Summary

Förbättrad metod för inrättandet av ett In Vitro blod - hjärnbarriären modell baserat på svin hjärnan endotelceller

Published: September 24, 2017
doi:

Summary

Syftet med protokollet är att presentera en optimerad förfarande för inrättande av ett in vitro- blod – hjärnbarriären (BBB) modell baserad på primära svin hjärnan endotelceller (pBECs). Den modellen visar hög reproducerbarhet, hög täthet, och är lämplig för studier av transport och intracellulära människohandel läkemedelsutveckling.

Abstract

Syftet med detta protokoll presenterar en optimerad förfarande för rening och odling av pBECs och att upprätta in vitro- blod – hjärnbarriären (BBB) modeller baserade på pBECs i mono-kultur (MC), MC med Astrocyten denvillkorade medium (ACM), och Beröringsfri samtidig kultur (NCC) med astrocyter av svin eller råtta ursprung. pBECs var isolerade och odlade från fragment av kapillärerna från de hjärnan cortices av tamsvin 5-6 månader gammal. Dessa fragment var renas genom noggrann borttagning av hjärnhinnorna, isolering och homogenisering av grå substans, filtrering, enzymatisk nedbrytning och centrifugering. För att ytterligare minska kontaminerande celler, odlades kapillär fragment med puromycin-innehållande medium. När 60-95% konfluenta, pBECs växande från kapillär fragment var anpassade till genomsläpplig membranfilter infogar och etablerade i modellerna. För att öka barriär täthet och BBB karakteristiska fenotyp av pBECs, cellerna behandlades med följande differentiering faktorer: membran diffusionskoefficient 8-CPT-cAMP (här förkortad cAMP), hydrokortison och en inhibitor för phosphodiesterasetyp, RO-20-1724 (RO). Förfarandet genomfördes under en period av 9-11 dagar, och vid fastställandet av NCC modellen, astrocyterna odlades 2-8 veckor i förväg. Efterlevnad av förfarandena som beskrivs i protokollet har möjliggjort inrättandet av endotel lager med mycket begränsad paracellular permeabilitet, med NCC modell visar en genomsnittlig transendothelial elektrisk resistans (TEER) 1249 ± 80 Ω cm 2, och paracellular permeabilitet (Papp) för Lucifer gul 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm SEK-1 (menar ± SEM, n = 55). Ytterligare utvärdering av denna pBEC fenotyp visade bra uttryck för den snäva Junktional proteiner claudin 5, ZO-1, occludin och adherens junction proteinet p120 catenin. Den modell som presenteras kan användas för en rad studier av BBB vid hälsa och sjukdom och med mycket restriktiva paracellular permeabilitet, denna modell är lämplig för studier av transport och intracellulära människohandel.

Introduction

Cellulära struktur och funktion på blod – hjärnbarriären

På gränssnittet i cirkulations- och centrala nervsystemet (CNS) fungerar BBB som en viktig reglerande webbplats för homoeostatic kontroll av den CNS mikromiljö, vilket är viktigt för korrekt funktion och skydd av nervsystemet. Platsen för BBB är de endothelial celler som kantar blodkärl lumen. I hjärnan kapillärerna, endothelial celler bildar komplexa intercellulära åtsittande föreningspunkter och starkt polariserade uttrycksmönster av särskilt inflödet och utflödet transportörer säkerställa mycket specifika molekylär transport mellan blod och hjärna 1. De strukturella komponenterna i åtsittande föreningspunkt komplexen innehålla proteiner från occludin och claudin familj, zonula occludens (ZO) proteiner, cingulin, och tillhörande Junktional adhesionsmolekyler (JAMs). Claudin 5 är särskilt viktigt i paracellular Junktional begränsningen. Induktion och underhåll av detta karakteristiska BBB endothelial fenotyp involvera dynamiska samspel med omgivande celler, inklusive pericyter, astrocyter, nervceller och källaren membranen, som tillsammans med hjärnan endothelial celler bildar den neurovaskulära enhet (NVU)2,3. Mekanismerna som är involverade i dessa interaktioner är ännu inte helt förstått, men inkluderar utbyte av kemiska signaler mellan celler, som möjliggör modulering av BBB permeabilitet på kort sikt och inducerar långsiktiga BBB funktioner4. Astrocyter särskilt är kända för att bidra till den hjärna endotelceller fenotypen och är en källa till reglerande faktorer såsom gliaceller som härrör neurotrofa faktor (som påverkar intracellulära cAMP)5, basic fibroblast tillväxtfaktor6, hydrokortison7och omvandla tillväxtfaktor β (TGF-β)8. Effekten av TGF-β, har dock varit omdebatterade9.

Från In Vivo att In Vitro BBB

In vivo studier fortsätta att ge värdefull information om BBB biologi. Cell kultur modeller kan dock ge ytterligare insikter och utgöra användbara verktyg för att förstå detaljerade molekylära och funktionella aspekter av BBB vid både hälsa och sjukdom. Även om de komplexa interaktioner mellan de celltyper och beståndsdelarna i BBB är svårt att fullt ut uppnå i in vitro- modeller, har det varit, sen första rening av hjärnan endotelceller och tillämpningen av dessa i mono-kulturer 10 , 11 , 12, omfattande utveckling av rening förfaranden och tillväxt villkor av BBB cell kultur modeller, vilket resulterar i större likheter med den in-vivo -barriären. BBB vanligen används in vitro- modeller är baserade på primära celler av gnagare, svin och nötkreatur ursprung och förevigade cellinjer. Varje modell har olika fördelar och nackdelar. För jämförelse- och modell val används validering markörer såsom uttryck för BBB enzymer, transportörer, receptorer och strukturella proteiner för att skapa översikter över nuvarande etablerade modeller1.

Syftet med protokollet

Ett viktigt inslag i BBB är barriären täthet och hög TEER, men ett stort antal av de tillgängliga modellerna återspeglar inte väl i vivo nivåerna. Införliva utveckling och optimering bidrag från flera laboratorier, är syftet med detta protokoll att presentera en metod för att fastställa en hög TEER i vitro BBB modell baserad på primära pBECs i MC med eller utan ACM eller i NCC med primär astrocyter råtta eller svin. De tillämpade förfarandena och inrättandet av modellen inkluderar ansträngningar för att eliminera kontaminerande celler och förbättra differentieringen av pBECs in i en BBB fenotyp. Detta arbete har resulterat i bildandet av tillförlitliga, högkvalitativa TEER modeller med låg paracellular permeabilitet och bra funktionella uttryck för nyckel snäva Junktional proteiner, transportörer och receptorer. Dock astrocyterna är en bidragande faktor till den hjärna endotelceller fenotypen, representerar tre olika villkoren för kulturen tre olika fenotyper av hjärnan endotelceller. NCC modellen är särskilt användbar för studier av vissa specialiserade mekanismer som är involverade i läkemedelsutveckling, transportstudier och intracellulära människohandel, samt för undersökning av cell-cell interaktioner där maximal uttryck för BBB funktioner är fördelaktiga.

Ursprung och historia av protokollet

Den pBEC modellen beskrivs här baseras till stor del på svin-modellen utvecklad vid Eisai Laboratories (London) av Dr Louise Morgan och kollegor, som bygger på en framgångsrik tidigare nötkreatur hjärnan endotelceller modell13. Den ursprungliga framställningsmetoden cellen var en två-stegs filtrering med nylon nät för att fånga de microvesselsna, följt av ett subculturing steg för att förbättra branschrenheten. I den tidigare utvecklingen av metoden, optimal BBB fenotyp och barriär täthet uppnåddes genom tillväxt i kompletterade medium, inklusive ACM. Ytterligare ändringar av metoden har gjorts av R. Skinner i Prof N. Rothwell’s lab i Manchester UK14,15. Metoden antogs av Abbott laboratoriet, KCL London, där Patabendige gjorde det betydligt enklare att förbereda genom att undvika användning av astrocyter eller ACM och genom att eliminera kontaminerande celler såsom pericyter med puromycin. De första tidningarna bekräftade att MC modellen bevaras flera viktiga funktioner i vivo BBB, inklusive effektiv åtsittande föreningspunkter, membran transportsystem och receptor-medierad transcytos16,17 , 18 , 19 , 20. senare S. Yusof igen testade Astrocyten samtidig kultur och fann det betydligt bättre TEER, så detta är den föredragna varianten som för närvarande används i Abbott lab21. Modellen har nu framgångsrikt lab i Århus, där ytterligare ändringar har överförts till den M. Nielsen och introducerade (protokollet), inklusive förenkla grå materia utvinning, använda endast en mesh filtrering steg, och ett enda filter beläggning att kombinera kollagen och Fibronektin. Tillämpade förfarandet för isolering av svin astrocyter (protokollet) baserades på protokoll som utvecklats av T. Moos laboratoriet i Aalborg, beskrivs av Thomsen et al22. TEER och andra egenskaper för den modell som genereras i London och Aarhus är liknande, som lånar förtroende till uppfattningen att modellen överförs lätt mellan labs och svarar väl på noggrann observation och rationalisering av metod steg. Faktiskt, S. Yusof har nu etablerat MC modellen i ett tropiskt land (Malaysia)23, som involverade ytterligare justering för lokala förhållanden och vävnad källor.

Fördelar över alternativa metoder och för närvarande etablerade modeller

PBECs jämfört med hjärnan endothelial celler av nötkreatur och gnagare ursprung, och ger fördelen av att ha en lägre frekvens av förlust av den i vivo BBB fenotyp efter isolering24. PBECs är dessutom kan bilda relativt snäva endotelceller hinder, även när den odlas i MC (800 Ω cm2)16 jämfört med vanligt rapporterade nivåerna för enskiktslager av cellinjer som bEND.5 och bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27och cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32, cslutet (300-800 Ω cm2)28,29,30, och primära hjärnan endotelceller i mus (100-300 Ω cm2)SS = ”xref” > 33,34,35,36 och råtta (100-300 Ω cm2)37,38. TEER har emellertid visat beroende på förfarandena som rening och kultur. I de flesta fall visar tillägg av ACM eller samtidig kultur med astrocyter särskiljande effekter på endotelceller och en ökning i täthet av endotel lager1. Dock med insatser för att optimera de culturing villkor, endast de nötkreatur-baserade modellerna har visat TEER värden jämförbara till svin-baserade modeller (genomsnitt av 800 Ω cm2 i MC, upp till 2500 Ω cm2 i Astrocyten samtidig kultur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Som modeller baserat på primära nötkreatur hjärnan har endotelceller visat stora variationer, både mellan och inom laboratorier14,45,46,47,48, reproducerbarhet kan vara ett problem. I den pBEC modellen redovisas här, har de bidragande laboratorierna uppnått mycket liknande TEER och paracellular permeabilitet värden med låg variabilitet, både i och mellan laboratorier. Därför bör det vara möjligt för andra laboratorier för att upprätta en robust modell med låg variabilitet med metoden presenteras här. Förutom att bilda snäva endotelceller lager, har modeller med pBECs tidigare validerats av uttryck av åtsittande föreningspunkt proteiner, funktionella BBB transportörer, receptorer och enzymer och visat lämplighet för en rad studier15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Dessutom opublicerade transkriptom data på samtidig kulturerna av pBECs visar en förväntad profil av BBB transportörer och receptorer (opublicerade resultat, Nielsen et al.).

Svin-baserade BBB modellen har ytterligare en fördel som genomet, anatomi, fysiologi och sjukdomsprogression av gris återspeglar den mänskliga biologin i högre grad än andra etablerade modeller60, som är gynnsamma funktioner för den läkemedelsindustrin. Som svin hjärnor är en gemensam biprodukt från köttindustrin, utgör de en lättillgänglig källa av hjärnan endotelceller, vilket minimerar antalet djur behövs för experiment, och ger en hög rening avkastning från en svin hjärna. Även om rening och odling av primära celler är något tidsödande och kräver sakkunskap för standardisering i inställningen upp modellen, generera primärceller de mest tillförlitliga BBB-modellerna. Förevigade cellinjer kan inte vara ett substitut, som viktiga egenskaper såsom barriär täthet, transportören uttrycket profiler och mikromiljö förordning inte återspeglar den experimentella fynd i vivo61, 62. in vitro -modeller ger fördelen med live-cell imaging med högre upplösning, möjliggör visualisering av intracellulära processer genom att låta ett nära förhållningssätt till urvalet eller observerade cellerna, med mål med högre förstoring och bättre optisk kvalitet63. Detta är inte fallet för användning av 2-foton mikroskopi i levande djur. In vitro- modeller ger dessutom möjlighet att transfect celler, möjliggör visualisering av märkta proteiner och utredning av deras handel.

Tillämpningar av modellen

Funktionen av BBB inte är fast och kan anpassas dynamiskt både fysiologi och patologi. I många neurologiska sjukdomar, inklusive neurodegenerativa, observeras inflammatoriska och infektiösa sjukdomar, störningar och ökad permeabilitet i BBB64,65,66,67 . För att minska och förebygga sjukdomsutveckling och efterföljande skador, är identifiering och karakterisering av de molekylära mekanismerna bakom moduleringen av BBB av stor betydelse. I detta sammanhang tillförlitlig in vitro- modeller är i hög efterfrågan av läkemedelsindustrin, och dessutom spela en viktig roll i att förutsäga BBB permeabilitet av läkemedel till CNS. Alla in vitro- modell som fungerar som en permeabilitet skärm ska visa en restriktiv paracellular väg, ett fysiologiskt realistiska cell arkitektur och funktionella uttryck för transportören mekanismer68. Visat i tidigare studier16,17,57, och av paracellular permeabilitet och uttrycket av TJ och AJ proteiner här, den presenterade modellen uppfyller alla dessa kriterier och är lämplig för en rad av BBB studier av både normal fysiologi och patologi. Styrkan i den presenterade metoden för rening och odling omfattar en kombination av enkelhet och reproducerbarhet och förmågan att inbegripa astrocytic inflytande med en resulterande robust och tillförlitlig hög TEER i vitro BBB modell. För detta ändamål, astrocyter av svin och råtta ursprung har visat sig öka BBB fenotypen av pBECs i ett liknande sätt22.

Protocol

svin hjärnor var erhålls som biprodukter av danska livsmedelsindustrin. Danska slakterier är under strikt övervakning och observation av det danska ministeriet för miljö och god mat. råttor används för isolering av astrocyter var uppfödd och grupp-inrymt i lokala djuranläggningen vid en omgivande temperatur 22 ° C – 23 ° c och på en 12/12 h mörk/ljus cykel under kontroll av veterinär och enligt danska regler för försöksdjur. Råttorna var avlivas innan de offrades i enligh…

Representative Results

Etablering av BBB In Vitro modeller I metoden presenteras, optimerad genomfördes odling av pBECs och upprättandet av högpermeabla membran infoga systemet med MC eller utan ACM eller NCC med astrocyter (figur 1) för 9-11 dagar (figur 2). För urval av endotelceller, en inledande kultur av renat kapillär fragment kombinerades med puromycin behandling för högs…

Discussion

Rening och spridning av pBEC

Under förfarandet för rening inkluderar kritiska steg snabbt och effektivt avlägsnande av hjärnhinnorna och separation av vita och grå materia, vilket är viktigt för rening avkastning och renhet och för korrekt fastställande av modellen. För presenteras i vitro BBB modellen med pBECs, har vi förbättras och förenklas en rening förfarande baserat på mekanisk homogenisering av isolerade grå hjärnsubstans, selektivt filtrering för isolering av m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill erkänna Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen och Niels M. Kristiansen för tekniskt bistånd och stiftelsen Lundbeck bevilja nummer R155-2013-14113.

Materials

Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE – 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D’Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -. F., Hanapi, N. A., Chan, K. -. L., Yusof, S. R., Lee, C. -. Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction ‘opening’: signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli, , et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood–brain barrier. AIDS. 15 (4), 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -. J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -. J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -. J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -. Y., Zhu, H. -. M., Wu, J. -. H., Wen, H., Liu, C. -. J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer’s and Parkinson’s disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Play Video

Cite This Article
Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).

View Video