프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.
이 프로토콜의 목적은 정화와 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델 체 외에 모노 문화 (MC), 사이토 조절 매체 (ACM), MC에에서 pBECs에 기반을 확립 하 고 pBECs의 재배에 대 한 최적화 절차를 제시 하 고 비 접촉 공동 문화 (NCC)의 돼지 이다 또는 쥐 근원. pBECs 절연 되었고 국내 돼지 5-6 개월의 뇌 외피가에서 모세 혈관의 조각에서 경작. 이 파편 meninges, 격리 및 회색 문제, 여과, 소화 효소, 그리고 원심 분리의 균질의 주의 제거에 의해 순화 되었다. 더 오염 세포 제거, 모 세관 조각 puromycin 포함와 경작 했다 매체. 60-95% 합칠, 모 세관 조각에서 성장 하는 pBECs를 passaged 했다 때 투과 할 멤브레인 필터 삽입 하 고 모델에 설립. 장벽 압박감 및 BBB 특성 표현 형 pBECs의 증가, 셀 다음 차별화 요인으로 취급 했다: 막 permeant 8-CPT-캠프 (여기 약식된 캠프), 하이드로 코 티 손, 그리고 포스 억제제, RO-20-1724 (RO)입니다. 절차 9 월 11 일의 기간 동안 실시 됐다 그리고 NCC 모델을 설정할 때는 이다 2-8 주 사전에 교양 있었다. 프로토콜에서 설명 된 절차를 준수 제한이 paracellular 침투성와 내 피 층의 설립을 허용 했다, NCC 1249 ± 80 Ω cm 는 평균 transendothelial 전기 저항 (TEER)를 보여주는 모델 2, 그리고 paracellular 침투성 (Papp) 루시퍼 노란색 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 초-1 의 대 한 (± sem의 의미 n = 55). PBEC 표현 형이 더 평가 했다 5, 긴밀 접합 단백질 claudin의 좋은 표현 조-1, occludin 및 외화 접합 단백질 p120 catenin. 건강 및 질병에 BBB의 연구의 범위에 대 한 제시 하는 모델을 사용할 수 있습니다 그리고, 매우 제한적인 paracellular 침투성이이 모델은 전송 및 세포내 매매의 연구에 적합.
세포의 구조와 기능 혈액-뇌 장벽에의
순환 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 인터페이스에서 BBB 역할 CNS microenvironment의 homoeostatic 컨트롤에 대 한 주요 규제 사이트는 적절 한 기능과 신경 시스템의 보호를 위해 필수적 이다. BBB 사이트는 혈관 루멘을 일렬로 세우는 내 피 세포. 뇌 모세 혈관, 내 피 세포는 복잡 한 세포 꽉 접합 형성 하 고 특정 유입 및 경과 전송기의 강하게 편광된 식 패턴은 혈액과 뇌 1사이 높은 특정 분자 전송 보장. 단단한 접속점 복합물의 구조 구성 요소는 occludin 및 claudin, zonula occludens (ZO) 단백질, cingulin에서 단백질을 포함 하 고 접합 접착 분자 (잼) 관련. Claudin 5 paracellular 접합 제한에서 특히 중요 하다. Pericytes, 이다, 신경 및 뇌 내 피 함께 세포 형태는 지하실 막를 포함 하 여 주변 셀와 동적 상호 작용을 포함 하는 유도 및이 특성 BBB 내 피 형의 유지 보수는 혈관 단위 (NVU)2,3. 이러한 상호 작용에 관여 하는 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 짧은 기간에 BBB 침투성의 변조를 허용 하 고 장기 BBB 기능4유도 세포 사이의 화학 신호 교환 포함. 이다 특히 뇌 내 피 세포 표현 형을 위해 알려져 있으며 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (영향을 미치는 세포내 캠프)5,6기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 등 규제 요인의 원천 날린7, 그리고 변형 성장 인자 (TGF-β) β8. 그러나 TGF-β의 효과, 토론된9되었습니다.
생체 내에서 생체 외에서 BBB에서
Vivo에서 학문 계속 BBB 생물학에 유용한 정보를 제공 합니다. 그러나, 셀 문화 모델 추가적인 통찰력을 제공 하 고 건강 및 질병에 BBB의 상세한 분자와 기능적인 측면을 이해 하는 데 유용한 도구를 구성할 수 있습니다. 세포 유형 및 BBB의 성분 사이 복잡 한 상호 작용 생체 외에서 모델에 완벽 하 게 달성 하기 어려운 있지만, 거기는 이후, 뇌 내 피 세포의 첫 번째 정화 및 모노 문화에서 이러한 응용 프로그램 10 , 11 , 12, BBB의 성장 조건과 정화 절차의 광범위 한 개발 문화 모델, vivo에서 방 벽을 더 닮 았의 결과 세포. 일반적으로 사용 되 체 외에 BBB 모델은 기초를, 돼지, 설치류 및 소 출신의 1 차 셀에 불멸 하 게 세포에. 각 모델은 서로 다른 장점과 단점이 있다. 비교 및 모델 선택에 대 한 유효성 검사 마커 BBB 효소, 운송업 자, 수용 체, 그리고 구조 단백질의 표현 등은 현재 설립된 모델1의 개요를 만드는 데 사용 됩니다.
프로토콜의 목표
BBB의 중요 한 기능 중 하나는 배리어 견고 하 고 높은 TEER 아직 사용 가능한 모델의 많은 수를 반영 하지 않습니다 잘 비보에 수준. 이 프로토콜의 목표 BBB 모델 체 외에서 높은 TEER 기본과 기본 pBECs MC 또는 ACM, 없이 또는 NCC에 기반을 구축 하는 방법을 제시 하는 여러 실험실에서 개발 및 최적화 기여를 통합, 쥐 또는 돼지 근원의 이다입니다. 적용된 절차와 모델의 설립 포함 오염 세포를 제거 하 고 BBB 표현 형으로 pBECs의 차별화를 개선 하기 위해 노력 합니다. 이 작품은 낮은 paracellular 침투성 및 주요 꽉 접합, 전송기, 단백질과 수용 체의 기능 표현의 좋은 안정적이 고 높은 TEER 모델의 설립에 결과 있다. 그러나,는 이다 뇌 내 피 세포 표현 형을 기여 하는 요소는, 문화의 세 가지 다른 조건 뇌 내 피 세포의 3 개의 다른 고기를 나타냅니다. NCC 모델은 최대한 표현의 BBB 특징은 약물 발견, 전송 및 세포내 매매에 관련 된 특정 전문된 메커니즘의 연구 뿐만 아니라 세포 세포 상호 작용의 조사를 위해 특히 유용 유리.
기원과 프로토콜의 역사
여기에 설명 된 pBEC 모델은 기반 사이 실험실 (런던)에서 개발 된 돼지 모델 닥터 루이스 모건과 동료, whichis는 성공적인 이전 소 뇌 내 피 세포 모델13을 기반으로 합니다. 셀 준비의 원래 방법이 이었다 나일론을 사용 하 여 2 단계 여과 순도 개선 하기 위해 subculturing 단계 뒤 microvessels를 잡으려고 메시. 메서드의 이전 개발에 최적의 BBB 표현 형 및 압박감 ACM을 포함 하 여 보충된 매체에 성장에 의해 달성 했다. 메서드에 추가 수정 R. 스키 너에 의해 맨체스터 영국14,15명. 로스웰 교수 실험실에서 만들어졌다. 메서드는 Abbott 실험실, KCL 런던, Patabendige 크게 이다 또는 ACM의 사용을 피 함으로써 그리고 puromycin와 pericytes와 같은 오염 셀을 제거 하 여 준비를 간단 하 게 했다 그것은 의해 채택 되었다. 첫 번째 서류 MC 모델은 vivo에서 BBB, 효과적인 단단한 접속점, 수용 체-중재 transcytosis16,17 , 막 교통 시스템 등의 여러 가지 중요 한 기능을 유지 확인 , 18 , 19 , 20. 미 Yusof 나중 다시 사이토 공동 문화를 시험 하 고 그것은 크게 향상 된 TEER, 그래서 이것이 기본 variant 애 보트 연구소21에서 현재 사용 발견. 모델 지금은 성공적으로 되었습니다 M. 닐슨 전송 오르후스, 추가 수정 되었습니다 연구소 소개 (이 프로토콜), 단순화 그레이 포함 하 여 중요 한 메쉬 여과 단계와 단일 필터 코팅 단계를 사용 하 여 추출 콜라겐과 fibronectin 결합. 돼지 이다 (이 프로토콜)의 절연을 위한 적용된 절차는 센 외22에 의해 설명 된 알 보 그에서 토니 무스 연구소에 의해 개발 된 프로토콜에 근거 했다. 아후 스에서 생성 된 모델의 다른 속성과 TEER 비슷합니다는 자신감 개념 모델과 실험실 사이 전송 쉽게 잘 주의 관찰 및 합리화 방법 단계에 응답을 하 신 다. 실제로, S. Yusof 이제는 열 대 국가 (말레이시아)23, 현지 조건 및 조직 소스에 대 한 추가 조정 관련 MC 모델을 설립 했다.
이점을 다른 방법 및 현재 설립 모델
소와 설치류의 뇌 내 피 세포에 비해, pBECs는 vivo에서 BBB 형 절연24다음의 손실의 낮은 속도의 이점을 제공 합니다. 또한, pBECs bEND.5 및 bEND.3 (50 Ω c m2) 같은 셀 라인의 monolayers에 대 한 일반적으로 보고 된 수준에 비해 MC (800 Ω cm2)16 에서 재배 하는 경우에 상대적으로 꽉 내 피 방 벽을 형성 할 수 있다 25 , 26 , 27, ㄷ (300-800 Ω c m2)28,,2930및 cerebEND (500 Ω c m2)29,,3132, 그리고 기본 뇌 마우스 (100-300 Ω c m2)의 내 피 세포ss = “외부 참조” > 33,,3435,36 및 쥐 (100-300 Ω c m2)37,38. 그러나,는 TEER 정화 및 문화 절차에 의존성을 보이고 있다. 대부분의 경우, ACM의 추가 또는 이다 공동 문화 내 피 레이어1의 견고에 증가 내 피 세포에 차별화 효과 보여줍니다. 그럼에도 불구 하 고, 자란 조건 최적화에 노력, 소 기반 모델 나타났습니다 TEER 값 돼지 기반 모델 (평균 800 Ω cm2 MC, 사이토 공동 문화에 2500 Ω c m2 )에 비해13 ,39,40,41,,4243,44,45. 모델 기본 소 뇌를 기반으로 내 피 세포 사이 및 실험실14,45,,4647,48, 내 큰 변화가 나타났습니다. 재현성에 문제가 있을 수 있습니다. 여기 보고 pBEC 모델에서 기여 실험실 낮은 가변성, 실험실 사이 매우 비슷한 TEER 그리고 paracellular 침투성 값 달성 했다. 따라서, 그것은 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여 낮은 변화 강력한 모델 확립에 다른 실험실에 대 한 가능 해야 합니다. 단단한 내 피 층을 형성, 뿐만 아니라 pBECs 모델 이전 검증 된 꽉 접합, 기능적인 BBB 전송기, 수용 체와 효소, 단백질과 연구15 의 범위에 대 한 시연된 적합성의 식에 의해 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. 또한, pBECs의 공동 문화에 게시 되지 않은 transcriptome 데이터 BBB 전송기와 수용 체 (미 발표 결과, 닐슨 그 외 여러분)의 예상된 프로필을 보여줍니다.
BBB 돼지-기반 모델에는 게놈, 해부학, 생리학, 더 이점이 있다 그리고 돼지의 질병 진행 반영 인간의 생물학60을 유리한는 기능에 대 한 다른 기존된 모델 보다 더 높은 학위에는 제약 산업입니다. 돼지 머리 고기 업계의 일반적인 부산물 이기 때문에, 그들은 두뇌의 쉽게 접근할 수 있는 소스는 실험에 필요한 한 돼지의 뇌에서 높은 정화 수확량을 제공 하는 동물의 수를 최소화 하는 내 피 세포 구성. 정화 및 1 차 셀의 다소 시간이 소요 되 고 표준화 모델 설정에 대 한 전문 지식이 필요로, 1 차 셀 가장 신뢰할 수 있는 BBB 모델을 생성 합니다. 불멸 하 게 셀 라인 수 없습니다 대신, 중요 한 속성으로 같은 수 장벽 압박감, 전송 식 프로필, 및 microenvironment 규칙 vivo에서실험 결과61, 를 반영 하지 않습니다. 62. 생체 외에서 모델 라이브 셀 높은 해상도 이미징, 목표를 사용 하 여 샘플링 또는 관찰 된 셀에 대 한 근접 접근 함으로써 세포내 프로세스의 시각화를 가능 하 게의 이점을 제공 높은 확대와 더 나은 광학 품질63. 이건 살아있는 동물에서 2 광자 현미경의 사용에 대 한 경우입니다. 또한, 생체 외에서 모델 transfect 세포, 태그 단백질의 시각화와 그들의 매매의 조사 하는 기능을 제공 합니다.
모델의 응용 프로그램
BBB의 기능 고정 되지 않습니다 하 고 동적으로 생리학과 병 리에 변조 될 수 있습니다. 신경를 포함 하 여 많은 신경 질환, 염증 성 및 전염 성 질병, 장애 및 BBB의 증가 된 침투성은 관찰64,,6566,67 . 감소 하 고 질병의 진행 및 후속 피해 방지, 식별 및 BBB의 변조를 기본 분자 메커니즘의 중요 한 중요성의 있습니다. 이러한 맥락에서 신뢰할 수 있는 생체 외에서 모델 높은 수요 제약 산업에에서 있는 고 BBB 침투성 CNS 약물의 예측에 중요 한 역할 게다가. 어떤 체 외 모델 침투성 화면으로 제한적인 paracellular 통로, 순수 현실 셀 건축과 기능 표현의 전송 메커니즘68표시 되어야 합니다. 이전 연구16,17,의57, 그리고 paracellular 침투성 및 여기 TJ 고에 단백질의 표정에 의해 입증, 제시 모델 이러한 모든 조건을 충족 하며 적합 BBB의 범위 두 정상 생리에서 및 병리학에서 연구입니다. 제시 정화 및 재배 방법의 강점 단순의 조합을 포함 하 고 재현성 및 astrocytic를 포함 하는 기능 결과 강력 하 고 신뢰할 수 있는 높은 TEER 생체 외에서 BBB 모델 영향. 이 대 한 목적, 돼지의 이다 고 쥐 원점 비슷한 방식으로22에 pBECs의 BBB 표현 형을 증가 시키기 위해 표시 되었습니다.
정화와 pBEC의 확산
정화 절차 동안에 중요 한 단계는 meninges의 신속 하 고 효과적인 제거 및 정화 수율 및 순도 대 한 모델의 적절 한 설립에 대 한 중요 하다 흰색과 회색 물질의 분리를 포함 합니다. 모델에 대 한 제시 생체 외에서 BBB pBECs를 사용 하 여, 우리 향상 있고 고립 된 회색 물질, 크기-선택적 microvessels, 콜라와 소화의 격리에 대 한 필터링의 기계적 균질에 따라 정…
The authors have nothing to disclose.
저자 엘리자베스 헬레나 Bruun, 사라 크리스틴 크리스텐슨, 기술 지원, 닐스 M. Kristiansen를 인정 하 고 Lundbeck 재단 번호 R155-2013-14113를 부여.
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
DMEM/F-12 | Lonza | BE12-719F | |
DMEM/Low Glucose | Sigma-Aldrich | D6046 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco Invitrogen | 15140 | |
Plasma derived serum (PDS) | First Link UK Ltd. | 60-00-89 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10-270-106 | |
Trypsin/EDTA | Gibco Invitrogen | 15090-046 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
8-CPT-cAMP | Biolog | C010 | |
RO 20-1724 | Sigma-Aldrich | B8279 | |
Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 34896 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
EtOH | VWR | 20,824,296 | Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Collagenase CLS2 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
ddH2O | Made with Elga System | ||
T75 flasks | Thermo Scientific | 156499 | |
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) | Costar | CLS3401 | 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane |
15 ml centrifuge tubes | Cellstar | 188271 | |
50 ml centrifuge tubes | Cellstar | 227261 | |
Petri dishes | Thermo Scientific | 150350 | |
Cryo vials | Thermo Scientific | 377224 | |
500 ml bottle | Thermo Scientific | 159910/159920 | |
Scalpels | Swann-Morten | REF0211 | Type 24 |
Tissue homogenizer | Sigma | D9188 | |
140 μm filters | MERCK | NY4H04700 | |
40 μm filters | Corning | 431750 | |
EndOhm chamber system | World Precision Instruments | ENDOHM-12 | EndOhm chamber for 12mm Culture Cups |
EVOM2 electrode system | World Precision Instruments | 300523+STX100C | TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair |
Long needle | Sigma | Attach to a syringe | |
Fine-tip curved forceps | KLS Martin | 12-409-12-07 | |
Broad tip forceps | VWR | 82027-390 | |
Filter holder | MERCK Milipore | Swinnex-47 | |
50 ml syringe | Braun | 4617509F | |
10 ml syringe | Terumo | SSt20ESI | |
Anti-Occludin antibody | Abcam | ab31721 | 1:100 |
Anti-p120 Catenin antibody | BD Transduction laboratories | 610133 | 1:200 |
Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 61-7300 | 1:200 |
Anti-Claudin 5 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4502981 | 1:100 |
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 | Thermo Scientific | A10042 | 1:500 |
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 | Thermo Scientific | A21202 | 1:500 |
Sucrose | Perkin Elmer | NEC100X250UC | 0.15µl/ml final working conc |
Lucifer Yellow | Sigma | L0144 | 10 µg/ml final working conc |