaukom. 6 Yoles et al. 7 bekreftet at sekundære skade på RGCs oppstår i synsnerven skade modellen. De viste at nerveceller som axons ikke ble skadet etter en akutt skade vil til slutt degenerert på grunn av degenerative miljø produsert av skaden rundt disse axons. Denne sekundære degenerasjon påvirker nervecellene i en progressiv måte knyttet til alvorlighetsgraden av skader påført. Så langt, forblir mekanismene bak RGC skade i glaukom uklart, spesielt de relatert til sekundære skader som resulterer i utilstrekkelig klinisk behandling. 8 , 9 , 10 derfor er det nødvendig å utforske de underliggende mekanismene sekundære degenerasjon av RGCs under utviklingen av glaukom. 11 etableringen av dyr modeller av sekundær skade som kan kvantitativt vurdere størrelsen, distribusjon og mekanismen for sekundær degenerasjon av RGCs tiltrekker økende oppmerksomhet fra forskere som studerer sekundære skader på RGCs.
For å avklare dette problemet ble en rotte PONT modell etablert av Levkovitch-Verbin et al. 12 for å evaluere axonal skade indusert degenerasjon og død RGCs. Denne modellen er antatt å utgjøre et godt verktøy for å utforske mekanismer for sekundær degenerasjon og identifisere potensielle neuroprotective agenter. Apparatet brukes til å generere denne modellen av sekundær skade er en diamant kniv med en skala til mudderbunn kvantitativt ved å angi dybden av abscission gjennom ekstern knotten, for å fullføre en kvantitativ transection av synsnerven. Kirurgisk banen tilnærminger fra øyeeplet oppover eller temporal Konjunktiva. Under operative prosessen, kan netthinnen og optiske nervene bli påvirket av tang, som igjen kan føre til primære personskade. Enda viktigere, fordi det begrensede området i viste synsnerven er det vanskelig å skille meningeal skjede før snitt. Derfor er det mulig å skade ophthalmica fartøyene under delvis synsnerven transection, som resulterer i netthinnen iskemi og svikt i modellen. I tillegg diamantkniven er kostbart, og bruk synker tips skarpheten. Dette kan igjen påvirke dybden og virkningen av modellering.
Modell av sekundær degenerasjon av RGCs beskrevet i denne studien var oppnådd gjennom en ny operative tilnærming fra den laterale orbital veggen av øyeeplet. Denne romanen operative tilnærmingen åpner direkte retrobulbar synsnerven omkranset av orbital muskel kjeglen, unngå primære skader øyeeplet og synsnerven når nedover eller mot nasal lateral øyeeplet. Dette også øker for kirurgisk operasjon under opprettelse av modellen, og aktiverer meningeal skjede isolasjon før delvis transecting synsnerven. Det er viktig å merke at utilsiktet engasjement og skade på ophthalmica fartøy kan føre til svikt i modellen. Videre muliggjør modellen en oppfølging vurdering av transfekterte celler, narkotika og reagenser på Stabben i delvis transected synsnerven. De egenutviklede kirurgisk instrumentet er billig og kan brukes flere ganger, og dermed redusere kostnadene for modellering. Sekundær skade modellen av RGCs etablert av denne metoden ble vist å ha god reproduserbarhet og stabilitet.
Protocol
prosedyrer som involverer dyr fag ble godkjent av de institusjonelle dyr omsorg og bruke committee (IACUC) av hovedstaden Medical University. Alle kirurgiske instrumenter og løsninger ble sterilisert før kirurgi for å begrense mikrobielle infeksjoner.
Merk: kirurgisk protokollen inkludert fem deler, nemlig anestesi, kirurgisk tilnærming, synsnerven evaluering, avslutning og gjenoppretting. Hjelp med delvis kvantitative transection av synsnerven, var en ny, lavpris kirurgisk instrument designet. Alle prosedyrer ble utført etter etiske regler og kirurgiske teknikken.
1. kirurgisk teknikk
- utføre eksperimenter ved hjelp av steril teknikk, protokoller for dyr bruk skal institusjon bestemte.
- Sterilize instrumenter og materialer (løsninger, test stoffer, tracers, nåler, etc.) kommer i kontakt med levende vev for å hindre infeksjon og skadevirkninger på dyrevelferd og potensielle negative virkninger på studien .
2. Anestesi
- Anesthetize SD rotter ved hjelp av en veterinær isoflurane vaporizer system. Bruk medisinsk karakter oksygen med en hastighet på 1 L/min til å fordampe isoflurane gassen. Plassere dyret i boksen vedlagte anestesi og kjøre isoflurane i en konsentrasjon av 4,5% til langsom pust og dyr sedasjon.
- Bytte gasstrømmen til gass maske vedlegget og plassere dyret på operasjonsbordet. Lavere isoflurane konsentrasjonen til 2% og overvåke anestesi. Større dyr (> 300 g) kan kreve en høyere konsentrasjon av isoflurane. Overvåke anestesi under kirurgi, med isoflurane dose justert tilsvarende. Stadig evaluere dybde og rate av pusting og utføre tå knipe evaluering hver 5 min, for å sikre fravær av dyp smerte.
- Når operasjonen er fullført, deaktiverer isoflurane og la dyret pusten oksygen i flere minutter før fjerning fra tabellen operasjon. Opprettholde kroppstemperatur dekker dyret med en kirurgisk teppe og/eller bruker et regulert oppvarming teppe under operasjonen.
3. Egenutviklede kirurgisk hjelperen Instrument (SSAI)
- Bruk en SSAI laget av rustfritt stål og hovedsakelig består av en håndholdt stang (lengde, 100 mm, diameter 9 mm) og en riflet hodet ( figur 1). Riflet overflate riflet hodet er semi-sirkulære, med vertikal dybde, bredde og lengde på 200 μm, 500 µm og 1000 µm, henholdsvis. Mellom to deler er det en felles del med en lengde på 50 mm. Riflet hodet ' s kanten er 300 µm bredt.
Merk: Overflaten aktiveres stabilisering av ventrale synsnerven for transection. Dorsal synsnerven er eksponert på utsiden av sporet når ventrale siden av synsnerven ligger i. i mellomtiden kan dorsal synsnerven utsatt til riflet kant være transected når loddrett kutte utføres. Ventrale synsnerven lagt innen overflaten er beskyttet av riflet hodet ' s kanten. - Oppnå primære skade i RGCs tilsvarer kvantitativt transected synsnerven axons (dorsal side), mens sekundære skader ville bli utført i RGCs tilsvarer untransected synsnerven axons (ventral side) uten direkte skade.
4. Kirurgisk tilnærming
- plass på høyre side av rotte oppover på hodet vendt kirurgen kirurgisk bordet. Juster riktig bane i midten av kirurgiske synsfelt. Deretter rense såret området flere ganger langs den laterale canthus til den eksterne akustisk foramen av høyre orbital huden, påføre 0,5% chlorhexidine i 75% etanol. Fjerne pelsen mellom den laterale canthus til den eksterne akustisk foramen med iris saks.
- Gjør en huden snitt iris saks langs den laterale canthus til den eksterne akustisk foramen med en lengde på 0,5 til 1 cm. Deretter knip fascia og trekk oppover for å opprette en trekantet kile med 0,12 mm toothed tang. Sette inn lavere bladet Vannas våren saks i snitt området og klippes fascia i samme skjær retning.
- Cut fascia med Vannas våren saks og utsette orbital venen. Bruk skarpe taggete tang klemme sidene av orbital venen og sløv åpne begge sider av innsnitt. Plasser orbital venen kirurgisk mot orbital muskel overflaten, som er plassert for å lette oppfølging operasjonen og unngå kirurgi knyttet blødning av orbital venen.
- Bruke iris saks å kutte rett lateral canthus hverandre langs snitt å fullt avsløre sikten for sløv Disseksjon av orbital musklene i følge opp.
- Fortsett å klemme mappen subfascial orbital muskelen og sløv skille loddrett i retning av huden og konseptet snitt. Separat langs sidene gradvis å nå orbital dybden, til utseendet på orbital fettvev.
- Etter eksponering av orbital fettvev, endre rotte hodet retningen overfor kirurgen vertikalt til høyre side av kirurgen. I mellomtiden holde området stadig fuktig bruker kirurgisk eller bomull vattpinner inneholder sterilt PBS. Denne fremgangsmåten sikrer en klar visjon av kirurgiske feltet samtidig vev fuktig og myke.
5. Tilgang til synsnerven
- kuttet orbital liggende under adipose vev som dekker orbital muskel membran rundt den optiske nerven i orbital hulrom. Dette sikrer en bedre eksponering av aktuelle kirurgisk tilnærming. Holde fjerning av fettvev begrenset for å unngå vedvarende blødning.
- Kuttet fettvev, utsette den laterale rectus. Klemme den laterale rectus utover, og deretter skjære den med Vannas våren saks. Hvis fettvev forblir under den laterale rectus, trekker opp fett overliggende synsnerven bruke 0,12 mm toothed tang og kutt den med Vannas våren saks.
Merk: På dette tidspunktet, vev skjede rundt den optiske nerven skal være synlig. - Fortsett å skille vev skjede retning synsnerven i orbital dybden, til total eksponering av synsnerven. Holde området rent ved hjelp av kirurgiske vattpinner til ren små mengder blod som oppstår fra vev fjerning.
Merk: Nå synsnerven skal være synlig. - For å få tilgang til den, fjerne meningeal skjede som omgir nerve uten å skade ophthalmica arterien. Forsiktig rotere skjede for å undersøke vaskulær mønster av dura på forstørring under en drift mikroskop.
- Identifisere et område uten blodkar og utføre en langsgående kutt på dura. 13 rip skjede parallell retning av synsnerven med 26G pinne-spissen eller kniv av safir kirurgisk probe nøye unngå skader på blodkar med lateral kutt.
Merk: Den eneste leftover dekker nerve bør være araknoide membrane, som er svært tynn og gjennomsiktig.
- Identifisere et område uten blodkar og utføre en langsgående kutt på dura. 13 rip skjede parallell retning av synsnerven med 26G pinne-spissen eller kniv av safir kirurgisk probe nøye unngå skader på blodkar med lateral kutt.
- Lik trinn 5.2, rippe araknoide membranen forsiktig med 26G pinne-spissen eller kniv av safir kirurgisk sonde, parallell retning av synsnerven. 13
- lå den optiske nerven i sporet for instrumentet sakte og forsiktig, resulterer i dorsal synsnerven blir litt høyere enn riflet hodet kanten. Foreløpig mudderbunn dorsal synsnerven over kanten av riflet hodet plattformen med en 26G pinne-spissen eller kniv av safir kirurgisk sonden å fullføre delvis synsnerven transection.
6. Lukking og
- bevege apparatet litt dypere mot vertikal retning av synsnerven gratis sistnevnte. Deretter Fjern riflet hodet av instrumentet forsiktig. Prøv ikke å klø okulær musklene eller andre vev for å unngå ekstra skade. The stump av delvis synsnerven transection kan observeres.
- Erstatter den laterale rectus, fascia og andre omkringliggende vev i øyet til opprinnelig plassering. Deretter Sutur muskler og hud lagene i bane i rekkefølge. Hvis blødning fortsetter forsiktig fylle med en medisinsk bomullsdott før du lukker såret, og opprettholde dette for en periode. Antibiotikaresistens sårsalve gjelder såret å hindre infeksjon.
- Slå av isoflurane kilden og la dyret pusten oksygen i flere minutter. Under rotte resuscitation, forberede termisk isolasjon med oppvarmet mat, eller dekker bur overflaten med tørr polstring. Dekke dyrene med tepper, å sikre rotta airway patency under gjenopprettingsprosessen.
- Huset dyr individuelt etter operasjonen. Administrere etter kirurgiske analgetika i henhold til retningslinjene gitt av dyr institusjon myndigheter. Nøye overvåke dyr etter kirurgi.
Representative Results
For å bekrefte suksess opprettelse av en sekundær skade modell med nye operative tilnærming ved hjelp av SSAI (figur 2A), var RGCs retrogradely benevnt umiddelbart etter modell etablering. Formålet med denne prosedyren var å etiketten RGCs retrogradely ved å injisere en neural tracer fargestoff (3% fluorophore (f.eksFluorogold) i sterilt fosfat buffer saltvann) inn overlegen colliculus (figur 2B). Denne tilnærmingen gir reproduserbar merking av levedyktig RGCs med lite variasjon. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 fargestoff vil bli retrogradely tatt av RGCs i netthinnen og utgjør en markør for live RGCs, med axons ikke transected i høyre øye. I mellomtiden RGCs tilsvarer delvis transected synsnerven axons i høyre øye ikke kan merkes med tracer fargestoff (figur 2C). Som en kontroll øye, venstre øye uten operasjon, RGCs langs den optiske nerven i netthinnen var alle merket med fluorescerende gull fargestoff i en retrograd måte fra overlegen colliculus (figur 2D).
Syv dager etter delvis synsnerven transection og retrograd merking av RGCs, var netthinnen høstes, fast, flat og montert. De merkede RGCs ble fotografert under fluorescerende mikroskop i definerte regioner i netthinnen. Resultatene av fluorescens-merket RGCs med eller uten delvis synsnerven transection vises i Figur 3. Bare RGCs i høyre netthinnen tilsvarende i den untransected delen av fiberoptisk nerve ble merket med fluorescerende gull, og en klar grensen umerkede og merket RGCs kunne bli visualisert (figur 3A, figur 3B), demonstrere delvis transaksjonen av synsnerven. Som en kontroll øye, alle RGCs av den venstre øyet Netthinne viste fluorescensen (Figur 3 c, finne 3D).
For å vurdere om blodkar rundt synsnerven hodet og arteria ophthalmica som gir blod til entoretina ble skadet og påvirket under operasjonen, høyre øye-fundus ble avbildet før og etter operasjonen. Bildene viste blod forsyning til det høyre øyet (operative øyet) før og 1 time etter operasjonen. Blodet i arteriene var tilstrekkelig. Ingen hindring i venen ble observert. Disse funnene indikerte at det var ingen skade å levere blodet under operasjonen (figur 4A, figur 4B). Derfor ble sekundære degenerasjon modell av RGCs opprettet.
Figur 1 : Fotografier av egenutviklede kirurgisk assistent instrument, SSAI. (A) panoramautsikt over det kirurgiske instrumentet, med to deler, inkludert en håndholdt stang og en riflet hodet. Mellom dem er det en felles del med en lengde på 50 mm. Håndholdt pole er 100 mm, og diameteren på håndholdt pole er 9 mm. (B) A funksjon Groove-SSAI. Riflet overflate riflet hodet er semi-sirkulære, som gjør at den optiske nerven å legge i det, blir stabilisert for transection. Riflet er med et vertikalt dyp av 200 µm og en bredde på 500 µm og en lengde på 1000 µm. Bredden på kanten av riflet hodet er 300 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjematisk diagram av RGC merking på netthinnen etter delvis transection av høyre synsnerven med egenutviklede kirurgisk assistent apparatet (SSAI) og retrogradely merking overlegen colliculus med fluorophore. (A) kirurgisk visningen av delvis rett synsnerven transection i rotter med egenutviklede kirurgisk assistent apparatet (SSAI). (B) etter modellering, RGCs var benevnt retrogradely ved å injisere en neural tracer fargestoff (gul farge, 3% fluorophore i sterilt fosfat buffer saltvann) inn overlegen colliculus i hjernen. Siden axons av RGCs bor i overlegen colliculus, tracer fargestoff er tatt opp av RGCs retrogradely og utgjør en markør for lever celler. Tverrstilt delen i figuren representerer et tverrsnitt av synsnerven. OD, styres øyet; OS, kontroll øye uten operasjon. I (C), var bare RGCs tilsvarer den untransected delen av synsnerven merket med fluorophore. Blå representerer unseparated ventrale optiske nervene og de tilsvarende RGCs på netthinnen; rød gjenspeiler delvis transected dorsal optiske nervene og de tilsvarende RGCs på netthinnen. (D) retinal RGCs av det venstre øyet (kontroll øyet) uten kirurgiske prosedyren var alle merket av fargestoff. Rygg- og ventrale optiske nervene var alle merket av fargestoff også. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Hele netthinnen epifluorescence micrographs av fluorophore merket RGCs 7 dager etter å etablere delvis synsnerven transection modell og retrograd merking av overlegen colliculus. De tilsvarende skjematisk diagrammene av Fluorogold farget RGC områder på netthinnen presenteres også. (A) og (C) representerer de skjematisk diagrammene av RGCs i netthinnen av høyre (operative) og venstre (kontroll) øyne etter merking med fluorophore, henholdsvis. Gult angir området merket med fluorescerende gull fargestoff. Netthinnen deles inn dorsal, ventral og sentrale deler. (B) og (D) representerer hele retinal epifluorescence micrographs innhentet under fluorescens mikroskop; gul representerer området RGCs merket med fluorophore. I kirurgiske øyet (høyre øye) vises i B, representerer umerkede regionen området RGCs tilsvarer synsnerven som er delvis transected, hovedsakelig på dorsal side av netthinnen. Regionen merket med fluorescerende gull fargestoff er området RGCs tilsvarer synsnerven som ikke transected og hovedsakelig konsentrert i sentrale og ventrale sidene av netthinnen. BounDary mellom områdene umerkede og merket RGCs er klart. Primære degenerasjon av RGC organer vil være begrenset til dorsal netthinnen, og alle tap av RGC organer i sentrale og ventrale netthinnen tilskrives sekundære degenerasjon. (D) hele retinal photomicrograph av venstre øye etter merking av RGCs med fluorophore. RGCs i venstre kontroll øyet uten kirurgiske prosedyren var helt farget av fluorophore. Skalere barer = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Preoperativ og postoperativ bilder av fundus av høyre øye fikk av Fundus kameraet. (A) bilde av fundus før høyre øyekirurgi i rotter, viser god blodtilførsel til fundus, arteriell fylling, og ingen venøs retur eller obstruksjon, som indikerer en god retinal blod forsyning system. (B) bilde av fundus av høyre øye 1 time etter operasjonen. Sammenlignet med preoperativ bildet av fundus, ble ingen vesentlige endringer observert i netthinnen blodtilførsel, indikerer at blod forsyning system av øyeeplet ikke ble påvirket under av modellering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Fotografier av synsnerven retrobulbar og arteria ophthalmica ligger på meningeal skjede, fanget gjennom kirurgisk tilnærming. Etter fullstendig fjerning målrettet lengden av synsnerven, var ophthalmica arterien (pilspiss) samtidig med meningeal skjede av synsnerven utsatt, og parallelt med den optiske nerven. Skalere barer = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Skjematisk diagram av primære og sekundære degenerasjon steder i synsnerven. Delvis snitt av synsnerven ble oppnådd med egenutviklede kirurgisk assistent apparatet (pilspiss). Axons i direkte skadede områder (dorsal kutte område av den optiske nerven i tverrstilt delen grå) gjennomgå primære degenerasjon, mens de i skadet indirekte nettsteder (sentrale og ventrale områder av synsnerven i tverrstilt delen gul) gjennomgå sekundære degenerasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Operative prosedyren
Det er noen punkter verdig varsel under modell oppbygging. I trinnet 4.2 skal kirurgisk bevegelsen utføres nøye for å unngå skade blodkar over subfascial muskelen. Spesielt når subkutan fascia i den ytre lateral canthus, skal skarp taggete tang brukes til å trekke oppover subkutan fascia på fascia overflaten loddrett; fascia bør kuttes med Vannas våren saks for å unngå skade orbital venen på den ytre canthus, som kan resultere i modellen feilen av overdreven blødning. Trinnet 4.3 har fordelen av potensielt hindre blødning når direkte fra blodkar. I skille orbital musklene i trinn 4.5, årsaken plukking skarp taggete tang men ikke Vannas er våren saks å unngå kontinuerlig blødning og blødning. Musklene skilles rett ut på begge sider i vinkelrett retning til huden fascia innsnitt; i mellomtiden er dyp musklene i bane strukket utover og perifert. Denne fremgangsmåten vil avdekke dypere deler av orbital hulrom, gir et større kirurgisk vindu og uhindret tilgang til vev overliggende synsnerven. I fremgangsmåtene ovenfor hvis blødning oppstår, trykket bør brukes med sterilt kirurgisk eller bomull vattpinner. Mindre blødning stopper etter noen sekunder av denne prosedyren. Formålet med trinn 4.6 er å lette oppfølging operasjoner for å enkelt fjerne noen fett og separat musklene i bane muskel kjegle å avsløre synsnerven retning synsnerven i orbital dybden.
De viktigste delene av gjeldende protokollen er trinn 5.1-5.6. Det er viktig ikke å skade blodkar rundt synsnerven hodet. Synsnerven bør være delvis transected minst 1,5-2.0 mm fra baksiden av øyet, å unngå skade arteria ophthalmica som trenger nerve innen 1 mm i øyet og leverer blod til indre netthinnen. Formålet om å kutte den laterale rectus er å oppnå bedre eksponering av synsnerven som den laterale rectus bred og åpenbart blokkerer visningen av synsnerven. I mellomtiden, for å unngå fjerning arteria ophthalmica som er forbundet med meningeal skjede (figur 5), er det nødvendig å skille og dissociate dura rundt synsnerven og undersøke vaskulær mønster av meningeal skjede, ved hjelp av pinsett forsiktig rotere skjede. Dessuten, skal et område uten blodkar identifiseres, slik at en langsgående kutt i meningeal skjede. Det er også nødvendig for å opprettholde en liten arbeidsavstand fra baksiden av øyet, å unngå delen av dura som er nært forbundet med ophthalmica arterien. Netthinnen er vanligvis gjennomsiktige blodkarene kan være klart avgrenset. Ved skadet retinal blodtilførsel, er netthinnen degenerert, fører til en melkeaktig hvit flocculent utseende. Glasslegemet Mysteriekammeret øyet og linsen blir vanligvis skyet, med redusert øyne størrelse over tid. I denne studien bekreftet preoperativ og postoperativ bilder av fundus ingen skader på fundus blod forsyning i modellen etter bruk trinnene ovenfor.
Videre kreves spesiell omsorg flere trinn av denne modellen. Når du bruker skarp-buet-taggete tang eller andre Kirurgiske instrumenter for å avsløre synsnerven, bør kirurgen unngå overdreven kraft, da dette kan skade synsnerven, øyeeplet eller ophthalmica arterie, primære skader og retinal ischemia. I tillegg bør blodkar rundt øyet ikke være skadet, for å unngå vedvarende blødning, som kan føre til svikt i modellering. SSAI brukt i dette eksperimentet krever delikat bruk. Når synsnerven plasseres i instrumentet sporet, må synsnerven og overflate monteres tett å sikre god konsistens og repeatability av hver dyremodell. Med praksis, kan full kirurgiske prosedyren fullføres innen 15-20 minutter per øye, etter at de opprinnelige posten kuttene er utført.
Wang et al. 19 publisert en lignende dyr modell av delvis synsnerven transection etableres ved hjelp av en synsnerven kvantitative amputator. De kirurgiske prosedyrene inkluderer: 1) skjære hverandre den ytre canthus, suspendere og fikse palpebral superior; 2) å utforske synsnerven, og transecting den bedre delen av synsnerven bruker amputator; og 3) Suturing conjunctiva og hud. Selv om den kirurgiske prosedyren var relativt enkel, oppstod følgende problemer under operasjonen. Selv om lateral canthus snitt kan utsette bestemt plass for operasjonen, var det en uunngåelig må hele tiden strekke øyeeplet slik at retrobulbar synsnerven skjede, spesielt når kirurgene ønsket å eksponere en lengre retrobulbar synsnerven skjede å lette videre skjede isolasjon; styrken for å strekke øyeeplet var større, som er sannsynlig å skade direkte trekkraft øyeeplet og synsnerven. Ingen spesiell oppmerksomhet ble betalt til blodårene som kan bli kuttet med synsnerven skjede, og skader på blodkar er sannsynlig føre til mislykket modell etablering. Viktigste prosedyrene for sekundær skade modellen beskrevet i denne hvitboken er: en ny operative tilnærming fra den laterale orbital veggen av øyeeplet til direkte tilgang retrobulbar synsnerven omgitt av orbital muskel kjeglen, unngå primære skader på øyeeplet og synsnerven, når nedover eller mot nasal laterale siden av øyeeplet. Denne nye operative tilnærmingen øker for kirurgisk operasjon under modellering og kan lett isolering av meningeal skjede, som er nært forbundet med ophthalmica arterien, før delvis transection av synsnerven. Delvis synsnerven transection ble utført med en egenutviklede kirurgisk instrument, som er kostnadseffektive og gjenbrukbare, redusere totalkostnadene for modellering. Rottas orbital strukturen er forskjellige fra andre pattedyr, med bane nærmest canthus og ingen benete struktur, men dekket med muskler. Kirurgisk tilnærming kan nå bakre del av øyeeplet uten behovet av orbital bein og periosteum. Gjennom streng preoperativ desinfeksjon og postoperativ antibiotika profylakse, var infeksjon, betennelse og ødem sterkt redusert.
Egenutviklede kirurgisk hjelperen Instrument
En rotte modell av delvis synsnerven transection ble etablert med egenutviklede kirurgisk assistent instrumentet, hvis hovedfunksjoner er som følger. Det kan hjelpe delvis kvantitative transection av synsnerven utsatt for riflet kanten, sørge for transection konsekvens mellom forskjellige dyr. Vi testet og bekreftet repeatability av modellen etablissement med SSAI. Den maksimale variasjonskoeffisienten var 1,85%, med en gjennomsnittlig verdi 0,67% ±0. 44%. 20 disse resultatene indikerer at SSAI kan brukes til å opprette delvis synsnerven transection modeller, med tilfredsstillende reproduserbarhet og FNiformity.
Riflet overflate bredde og design i halvsirkelen av sporets indre overflate kan ha en mer fast effekt på den optiske nerven og gjøre overflaten og synsnerven fest tettere, også redusere eksperimentelle feil og bivirkninger. Riflet kanten gir en bedre beskyttelse av synsnerven i sporet under operasjonen, som ikke vil skade den optiske nerven i sporet, uansett den kutter skarphet. En annen fordel riflet kant er forelsket skadeforebygging under synsnerven transection.
Det er egnet for opererer i dyp og smal plass. Den nye operative tilnærmingen utvidet, veien er fortsatt dyp og håndholdte pole og felles delen kan brukes til å plassere riflet hodet lett under synsnerven skjede utføre oppfølging operasjoner. Når apparatet brukes for operasjonen, kan en rekke cutters brukes transection, f.eks en 26 G pinne-spissen. Med en safir kirurgisk sonde kniv kan velge å unngå contusion og knuse skader forårsaket av saks. Groove overflater kan gjøres i forskjellige vertikalt dyp å fullføre varierende synsnerven kutte.
Sammenlignet med amputator av Wang har et al. SSAI en enklere struktur. I tillegg er kutte trinnet enklere med SSAI, med forbedret konsistens og repeatability av dyr modellen. Endelig er rekke verktøy anvendelig for skjæring med SSAI også større. I konklusjonen, kan SSAI, som gjør kvantitative og ensartet incisions i nerve, tjene som et effektivt instrument for å etablere rotte modeller for å vurdere synsnerven transection.
Kjennetegner rotte delvis synsnerven Transection modell
Delvis synsnerven transection modellen er nyttig å vurdere sekundære degenerasjon i RGCs. Potensielle fortjeneste av denne modellen er evnen å skille primære fra sekundær degenerasjon nøyaktig i situ, både i synsnerven og netthinnen. De sentrale og ventrale optiske nervene var mer utsatt for sekundær skade etter delvis transection (ca 1/3 til 1/2) av dorsal synsnerven (figur 6). I netthinnen, bør regionale plasseringen av primære og sekundære skader av RGCs være basert på topografien synsnerven tilsvarer retinal RGCs etter delvis transection. Hvis hele netthinnen av rotte er delt inn i dorsal (superior) og ventrale (underlegen) deler, er videregående og primære skader tilstede i begge deler. Imidlertid bør basert på forholdet mellom RGCs på netthinnen og synsnerven axon, RGC død i ventrale netthinnen hovedsakelig tilskrives sekundære skade (Figur 3). 12 , 22 , 23 fordelene med denne modellen inkluderer: enkel og lett å betjene instrument med standard prosedyrer; ingen innvirkning på ophthalmica skip; god reproduserbarhet og stabilitet. Denne teknikken kan brukes til å transfect RGCs fra denne plassbesparende operativ ved å bruke kort forstyrrende RNAs (siRNAs), plasmider, og viral vektorer av delvis synsnerven stubben; reagenser kan i tillegg plasseres på delvis synsnerven stump for selektiv behandling eller merking av RGCs.
Total, primære og sekundære skader av RGCs coexisted etter delvis synsnerven transection i denne dyr modellen, med en klar grense i netthinnen mellom de to skade. Selv om foreningen av synsnerven axons og RGC plassering på netthinnen må videre undersøkelser for en mer presis utmerkelsen, denne plassbesparende operative utvider hvilket program modellen og tillater forskere å utforske den mekanismer for sekundær skade i RGCs på en ny måte.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at de har ikke noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (7152038), grunnleggende forskning midlene sentral universitetene i Central Sør University (2016zzts162) og Science Foundation av Aier Eye Hospital forskergruppe (Grant nr. AF156D11). Til slutt, takk Fancheng Yan Yiping Xu for uvurderlig støtte gjennom årene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
| Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
| Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
| Fluorogold | Biotium | 80014 | |
| Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
| Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
| Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
| Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
| Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
| 26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
| 10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
| 5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
| Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
| Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
| Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
| RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
| Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |
References
- Stoica, B. A., Faden, A. I. Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 7 (1), 3-12 (2010).
- Hausmann, O. N. Post-traumatic inflammation following spinal cord injury. Spinal Cord. 41 (7), 369-378 (2003).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guimaraes, J. S., et al. Mechanisms of secondary degeneration in the central nervous system during acute neural disorders and white matter damage. Rev Neurol. 48 (6), 304-310 (2009).
- Stewart, S. S., Appel, S. H. Trophic factors in neurologic disease. Annu Rev Med. 39, 193-201 (1988).
- Brubaker, R. F. Delayed functional loss in glaucoma. LII Edward Jackson Memorial Lecture. Am J Ophthalmol. 121 (5), 473-483 (1996).
- Yoles, E., Schwartz, M. Degeneration of spared axons following partial white matter lesion: implications for optic nerve neuropathies. Exp Neurol. 153 (1), 1-7 (1998).
- Nickells, R. W. From ocular hypertension to ganglion cell death: a theoretical sequence of events leading to glaucoma. Can J Ophthalmol. 42 (2), 278-287 (2007).
- Doucette, L. P., Rasnitsyn, A., Seifi, M., Walter, M. A. The interactions of genes, age, and environment in glaucoma pathogenesis. Surv Ophthalmol. 60 (4), 310-326 (2015).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Rokicki, W., Dorecka, M., Romaniuk, W. Retinal ganglion cells death in glaucoma--mechanism and potential treatment. Part II. Klin Oczna. 109 (7-9), 353-355 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. A model to study differences between primary and secondary degeneration of retinal ganglion cells in rats by partial optic nerve transection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (8), 3388-3393 (2003).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system. J Vis Exp. (51), (2011).
- Yoles, E., et al. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (13), 3586-3591 (1992).
- Fisher, J., et al. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21 (1), 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
- Li, Y., et al. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. J Clin Invest. 118 (3), 913-923 (2008).
- Tang, Z., et al. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. J Exp Med. 207 (4), 867-880 (2010).
- Wang, X., Li, Y., He, Y., Liang, H. S., Liu, E. Z. A novel animal model of partial optic nerve transection established using an optic nerve quantitative amputator. PLoS One. 7 (9), e44360 (2012).
- Yan, F. C., Li, S. N., Liu, K. G., Lu, Q. J., Wang, N. L. The establishment of a rat partial optic nerve transection model and assessment of its reproducibility. Ophthalmology in China. 22 (1), 34-37 (2013).
- Fitzgerald, M., et al. Secondary degeneration of the optic nerve following partial transection: the benefits of lomerizine. Exp Neurol. 216 (1), 219-230 (2009).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. J Neurotrauma. 27 (11), 2107-2119 (2010).
- Li, H., et al. Lycium barbarum (wolfberry) reduces secondary degeneration and oxidative stress, and inhibits JNK pathway in retina after partial optic nerve transection. PLoS One. 8 (7), 68881 (2013).
