O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato – encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.
O objectivo do presente protocolo apresenta um procedimento otimizado para purificação e cultivo de pBECs e para estabelecer em vitro barreira hemato – encefálica (BBB) modelos baseados em pBECs em mono-cultura (MC), MC com astrocyte-condicionado médio (ACM), e sem contato co-cultura (NCC) com astrócitos de suínos ou rato origem. pBECs foram isoladas e cultivadas de fragmentos de capilares dos córtices cerebral de suínos domésticos 5-6 meses de idade. Esses fragmentos foram purificados por remoção cuidadosa de meninges, isolamento e homogeneização da massa cinzenta, filtração, centrifugação e digestão enzimática. Para eliminar mais células contaminantes, os fragmentos capilares foram cultivados com puromicina contendo médio. Quando 60-95% de confluencia, pBECs crescente dos fragmentos capilares foram passadas para filtro de membrana permeável insere e estabelecidos nos modelos. Para aumentar a tensão de barreira e fenótipo característico de BBB de pBECs, as células foram tratadas com os seguintes factores de diferenciação: permeant 8-CPT-acampamento da membrana (acampamento abreviado aqui), hidrocortisona e um inibidor da fosfodiesterase, 1724-RO-20 (RO). O procedimento foi realizado durante um período de 9 a 11 dias, e ao estabelecer o modelo do NCC, os astrócitos foram cultivados 2-8 semanas de antecedência. Aderência aos procedimentos descritos no protocolo permitiu a criação de camadas endoteliais com permeabilidade restrita paracellular, com o NCC modelo mostrando uma resistência elétrica média transendothelial (TEER) de 1249 ± 80 cm Ω 2e paracellular permeabilidade (P.app) para Lúcifer amarelo de 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm s-1 (quer dizer SEM ±, n = 55). Nova avaliação deste fenótipo pBEC mostrou boa expressão da proteínas juncionais apertado claudin 5, ZO-1, occludin e adherens junção catenina p120 de proteína. O modelo apresentado pode ser usado para uma variedade de estudos do BBB na saúde e na doença, e, com a permeabilidade de paracellular altamente restritiva, este modelo é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular.
A estrutura celular e função da barreira sangue – cérebro
Na interface do sistema nervoso central e circulatório (CNS), o BBB atua como um site chave reguladora para controle homeostáticos do microambiente do CNS, que é essencial para o bom funcionamento e proteção do sistema nervoso. O site do BBB é as células endoteliais que revestem o lúmen do vaso sanguíneo. Nos capilares do cérebro, as células endoteliais formam complexas intercelulares junções apertadas e testes padrões da expressão fortemente polarizada de transportadores de influxo e efluxo particulares assegurar transporte molecular altamente específica entre o sangue e o cérebro 1. Os componentes estruturais dos complexos junção apertada incluem proteínas da família occludin e claudin, zonula occludens (ZO) proteínas, cingulin e associado a moléculas de adesão (compotas). Claudin 5 é particularmente importante na restrição paracellular juncional. Indução e manutenção deste fenótipo endotelial do BBB característico envolvem interações dinâmicas com células circundantes, incluindo pericitos, astrócitos, neurônios e as membranas do porão, que, juntamente com o cérebro endotelial, células de forma a neurovascular unidade (NVU)2,3. Os mecanismos envolvidos nessas interações não são compreendidos ainda inteiramente, mas incluem a troca de sinais químicos entre as células, que permite a modulação da permeabilidade do BBB a curto prazo e induz a longo prazo BBB características4. Astrócitos, especialmente, são conhecidos por contribuir para o fenótipo de células endoteliais do cérebro e são uma fonte de fatores regulatórios como gliais-derivado neurotrophic factor (afetando cAMP intracelular)5, de fator de crescimento fibroblástico básico6, Hidrocortisona7e transformadora fator de crescimento β (TGF-β)8. O efeito de TGF-β, no entanto, tem sido debatida9.
In Vivo em Vitro BBB
Estudos in vivo continuam a fornecer informações valiosas sobre a biologia do BBB. No entanto, modelos de cultura celular podem fornecer insights adicionais e constituem ferramentas úteis para a compreensão de aspectos moleculares e funcionais detalhados do BBB na saúde e na doença. Embora as interações complexas entre os tipos de células e constituintes do BBB são difíceis de alcançar plenamente em modelos em vitro , tem havido, desde a primeira purificação de células endoteliais do cérebro e aplicação destes em mono-culturas 10 , 11 , 12, o desenvolvimento extensivo dos processos de purificação e condições de crescimento do BBB celulares modelos de cultura, resultando em maior semelhança com a barreira na vivo . Os modelos usados em vitro BBB baseiam-se em células primárias de roedor, suínos e bovina de origem e em linhas celulares imortalizado. Cada modelo tem diferentes vantagens e desvantagens. Para a escolha do modelo e comparação, marcadores de validação como expressão de enzimas, transportadores, receptores e proteínas estruturais BBB são usados para criar visões gerais do atual estabelecido modelos1.
O protocolo
Uma característica importante do BBB é tensão de barreira e TEER alta, ainda um grande número de modelos disponíveis não refletem bem os níveis na vivo . Incorporando contribuições de desenvolvimento e otimização de vários laboratórios, o objectivo do presente protocolo é apresentar um método para estabelecer um alta TEER em vitro BBB modelo baseado na pBECs primária no MC com ou sem ACM, ou no NCC com primário astrócitos de ratos ou de origem porcina. Os procedimentos aplicados e o estabelecimento do modelo incluem esforços para eliminar as células contaminantes e melhorar a diferenciação de pBECs em um fenótipo BBB. Este trabalho resultou na criação de modelos TEER confiáveis e de alta com paracellular baixa permeabilidade e boa expressão funcional de proteínas juncionais apertadas chaves, transportadores e receptores. No entanto, como os astrócitos são um fator contribuinte para o fenótipo de células endoteliais do cérebro, as três condições diferentes da cultura representam três diferentes fenótipos das células endoteliais do cérebro. O modelo NCC é especificamente útil para estudos de determinados mecanismos especializados envolvidos na descoberta de medicamentos, estudos de transporte e o tráfico intracelular, bem como para a investigação das interações célula-célula, onde é a máxima expressão de características BBB vantajoso.
Origem e história do protocolo
O modelo de pBEC descrito aqui baseia-se em grande parte no modelo porcino desenvolvido nos laboratórios Eisai (Londres) por Dr. Louise Morgan e seus colegas, que é baseado em um sucesso anterior cérebro bovino endothelial da pilha modelo13. O método original de preparação da pilha foi um dois-fase de filtragem usando nylon malhas para pegar o microvessels, seguido por uma etapa de subculturing para melhorar a pureza. No desenvolvimento do método anterior, tensão do fenótipo e barreira BBB ideal foram atingidos pelo crescimento médio e completados, incluindo ACM. Modificações adicionais para o método foram feitas por R. Skinner no laboratório do Prof N. Rothwell em Manchester UK14,15. O método foi adotado pelo laboratório Abbott, KCL de Londres, onde Patabendige fez significativamente mais simples de preparar, evitando o uso de astrócitos ou ACM e eliminando células contaminantes como pericitos com puromicina. Os primeiros artigos confirmou que o modelo MC preservadas várias características importantes do na vivo BBB, incluindo junções apertadas eficazes, sistemas de transporte de membrana e mediada transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. mais tarde S. Yusof novamente testado co-cultura astrocyte e melhorou significativamente TEER, então esta é a variante preferencial usado atualmente na Abbott laboratório21. O modelo agora tem sido com sucesso transferido para o M. Nielsen laboratório em Aarhus, onde novas modificações foram introduzidas (este protocolo), incluindo simplificadora cinza importa extração, usando malha apenas uma etapa de filtração e uma etapa de revestimento de filtro único combinação de colágeno e fibronectina. O procedimento aplicado para isolamento de suínos astrócitos (este protocolo) foi baseado em protocolos desenvolvidos pelo laboratório T. Moos em Aalborg, descrito por Thomsen et al.22. A TEER e outras propriedades do modelo gerado em Londres e Aarhus são semelhantes, que empresta a confiança para a noção de que o modelo é facilmente transferido entre laboratórios e responde bem a observação cuidadosa e racionalização das etapas do método. Com efeito, S. Yusof criou o modelo MC em um país tropical (Malásia)23, que envolveu a nova adaptação para as condições locais e fontes de tecido.
Vantagens sobre métodos alternativos e atualmente estabeleceram modelos
Em comparação com células endoteliais do cérebro de origem bovina e roedor, pBECs oferecem a vantagem de ter uma menor taxa de perda do fenótipo BBB na vivo após isolamento24. Além disso, os pBECs são capazes de formar barreiras endoteliais relativamente apertadas, mesmo quando cultivadas em MC (Ω 800 cm2)16 , em comparação com os níveis comumente relatados por monocamadas de linhas celulares, tais como bEND.5 e bEND.3 (50 Ω cm2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30e cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32e cerebrais primários células endoteliais de rato (100-300 Ω cm2)SS = “xref” > 33,34,35,36 e rato (100-300 Ω cm2)37,38. No entanto, a TEER demonstrou dependência sobre os procedimentos de purificação e de cultura. Na maioria dos casos, a adição de ACM ou co-cultura com astrócitos mostra diferenciação efeitos sobre as células endoteliais e um aumento na tensão das camadas endoteliais1. No entanto, com os esforços para otimizar as condições de cultivo, apenas os modelos baseados em bovinos mostraram valores TEER comparável aos modelos baseados em suínos (médias de 800 Ω cm2 no MC, até 2500 Ω cm2 em co-cultura astrocyte)13 ,39,40,41,42,,43,44,45. Como os modelos baseados no cérebro bovino primário, células endoteliais mostraram grandes variações, tanto entre como dentro de laboratórios14,,45,46,,47,48, reprodutibilidade pode ser um problema. No modelo de pBEC relatado aqui, os laboratórios contribuindo alcançaram TEER muito semelhante e valores de permeabilidade paracellular com baixa variabilidade, tanto em e entre laboratórios. Daí, é possível que outros laboratórios estabelecer um modelo robusto com baixa variabilidade, usando o método apresentado aqui. Além de formar camadas endoteliais apertadas, modelos com pBECs anteriormente foram validados pela expressão de proteínas de junção apertada, transportadores BBB funcionais, receptores e enzimas e aptidão demonstrada para uma gama de estudos15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Além disso, dados de transcriptoma inéditos sobre as culturas co de pBECs mostram um perfil esperado do BBB transportadores e receptores (resultados não publicados, Nielsen et al).
O modelo baseado em suínos de BBB tem uma vantagem adicional como o genoma, anatomia, fisiologia, e progressão da doença do porco refletem a biologia humana para um grau mais elevado do que outros modelos estabelecidos dispõe de60, que são favoráveis para o indústria farmacêutica. Como cérebros de suínos são um subproduto comum da indústria da carne, eles constituem uma fonte facilmente acessível de cérebro células endoteliais, minimizando o número de animais necessários para as experiências e fornecendo um rendimento elevado da purificação de um cérebro de suínos. Apesar de purificação e cultivo de células primárias é um pouco demorados e exige conhecimentos especializados de normalização na criação do modelo, as células primárias gerar os modelos BBB mais confiáveis. Linha celular imortalizado não pode ser um substituto, como propriedades importantes, tais como tensão de barreira, perfis de expressão do transportador e regulamento do microambiente não refletem os resultados experimentais na vivo61, 62. em vitro modelos oferecem a vantagem de viver-pilha de imagens com maior resolução, possibilitando a visualização de processos intracelulares, permitindo uma abordagem de proximidade para as células da amostra ou observadas, com objectivos com ampliação maior e melhor qualidade óptica63. Isto não é o caso para o uso da microscopia de dois fotões em animais vivos. Além disso, em vitro modelos fornecem a capacidade de transfect células, permitindo a visualização de proteínas etiquetadas e investigação do seu tráfico.
Aplicações do modelo
A função do BBB não é fixo e pode ser modulada dinamicamente na fisiologia e patologia. Em muitas doenças neurológicas, incluindo neurodegenerativas, doenças inflamatórias e infecciosas, interrupções e aumento da permeabilidade do BBB é observado64,,65,66,67 . Para reduzir e prevenir a progressão da doença e danos subsequentes, identificação e caracterização dos mecanismos moleculares subjacentes à modulação do BBB são de grande importância. Neste contexto, confiável em vitro modelos estão em alta demanda pela indústria farmacêutica, em Além disso desempenham papéis importantes na previsão de permeabilidade BBB de drogas ao SNC. Qualquer modelo in vitro , servindo como uma tela de permeabilidade deve exibir um caminho paracellular restritiva, uma arquitetura cell fisiologicamente realistas e expressão funcional de mecanismos de transporte68. Demonstrado em estudos anteriores16,17,57e por paracellular permeabilidade e expressão de proteínas TJ e AJ aqui, o modelo apresentado atende a todos esses critérios e é adequado para uma variedade de BBB estudos em ambos fisiologia normal e em patologia. Os pontos fortes do método de purificação e cultivo apresentado incluem uma combinação de simplicidade e reprodutibilidade e a capacidade de incluir hamartomas influenciaram com um robusto e fiável alta TEER em vitro BBB modelo resultante. Para esta finalidade, astrócitos de suínos e rato origem têm sido mostrados para aumentar o fenótipo BBB de pBECs em um similar de maneira22.
Purificação e proliferação de pBEC
Durante o processo de purificação, passos críticos incluem remoção rápida e eficaz das meninges e separação da matéria branca e cinza, que é importante para o rendimento de purificação e a pureza e para o estabelecimento adequado do modelo. Para o apresentado em vitro BBB modelo usando pBECs, nós temos melhorado e simplificado de um processo de purificação, com base na homogeneização mecânica de matéria cinzenta isolada, tamanho-s…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostaria de reconhecer Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen e Niels M. Kristiansen para assistência técnica, e a Fundação Lundbeck conceder número 14113-R155-2013.
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
DMEM/F-12 | Lonza | BE12-719F | |
DMEM/Low Glucose | Sigma-Aldrich | D6046 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco Invitrogen | 15140 | |
Plasma derived serum (PDS) | First Link UK Ltd. | 60-00-89 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10-270-106 | |
Trypsin/EDTA | Gibco Invitrogen | 15090-046 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
8-CPT-cAMP | Biolog | C010 | |
RO 20-1724 | Sigma-Aldrich | B8279 | |
Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 34896 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
EtOH | VWR | 20,824,296 | Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Collagenase CLS2 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
ddH2O | Made with Elga System | ||
T75 flasks | Thermo Scientific | 156499 | |
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) | Costar | CLS3401 | 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane |
15 ml centrifuge tubes | Cellstar | 188271 | |
50 ml centrifuge tubes | Cellstar | 227261 | |
Petri dishes | Thermo Scientific | 150350 | |
Cryo vials | Thermo Scientific | 377224 | |
500 ml bottle | Thermo Scientific | 159910/159920 | |
Scalpels | Swann-Morten | REF0211 | Type 24 |
Tissue homogenizer | Sigma | D9188 | |
140 μm filters | MERCK | NY4H04700 | |
40 μm filters | Corning | 431750 | |
EndOhm chamber system | World Precision Instruments | ENDOHM-12 | EndOhm chamber for 12mm Culture Cups |
EVOM2 electrode system | World Precision Instruments | 300523+STX100C | TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair |
Long needle | Sigma | Attach to a syringe | |
Fine-tip curved forceps | KLS Martin | 12-409-12-07 | |
Broad tip forceps | VWR | 82027-390 | |
Filter holder | MERCK Milipore | Swinnex-47 | |
50 ml syringe | Braun | 4617509F | |
10 ml syringe | Terumo | SSt20ESI | |
Anti-Occludin antibody | Abcam | ab31721 | 1:100 |
Anti-p120 Catenin antibody | BD Transduction laboratories | 610133 | 1:200 |
Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 61-7300 | 1:200 |
Anti-Claudin 5 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4502981 | 1:100 |
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 | Thermo Scientific | A10042 | 1:500 |
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 | Thermo Scientific | A21202 | 1:500 |
Sucrose | Perkin Elmer | NEC100X250UC | 0.15µl/ml final working conc |
Lucifer Yellow | Sigma | L0144 | 10 µg/ml final working conc |