JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

Published: September 24, 2017
doi:
10.3791/56277
, , , , , , ,
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine,Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science,King’s College London, 3HICoE Centre for Drug Research,Universiti Sains Malaysia

Summary

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם – מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה מציג את הליך בלתי אופטימליים לטיהור ודה הטיפוח של pBECs ולהקים במבחנה מחסום הדם – מוח (BBB) מודלים בהתבסס על pBECs, מונו-תרבות (MC), MC ממוזגים אסטרוציט בינונית (ACM), ו תרבות משותפת (NCC) עם האסטרוציטים של חזירי ללא מגע או עכברוש מקור. pBECs היו מבודדים ותרבותית של שברי נימים מ cortices המוח של חזירים במשפחה בת 5-6 חודשים. קטעים אלה היו מטוהרת על-ידי הסרת זהיר של קרומי המוח, בידוד המגון של החומר האפור, סינון, עיכול אנזימטי צנטריפוגה. לחסל עוד תאים מזהמים, שברי נימי היו תרבותי עם puromycin המכילות בינוני. כאשר 60-95% confluent, pBECs גדל מן השברים נימי היו passaged את קרום חדיר המסנן מוסיף והקימו במודלים. כדי להגדיל את מחסום מהבלוטות ומניעת BBB פנוטיפ אופייני של pBECs, התאים שטופלו הגורמים בידול הבאים: ממברנה permeant 8-CPT-מחנה (מחנה מקוצר כאן), הידרוקורטיזון, מעכב phosphodiesterase, RO-20-1724 (RO). ההליך בוצע על פני תקופה של 9-11 ימים, בעת יצירת מודל NCC, האסטרוציטים היו תרבותי 2-8 שבועות מראש. ההקפדה ההליכים המתוארים בפרוטוקול אפשרה את הקמת שכבות אנדותל עם חדירות paracellular מוגבלת מאוד, עם NCC המודל מראה על ממוצע transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER) 1249 ± Ω 80 ס מ 2, ו paracellular חדירות (Papp) עבור לוציפר צהוב 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 ס מ סק-1 (זאת אומרת ± SEM, n = 55). הערכה נוספת של פנוטיפ pBEC הזה הראה ביטוי טוב claudin חזק חלבונים מהחיבור 5, זואי-1, occludin ו adherens של catenin p120 של צומת חלבון. המודל המוצג יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים של BBB על בריאות ומחלה, עם החדירות paracellular מאוד מגבילה, מודל זה מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת.

Introduction

המבנה התאי ותפקוד מחסום הדם – מוח

-הממשק של הדם ומרכזי מערכת העצבים (CNS), BBB משמש אתר רגולטורי המפתח לשליטה homoeostatic של microenvironment מערכת העצבים המרכזית, שהוא חיוני לתפקוד תקין והגנה של מערכת העצבים. האתר של BBB הוא התאים אנדותל המצפים לומן כלי דם. נימים המוח, תאי אנדותל ליצור מורכבות המערכת צמתי צר, ביטוי חזק מקוטב דפוסים של מובילי זרם, בזרימת מסוים להבטיח תחבורה מולקולרי ספציפי מאוד בין הדם של המוח 1. מרכיביה המבניים של מתחמי צמוד לצומת לכלול חלבונים מן המשפחה occludin, claudin, zonula occludens (זואי) חלבונים, cingulin, ומקושרת מולקולות אדהזיה מהחיבור (ריבות). Claudin 5 חשוב במיוחד ההגבלה מהחיבור paracellular. תחזוקה של פנוטיפ אנדותל האופיינית הזאת BBB לערב דינמי אינטראקציות עם התאים שמסביב, כולל pericytes, האסטרוציטים, נוירונים, את הקרומים המרתף, אשר יחד עם המוח אנדותל תאים טופס נוירו-וסקולריים יחידה (NVU)2,3. המנגנונים המעורבים אינטראקציות אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, אבל כוללים חילופי אותות כימיים בין תאים, אשר מאפשר אפנון של BBB חדירות בטווח הקצר ומשרה BBB לטווח ארוך כולל4. האסטרוציטים במיוחד ידועים לתרום ותפקיד תאי אנדותל המוח, הם מקור של גורמים רגולטוריים כגון פקטור (להשפיע על מחנה תאיים) גליה נגזר neurotrophic5, בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה6, הידרוקורטיזון7, הפיכת גורם הגדילה β (TGF-β)8. עם זאת, ההשפעה של TGF-β, כבר התווכחו9.

In Vivo במבחנה BBB

מחקרים in vivo להמשיך לספק מידע רב ערך על BBB ביולוגיה. עם זאת, מודלים התרבות התא יכול לספק תובנות נוספות ומהווים כלים שימושיים להבנת היבטים פונקציונליים המולקולריים מפורט של BBB על בריאות ומחלה. יחסי גומלין מורכבים סוגי תאים ומרכיבים של BBB אמנם קשה להשיג באופן מלא דגמים במבחנה , היה, מאז הטיהור הראשון של תאי אנדותל המוח ויישום של אלה בתרבויות-מונו 10 , 11 , 12, פיתוח נרחב של תהליכי טיהור, תנאי הגידול של BBB תא מודלים תרבות, וכתוצאה מכך דמיון גדול עד המחסום ויוו . הדגמים BBB נפוץ במבחנה מבוססים על ראשי תאים של מכרסמים, חזירי, ומקור שור ועל שורות תאים מונצח. כל דגם כולל החסרונות והיתרונות שונים. השוואה ומודל בחירה, סמני אימות כגון הביטוי של BBB אנזימים, שנאים, קולטנים חלבונים מבניים משמשות ליצירת סקירות ויצר מודלים הנוכחית1.

מטרת הפרוטוקול

תכונה חשובה אחת של BBB מכשול מהבלוטות ומניעת TEER גבוהה, אך מספר גדול של הדגמים זמינים ואינם משקפים היטב את רמות ויוו . שילוב תרומות פיתוח ואופטימיזציה של מספר מעבדות, המטרה של פרוטוקול זה היא להציג שיטה להקמת גבוהה TEER במבחנה BBB מודל המבוסס על pBECs ראשי MC עם או בלי ACM, או NCC עם ראשי האסטרוציטים של עכברוש או מקור חזירי. הליכים שהוחל והקמת המודל כוללות מאמצים לחסל תאים מזהמים וכדי לשפר את הבידול של pBECs לתוך הפנוטיפ BBB. עבודה זו הובילה להקמת מודלים TEER אמינים, עם חדירות נמוכה paracellular וביטוי פונקציונליים טוב של מפתח חלבונים מהחיבור חזק, שנאים, קולטנים. עם זאת, כפי האסטרוציטים גורם תורם פנוטיפ תא אנדותל המוח, שלושה מצבים שונים של תרבות מייצגים שלוש פנוטיפים שונים של תאי אנדותל המוח. מודל NCC שימושית במיוחד עבור מחקרים של מנגנונים מיוחדים מסוימים מעורב גילוי תרופות, מחקרים תחבורה וסחר תאיים, כמו גם עבור חקירת האינטראקציות תא-תא איפה ביטוי מכסימלי של BBB תכונות יתרון.

מקור והיסטוריה של הפרוטוקול

המודל pBEC המתוארים כאן מבוסס במידה רבה על המודל חזירי שפותחה במעבדות Eisai (לונדון) על ידי ד ר לואיס מורגן ועמיתיו, חישבת בהתבסס על מוצלחת קודמת המוח שור תא אנדותל דגם13. שיטת ההכנה התא המקורי היה רשתות שינוי סינון בשני שלבים באמצעות ניילון כדי לתפוס את microvessels, ואחריו צעד subculturing כדי לשפר את טוהר. בפיתוח קודמות של השיטה, אטימות פנוטיפ ומכשול BBB אופטימלית הושגו על ידי גידול בינוני שהושלם, כולל ACM. שינויים ותיקונים נוספים לשיטת נעשו על ידי ר’ סקינר במעבדה של פרופ ‘ / ח’ ש רותוול מנצ’סטר בבריטניה14,15. השיטה אומצה על ידי המעבדה אבוט, אשלגן כלורי לונדון, שם Patabendige עשה את זה משמעותי יותר פשוט להכין על ידי הימנעות משימוש האסטרוציטים או ACM בהריגת תאים מזהמים כמו pericytes עם puromycin. העיתונים הראשון אישר כי דגם MC נשמר כמה תכונות חשובות של ה- ויוו BBB, כולל צמתי צר יעיל, מערכות תחבורה ממברנה קולטן בתיווך transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. אח כ ס Yusof שוב נבדק תרבות משותפת אסטרוציט ונמצא זה לשפר באופן משמעותי TEER, אז זה הגרסה המועדפת כיום בשימוש המעבדה אבוט21. המודל כבר עכשיו בהצלחה להעביר את נילסן מ מעבדה בארהוס, איפה היו שינויים ותיקונים נוספים הציג (פרוטוקול זה), כולל גריי מפשט משנה החילוץ, באמצעות שלב סינון רשת אחת בלבד, וצעד ציפוי מסננים יחידה שילוב של קולגן, fibronectin. ההליך שימושית עבור בידוד של חזירי האסטרוציטים (פרוטוקול זה) התבססה על פרוטוקולים שפותחה על ידי המעבדה טי Moos באולבורג, שתואר על ידי תומסון ואח22. את TEER ומאפיינים אחרים של המודל שנוצר ב לונדון וב אהרחוס דומים, אשר מקנה בטחון לרעיון המודל בקלות מועברים בין מעבדות ומגיב היטב כדי התבוננות מעמיקה, רציונליזציה של שיטת השלבים. אכן, Yusof ס הקימה כעת דגם MC במדינה טרופית (מלזיה)23, אשר מעורבים התאמה נוספת עבור תנאים מקומיים ומקורות רקמות.

יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות וכיום הקימה מודלים

בהשוואה לתאי אנדותל מוח של פרה ומקור מכרסמים, pBECs לספק את היתרון של בעל שיעור נמוך יותר של אובדן ויוו BBB פנוטיפ בעקבות בידוד24. יתר על כן, pBECs מסוגלים להרכיב את המחסומים אנדותל צר יחסית, אפילו כאשר גדל ב- MC (Ω 800 ס מ2)16 לעומת רמות בדרך כלל דיווחו על monolayers של שורות תאים כגון bEND.5 ו- bEND.3 (50 Ω ס מ2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω ס מ2)28,29,30, ואת cerebEND (500 Ω ס מ2)29,31,32, ומוח ראשוניים תאי אנדותל של העכבר (100-300 Ω ס מ2)האס. אס = “xref” > 33,34,35,36 , עכברוש (100-300 Ω ס מ2)37,38. עם זאת, TEER מראה תלות על ההליכים טיהור ותרבות. ברוב המקרים, התוספת של ACM או תרבות משותפת עם האסטרוציטים מראה השפעות המבדילים על תאי אנדותל ועלייה ב אטימות של שכבות אנדותל1. ובכל זאת, עם מאמצים כדי למטב את התנאים culturing, רק המודלים מבוססי שור הראו ערכי TEER להשוות המודלים מבוססי-חזירי (ממוצע של 800 Ω ס מ2 ב- MC, עד 2500 Ω ס מ2 בתרבות שיתוף אסטרוציט)13 ,39,40,41,42,43,44,45. כמו הדגמים בהתבסס על מוח ראשוניים שור תאי אנדותל הראו וריאציות גדול, בין ובתוך מעבדות14,45,46,47,48. הפארמצבטית יכול להיות בעיה. במודל pBEC שדווחו פה, המעבדות התורמים השיגו TEER דומה מאוד וערכי חדירות paracellular עם השתנות נמוך, והן בין מעבדות. ומכאן, זה צריך להיות אפשרי עבור מעבדות אחרות להקים מודל חזקים עם השתנות נמוך באמצעות השיטה המוצגת כאן. בנוסף ויוצרים שכבות אנדותל חזק, מודלים עם pBECs יש בעבר מאומתים על-ידי ביטוי של חלבונים צומת חזק, מובילי BBB פונקציונלי, רצפטורים, אנזימים והפגינו התאמה למגוון רחב של מחקרים15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. יתר על כן, transcriptome שלא פורסמו נתונים על תרבויות המשנה pBECs מציגה פרופיל הצפוי של מובילי BBB, קולטנים (שלא פורסמו תוצאות, נילסן. et al.).

המודל מבוסס על חזירי BBB יש יתרון נוסף כמו הגנום, אנטומיה, פיזיולוגיה, ומשקפים התקדמות המחלה של החזיר הביולוגיה האנושית ברמה גבוהה מאשר דגמים אחרים הוקמה60, אשר הם חיוביים כולל בתעשייה הפרמצבטית. כמו חזירי המוח הם תופעת לוואי נפוצה של תעשיית הבשר, הם מהווים מקור נגיש בקלות של המוח תאי אנדותל, צמצום מספר בעלי חיים לצורך הניסויים, וגם לספק תשואה גבוהה טיהור מהמוח חזירי אחד. למרות טיהור והטיפוח של תאים העיקרי הוא במידה מסוימת זמן רב ודורש מומחיות התקינה מתארגנת המודל, ראשי תאים מפיקים הדגמים BBB הכי אמין. שורות תאים מונצחים לא יכול להיות תחליף, כמו תכונות חשובות כגון מכשול אטימות, פרופילי ביטוי טרנספורטר, ורגולציה microenvironment אינן משקפות את ממצאי הניסוי ויוו61, 62. מודלים במבחנה לספק יתרון לחיות תאים הדמיה עם רזולוציה גבוהה יותר, כך ויזואליזציה של תהליכים תאיים מאפשר מתן אפשרות גישה בסמיכות לתאי שנדגמו או שנצפה, באמצעות מטרות עם הגדלה גבוהה יותר, איכות אופטית טובה יותר63. זה אינו המקרה לשימוש של מיקרוסקופ שני הפוטונים בבעלי חיים. יתר על כן, במבחנה מודלים מספקים את היכולת transfect תאים, המאפשר ויזואליזציה של חלבונים מתויג והחקירה של סחר שלהם.

יישומים של המודל

הפונקציה של BBB אינו קבוע, יכול להיות מאופנן באופן דינמי פיזיולוגיה והן פתולוגיה. מחלות נוירולוגיות רבות, כולל ניווניות, במחלות דלקתיות וזיהומיות, הפרעה, חדירות מוגברת של BBB נצפית64,65,66,67 . על מנת להפחית ולמנוע התקדמות המחלה ונזק עוקבות, זיהוי ואפיון של המנגנונים המולקולריים שבבסיס של האפנון של BBB הם בעלי חשיבות גדולה. בהקשר זה, מודלים אמינים במבחנה יש ביקוש גבוה על ידי תעשיית התרופות, יתר על כן תפקיד חשוב בחיזוי BBB החדירות של סמים על מערכת העצבים. כל במבחנה דגם הגשה המסך חדירות צריך להציג מסלול paracellular מגבילים, ארכיטקטורה התא מבחינה פיזיולוגית מציאותי, ביטוי פונקציונאלי של טרנספורטר מנגנונים68. הפגינו ב מחקרים קודמים16,17,57, ועל ידי paracellular חדירות וביטוי של טי-ג’יי, ג’יי חלבונים כאן, המודל הציג עונה על כל הקריטריונים האלה ומתאים לטווח של BBB מחקרים בולטים בשני פיזיולוגיה נורמלי בפתולוגיה. נקודות החוזק של שיטת טיהור וטיפוח הציג כוללים שילוב של פשטות, הפארמצבטית ואת היכולת לכלול astrocytic להשפיע בדגם שנוצר עמיד ואמין גבוהה TEER במבחנה BBB. בשביל זה מטרה, האסטרוציטים של חזירי ואלשין מקור הוכחו להגדיל את ותפקיד BBB של pBECs בצורה דומה22.

Protocol

המוח חזירי התקבלו כמו תוצרי לוואי של תעשיית המזון הדנית. משחטות דנית נמצאים תחת השגחה קפדנית והתבוננות על ידי הדני המשרד לאיכות הסביבה ועל האוכל. חולדות בשימוש עבור בידוד של האסטרוציטים היו בשבייה, קבוצה-שוכנו במתקן של בעלי חיים מקומיים בטמפרטורת החדר של 22 ° C – 23 ° C, על מחזו…

Representative Results

הקמתה של הדגמים במבחנה BBB בשיטה שלו שהוצגו, אופטימיזציה, טיפוח של pBECs והקמת מערכת הוספה קרום חדיר עם MC או בלי ACM או NCC עם האסטרוציטים (איור 1) בוצע לתקופה של 9-11 ימים (איור 2). לבחירה של תאי אנדותל, תרבות הראשונ…

Discussion

טיהור והתפשטות של pBEC

במהלך ההליך טיהור, שלבים קריטיים כוללות הסרה מהירה ויעילה של קרומי המוח והפרדה של חומר לבן ואפור, וזה חשוב עבור טיהור ביבול ובאיכות טוהר ועבור הקמת הדגם המתאים. לדגם הציג במבחנה BBB באמצעות pBECs, יש שיפור ואנו פשוטה הליך טיהור בהתבסס על המגון מכני של החו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להכיר אליזבת הלנה Bruun, שרה כריסטין כריסטנסן ו נילס מ Kristiansen לקבלת סיוע טכני, קרן לונדבק להעניק מספר R155-2013-14113.

Materials

Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE – 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D’Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -. F., Hanapi, N. A., Chan, K. -. L., Yusof, S. R., Lee, C. -. Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction ‘opening’: signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli, , et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood–brain barrier. AIDS. 15 (4), 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -. J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -. J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -. J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -. Y., Zhu, H. -. M., Wu, J. -. H., Wen, H., Liu, C. -. J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer’s and Parkinson’s disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Tags

Blood-brain BarrierPorcine Brain Endothelial CellsIn Vitro ModelPrimary Cell IsolationCapillary IsolationCell DigestionCell CultureTEERPermeability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image