Förbättrad metod för inrättandet av ett In Vitro blod - hjärnbarriären modell baserat på svin hjärnan endotelceller

Summary

Syftet med protokollet är att presentera en optimerad förfarande för inrättande av ett in vitro- blod – hjärnbarriären (BBB) modell baserad på primära svin hjärnan endotelceller (pBECs). Den modellen visar hög reproducerbarhet, hög täthet, och är lämplig för studier av transport och intracellulära människohandel läkemedelsutveckling.

Abstract

Syftet med detta protokoll presenterar en optimerad förfarande för rening och odling av pBECs och att upprätta in vitro- blod – hjärnbarriären (BBB) modeller baserade på pBECs i mono-kultur (MC), MC med Astrocyten denvillkorade medium (ACM), och Beröringsfri samtidig kultur (NCC) med astrocyter av svin eller råtta ursprung. pBECs var isolerade och odlade från fragment av kapillärerna från de hjärnan cortices av tamsvin 5-6 månader gammal. Dessa fragment var renas genom noggrann borttagning av hjärnhinnorna, isolering och homogenisering av grå substans, filtrering, enzymatisk nedbrytning och centrifugering. För att ytterligare minska kontaminerande celler, odlades kapillär fragment med puromycin-innehållande medium. När 60-95% konfluenta, pBECs växande från kapillär fragment var anpassade till genomsläpplig membranfilter infogar och etablerade i modellerna. För att öka barriär täthet och BBB karakteristiska fenotyp av pBECs, cellerna behandlades med följande differentiering faktorer: membran diffusionskoefficient 8-CPT-cAMP (här förkortad cAMP), hydrokortison och en inhibitor för phosphodiesterasetyp, RO-20-1724 (RO). Förfarandet genomfördes under en period av 9-11 dagar, och vid fastställandet av NCC modellen, astrocyterna odlades 2-8 veckor i förväg. Efterlevnad av förfarandena som beskrivs i protokollet har möjliggjort inrättandet av endotel lager med mycket begränsad paracellular permeabilitet, med NCC modell visar en genomsnittlig transendothelial elektrisk resistans (TEER) 1249 ± 80 Ω cm ², och paracellular permeabilitet (P_app) för Lucifer gul 0,90 10^-6 ± 0,13 10^-6 cm SEK^-1 (menar ± SEM, n = 55). Ytterligare utvärdering av denna pBEC fenotyp visade bra uttryck för den snäva Junktional proteiner claudin 5, ZO-1, occludin och adherens junction proteinet p120 catenin. Den modell som presenteras kan användas för en rad studier av BBB vid hälsa och sjukdom och med mycket restriktiva paracellular permeabilitet, denna modell är lämplig för studier av transport och intracellulära människohandel.

Introduction

Cellulära struktur och funktion på blod – hjärnbarriären

På gränssnittet i cirkulations- och centrala nervsystemet (CNS) fungerar BBB som en viktig reglerande webbplats för homoeostatic kontroll av den CNS mikromiljö, vilket är viktigt för korrekt funktion och skydd av nervsystemet. Platsen för BBB är de endothelial celler som kantar blodkärl lumen. I hjärnan kapillärerna, endothelial celler bildar komplexa intercellulära åtsittande föreningspunkter och starkt polariserade uttrycksmönster av särskilt inflödet och utflödet transportörer säkerställa mycket specifika molekylär transport mellan blod och hjärna ¹. De strukturella komponenterna i åtsittande föreningspunkt komplexen innehålla proteiner från occludin och claudin familj, zonula occludens (ZO) proteiner, cingulin, och tillhörande Junktional adhesionsmolekyler (JAMs). Claudin 5 är särskilt viktigt i paracellular Junktional begränsningen. Induktion och underhåll av detta karakteristiska BBB endothelial fenotyp involvera dynamiska samspel med omgivande celler, inklusive pericyter, astrocyter, nervceller och källaren membranen, som tillsammans med hjärnan endothelial celler bildar den neurovaskulära enhet (NVU)^2,3. Mekanismerna som är involverade i dessa interaktioner är ännu inte helt förstått, men inkluderar utbyte av kemiska signaler mellan celler, som möjliggör modulering av BBB permeabilitet på kort sikt och inducerar långsiktiga BBB funktioner⁴. Astrocyter särskilt är kända för att bidra till den hjärna endotelceller fenotypen och är en källa till reglerande faktorer såsom gliaceller som härrör neurotrofa faktor (som påverkar intracellulära cAMP)⁵, basic fibroblast tillväxtfaktor⁶, hydrokortison⁷och omvandla tillväxtfaktor β (TGF-β)⁸. Effekten av TGF-β, har dock varit omdebatterade⁹.

Från In Vivo att In Vitro BBB

In vivo studier fortsätta att ge värdefull information om BBB biologi. Cell kultur modeller kan dock ge ytterligare insikter och utgöra användbara verktyg för att förstå detaljerade molekylära och funktionella aspekter av BBB vid både hälsa och sjukdom. Även om de komplexa interaktioner mellan de celltyper och beståndsdelarna i BBB är svårt att fullt ut uppnå i in vitro- modeller, har det varit, sen första rening av hjärnan endotelceller och tillämpningen av dessa i mono-kulturer ^{10 , 11 , 12}, omfattande utveckling av rening förfaranden och tillväxt villkor av BBB cell kultur modeller, vilket resulterar i större likheter med den in-vivo -barriären. BBB vanligen används in vitro- modeller är baserade på primära celler av gnagare, svin och nötkreatur ursprung och förevigade cellinjer. Varje modell har olika fördelar och nackdelar. För jämförelse- och modell val används validering markörer såsom uttryck för BBB enzymer, transportörer, receptorer och strukturella proteiner för att skapa översikter över nuvarande etablerade modeller¹.

Syftet med protokollet

Ett viktigt inslag i BBB är barriären täthet och hög TEER, men ett stort antal av de tillgängliga modellerna återspeglar inte väl i vivo nivåerna. Införliva utveckling och optimering bidrag från flera laboratorier, är syftet med detta protokoll att presentera en metod för att fastställa en hög TEER i vitro BBB modell baserad på primära pBECs i MC med eller utan ACM eller i NCC med primär astrocyter råtta eller svin. De tillämpade förfarandena och inrättandet av modellen inkluderar ansträngningar för att eliminera kontaminerande celler och förbättra differentieringen av pBECs in i en BBB fenotyp. Detta arbete har resulterat i bildandet av tillförlitliga, högkvalitativa TEER modeller med låg paracellular permeabilitet och bra funktionella uttryck för nyckel snäva Junktional proteiner, transportörer och receptorer. Dock astrocyterna är en bidragande faktor till den hjärna endotelceller fenotypen, representerar tre olika villkoren för kulturen tre olika fenotyper av hjärnan endotelceller. NCC modellen är särskilt användbar för studier av vissa specialiserade mekanismer som är involverade i läkemedelsutveckling, transportstudier och intracellulära människohandel, samt för undersökning av cell-cell interaktioner där maximal uttryck för BBB funktioner är fördelaktiga.

Ursprung och historia av protokollet

Den pBEC modellen beskrivs här baseras till stor del på svin-modellen utvecklad vid Eisai Laboratories (London) av Dr Louise Morgan och kollegor, som bygger på en framgångsrik tidigare nötkreatur hjärnan endotelceller modell¹³. Den ursprungliga framställningsmetoden cellen var en två-stegs filtrering med nylon nät för att fånga de microvesselsna, följt av ett subculturing steg för att förbättra branschrenheten. I den tidigare utvecklingen av metoden, optimal BBB fenotyp och barriär täthet uppnåddes genom tillväxt i kompletterade medium, inklusive ACM. Ytterligare ändringar av metoden har gjorts av R. Skinner i Prof N. Rothwell’s lab i Manchester UK^14,15. Metoden antogs av Abbott laboratoriet, KCL London, där Patabendige gjorde det betydligt enklare att förbereda genom att undvika användning av astrocyter eller ACM och genom att eliminera kontaminerande celler såsom pericyter med puromycin. De första tidningarna bekräftade att MC modellen bevaras flera viktiga funktioner i vivo BBB, inklusive effektiv åtsittande föreningspunkter, membran transportsystem och receptor-medierad transcytos^{16,17 , 18 , 19 , 20}. senare S. Yusof igen testade Astrocyten samtidig kultur och fann det betydligt bättre TEER, så detta är den föredragna varianten som för närvarande används i Abbott lab²¹. Modellen har nu framgångsrikt lab i Århus, där ytterligare ändringar har överförts till den M. Nielsen och introducerade (protokollet), inklusive förenkla grå materia utvinning, använda endast en mesh filtrering steg, och ett enda filter beläggning att kombinera kollagen och Fibronektin. Tillämpade förfarandet för isolering av svin astrocyter (protokollet) baserades på protokoll som utvecklats av T. Moos laboratoriet i Aalborg, beskrivs av Thomsen et al²². TEER och andra egenskaper för den modell som genereras i London och Aarhus är liknande, som lånar förtroende till uppfattningen att modellen överförs lätt mellan labs och svarar väl på noggrann observation och rationalisering av metod steg. Faktiskt, S. Yusof har nu etablerat MC modellen i ett tropiskt land (Malaysia)²³, som involverade ytterligare justering för lokala förhållanden och vävnad källor.

Fördelar över alternativa metoder och för närvarande etablerade modeller

PBECs jämfört med hjärnan endothelial celler av nötkreatur och gnagare ursprung, och ger fördelen av att ha en lägre frekvens av förlust av den i vivo BBB fenotyp efter isolering²⁴. PBECs är dessutom kan bilda relativt snäva endotelceller hinder, även när den odlas i MC (800 Ω cm²)¹⁶ jämfört med vanligt rapporterade nivåerna för enskiktslager av cellinjer som bEND.5 och bEND.3 (50 Ω cm²) ^{25 , 26 , 27}och cerebEND (500 Ω cm²)^29,31,32, cslutet (300-800 Ω cm²)^28,29,30, och primära hjärnan endotelceller i mus (100-300 Ω cm²)SS = ”xref” > 33^,34,35,36 och råtta (100-300 Ω cm²)^37,38. TEER har emellertid visat beroende på förfarandena som rening och kultur. I de flesta fall visar tillägg av ACM eller samtidig kultur med astrocyter särskiljande effekter på endotelceller och en ökning i täthet av endotel lager¹. Dock med insatser för att optimera de culturing villkor, endast de nötkreatur-baserade modellerna har visat TEER värden jämförbara till svin-baserade modeller (genomsnitt av 800 Ω cm² i MC, upp till 2500 Ω cm² i Astrocyten samtidig kultur)^{13 ,39,40,41,42,43,44,45}. Som modeller baserat på primära nötkreatur hjärnan har endotelceller visat stora variationer, både mellan och inom laboratorier^{14,45,46,47,48}, reproducerbarhet kan vara ett problem. I den pBEC modellen redovisas här, har de bidragande laboratorierna uppnått mycket liknande TEER och paracellular permeabilitet värden med låg variabilitet, både i och mellan laboratorier. Därför bör det vara möjligt för andra laboratorier för att upprätta en robust modell med låg variabilitet med metoden presenteras här. Förutom att bilda snäva endotelceller lager, har modeller med pBECs tidigare validerats av uttryck av åtsittande föreningspunkt proteiner, funktionella BBB transportörer, receptorer och enzymer och visat lämplighet för en rad studier^{15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59}. Dessutom opublicerade transkriptom data på samtidig kulturerna av pBECs visar en förväntad profil av BBB transportörer och receptorer (opublicerade resultat, Nielsen et al.).

Svin-baserade BBB modellen har ytterligare en fördel som genomet, anatomi, fysiologi och sjukdomsprogression av gris återspeglar den mänskliga biologin i högre grad än andra etablerade modeller⁶⁰, som är gynnsamma funktioner för den läkemedelsindustrin. Som svin hjärnor är en gemensam biprodukt från köttindustrin, utgör de en lättillgänglig källa av hjärnan endotelceller, vilket minimerar antalet djur behövs för experiment, och ger en hög rening avkastning från en svin hjärna. Även om rening och odling av primära celler är något tidsödande och kräver sakkunskap för standardisering i inställningen upp modellen, generera primärceller de mest tillförlitliga BBB-modellerna. Förevigade cellinjer kan inte vara ett substitut, som viktiga egenskaper såsom barriär täthet, transportören uttrycket profiler och mikromiljö förordning inte återspeglar den experimentella fynd i vivo^{61, 62}. in vitro -modeller ger fördelen med live-cell imaging med högre upplösning, möjliggör visualisering av intracellulära processer genom att låta ett nära förhållningssätt till urvalet eller observerade cellerna, med mål med högre förstoring och bättre optisk kvalitet⁶³. Detta är inte fallet för användning av 2-foton mikroskopi i levande djur. In vitro- modeller ger dessutom möjlighet att transfect celler, möjliggör visualisering av märkta proteiner och utredning av deras handel.

Tillämpningar av modellen

Funktionen av BBB inte är fast och kan anpassas dynamiskt både fysiologi och patologi. I många neurologiska sjukdomar, inklusive neurodegenerativa, observeras inflammatoriska och infektiösa sjukdomar, störningar och ökad permeabilitet i BBB^64,65,66,67 . För att minska och förebygga sjukdomsutveckling och efterföljande skador, är identifiering och karakterisering av de molekylära mekanismerna bakom moduleringen av BBB av stor betydelse. I detta sammanhang tillförlitlig in vitro- modeller är i hög efterfrågan av läkemedelsindustrin, och dessutom spela en viktig roll i att förutsäga BBB permeabilitet av läkemedel till CNS. Alla in vitro- modell som fungerar som en permeabilitet skärm ska visa en restriktiv paracellular väg, ett fysiologiskt realistiska cell arkitektur och funktionella uttryck för transportören mekanismer⁶⁸. Visat i tidigare studier^16,17,57, och av paracellular permeabilitet och uttrycket av TJ och AJ proteiner här, den presenterade modellen uppfyller alla dessa kriterier och är lämplig för en rad av BBB studier av både normal fysiologi och patologi. Styrkan i den presenterade metoden för rening och odling omfattar en kombination av enkelhet och reproducerbarhet och förmågan att inbegripa astrocytic inflytande med en resulterande robust och tillförlitlig hög TEER i vitro BBB modell. För detta ändamål, astrocyter av svin och råtta ursprung har visat sig öka BBB fenotypen av pBECs i ett liknande sätt²².

Protocol

svin hjärnor var erhålls som biprodukter av danska livsmedelsindustrin. Danska slakterier är under strikt övervakning och observation av det danska ministeriet för miljö och god mat. råttor används för isolering av astrocyter var uppfödd och grupp-inrymt i lokala djuranläggningen vid en omgivande temperatur 22 ° C – 23 ° c och på en 12/12 h mörk/ljus cykel under kontroll av veterinär och enligt danska regler för försöksdjur. Råttorna var avlivas innan de offrades i enligh…

Representative Results

Etablering av BBB In Vitro modeller I metoden presenteras, optimerad genomfördes odling av pBECs och upprättandet av högpermeabla membran infoga systemet med MC eller utan ACM eller NCC med astrocyter (figur 1) för 9-11 dagar (figur 2). För urval av endotelceller, en inledande kultur av renat kapillär fragment kombinerades med puromycin behandling för högs…

Discussion

Rening och spridning av pBEC

Under förfarandet för rening inkluderar kritiska steg snabbt och effektivt avlägsnande av hjärnhinnorna och separation av vita och grå materia, vilket är viktigt för rening avkastning och renhet och för korrekt fastställande av modellen. För presenteras i vitro BBB modellen med pBECs, har vi förbättras och förenklas en rening förfarande baserat på mekanisk homogenisering av isolerade grå hjärnsubstans, selektivt filtrering för isolering av m…

Materials

Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Plasma derived serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Collagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Made with Elga System
T75 flasks	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)	Costar	CLS3401	12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes	Cellstar	188271
50 ml centrifuge tubes	Cellstar	227261
Petri dishes	Thermo Scientific	150350
Cryo vials	Thermo Scientific	377224
500 ml bottle	Thermo Scientific	159910/159920
Scalpels	Swann-Morten	REF0211	Type 24
Tissue homogenizer	Sigma	D9188
140 μm filters	MERCK	NY4H04700
40 μm filters	Corning	431750
EndOhm chamber system	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle	Sigma		Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps	KLS Martin	12-409-12-07
Broad tip forceps	VWR	82027-390
Filter holder	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml syringe	Braun	4617509F
10 ml syringe	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin antibody	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin antibody	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 antibody	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Sucrose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 µg/ml final working conc