प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) प्राथमिक सुअर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (pBECs) के आधार पर मॉडल की स्थापना के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया मौजूद है । मॉडल उच्च reproducibility, उच्च तंगी से पता चलता है, और दवा की खोज में परिवहन और intracellular तस्करी के अध्ययन के लिए उपयुक्त है ।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य शुद्धि और pBECs की खेती के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया प्रस्तुत करता है और इन विट्रो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) मोनो में pBECs पर आधारित मॉडल-संस्कृति (mc), astrocyte के साथ mc-वातानुकूलित माध्यम (ACM), और स्थापित करने के लिए सुअर या चूहा मूल के astrocytes के साथ गैर संपर्क सह संस्कृति (एन सी सी) । pBECs घरेलू सूअरों 5-6 महीने पुराने के मस्तिष्क cortices से केशिकाओं के टुकड़े से अलग और संस्कृति थे । इन टुकड़ों मेनिन्जेस, अलगाव और ग्रे मैटर, निस्पंदन, एंजाइमी पाचन, और केंद्रापसारक के homogenization के सावधान हटाने के द्वारा शुद्ध थे । आगे दूषित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, केशिका टुकड़े puromycin युक्त माध्यम से संस्कृति थे । जब 60-95% धाराप्रवाह, केशिका टुकड़ों से बढ़ pBECs पारगंय झिल्ली फ़िल्टर आवेषण के लिए पारित किया गया और मॉडलों में स्थापित । बाधा जकड़न और pBECs के BBB विशेषता phenotype बढ़ाने के लिए, कोशिकाओं को निंनलिखित विभेद कारकों के साथ इलाज किया गया: झिल्ली permeant 8-CPT-शिविर (यहां संक्षिप्त शिविर), hydrocortisone, और एक phosphodiesterase अवरोध करनेवाला, आरओ-20-1724 (आरओ) । प्रक्रिया 9-11 दिनों की अवधि में किया गया था, और जब एनसीसी मॉडल की स्थापना, astrocytes 2-8 सप्ताह पहले से संस्कृति थे । प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन उच्च प्रतिबंधित paracellular पारगम्यता के साथ endothelial परतों की स्थापना की अनुमति दी गई है, एनसीसी मॉडल के साथ एक औसत transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ) दिखा रहा है १२४९ ± ८० Ω मुख्यमंत्री 2, और paracellular पारगम्यता (Papp) के लूसिफ़ेर पीला के लिए ०.९० 10-6 ± ०.१३ 10-6 सेमी सेक-1 (मतलब ± SEM, n = 55) । इसके अलावा इस pBEC phenotype के मूल्यांकन ने तंग जंक्शन प्रोटीन्स claudin 5, ZO-1, occludin और adherens जंक्शन प्रोटीन p120 catenin की अच्छी अभिव्यक्ति दिखाई । प्रस्तुत मॉडल स्वास्थ्य और रोग में BBB के अध्ययन की एक सीमा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और, अत्यधिक प्रतिबंधात्मक paracellular पारगम्यता के साथ, इस मॉडल परिवहन और intracellular तस्करी के अध्ययन के लिए उपयुक्त है ।
सेलुलर संरचना और रक्त मस्तिष्क बाधा के समारोह
संचार और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के इंटरफेस में, BBB सीएनएस microenvironment के homoeostatic नियंत्रण के लिए एक प्रमुख विनियामक स्थल के रूप में कार्य करता है, जो कि उचित कार्य और तंत्रिका तंत्र के संरक्षण के लिए आवश्यक है । BBB की साइट endothelial रक्त वाहिका लुमेन अस्तर कोशिकाओं है । मस्तिष्क केशिकाओं में, endothelial कोशिकाओं जटिल सेलुलर तंग जंक्शनों के रूप में और विशेष रूप से आमद और समाप्ति ट्रांसपोर्टरों की दृढ़ता से ध्रुवीकरण अभिव्यक्ति पैटर्न रक्त और मस्तिष्क के बीच अत्यधिक विशिष्ट आणविक परिवहन सुनिश्चित 1। तंग जंक्शन परिसरों के संरचनात्मक घटकों में occludin और claudin परिवार, zonula occludens (ZO) प्रोटीन, cingulin, और संबद्ध जंक्शनीय आसंजन अणु (जैम) से प्रोटीन शामिल हैं । Claudin 5 paracellular जंक्शन प्रतिबंध में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । प्रेरण और इस विशेषता BBB endothelial phenotype के रखरखाव pericytes, astrocytes, ंयूरॉंस और तहखाने झिल्ली, जिसमें मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के साथ मिलकर फार्म सहित आसपास के कोशिकाओं के साथ गतिशील बातचीत शामिल neurovascular इकाई (NVU)२,३. इन बातचीत में शामिल तंत्र अभी तक पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं, लेकिन कोशिकाओं के बीच रासायनिक संकेतों के आदान प्रदान शामिल हैं, जो अल्पावधि में BBB पारगम्यता के मॉडुलन की अनुमति देता है और लंबी अवधि के BBB सुविधाएँ4. Astrocytes विशेष रूप से मस्तिष्क endothelial कोशिका phenotype में योगदान करने के लिए जाना जाता है और glial-व्युत्पन्न neurotrophic फैक्टर (प्रभावित intracellular शिविर) के रूप में नियामक कारकों का एक स्रोत हैं5, बुनियादी fibroblast विकास फैक्टर6, hydrocortisone7, और रूपांतरित विकास कारक β (TGF-β)8. TGF-β के प्रभाव, हालांकि,9पर बहस हो गई है ।
से Vivo में इन विट्रो BBB
vivo में अध्ययन BBB जीव विज्ञान पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान करने के लिए जारी है । हालांकि, सेल संस्कृति मॉडल अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करने और स्वास्थ्य और रोग दोनों में BBB के विस्तृत आणविक और कार्यात्मक पहलुओं को समझने के लिए उपयोगी उपकरण का गठन कर सकते हैं । हालांकि कोशिका प्रकार और BBB के घटकों के बीच जटिल बातचीत पूरी तरह से में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है इन विट्रो मॉडल में , वहां गया है, मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं और मोनो में इन के आवेदन की पहली शुद्धि के बाद से संस्कृतियों 10 , 11 , 12, शुद्धि प्रक्रियाओं और BBB सेल संस्कृति मॉडल की वृद्धि की स्थिति के व्यापक विकास, vivo बैरियर में अधिक से अधिक समानता में जिसके परिणामस्वरूप । इन विट्रो BBB मॉडल में सामांय रूप से इस्तेमाल किया कुतर, सुअर, और गोजातीय मूल के प्राथमिक कोशिकाओं पर आधारित हैं, और अमर सेल लाइनों पर । प्रत्येक मॉडल अलग फायदे और कमियां है । तुलना और मॉडल की पसंद के लिए, BBB एंजाइमों, ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के रूप में इस तरह के सत्यापन मार्करों, और संरचनात्मक प्रोटीन के लिए वर्तमान स्थापित मॉडल1का पूर्वावलोकन बनाने के लिए उपयोग किया जाता है ।
प्रोटोकॉल का उद्देश्य
BBB की एक महत्वपूर्ण विशेषता बाधा जकड़न और उच्च तीळ है, अभी तक उपलब्ध मॉडलों की एक बड़ी संख्या अच्छी तरह से vivo में स्तर को प्रतिबिंबित नहीं है. कई प्रयोगशालाओं से विकास और अनुकूलन योगदान को शामिल करते हुए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य MC BBB में प्राथमिक pBECs के आधार पर इन विट्रो में उच्च तीळ की स्थापना के लिए एक विधि प्रस्तुत करना है या ACM के बिना, या एनसीसी में प्राथमिक मूषक या सुअर मूल के astrocytes । एप्लाइड प्रक्रियाओं और मॉडल की स्थापना के लिए प्रदूषित कोशिकाओं को खत्म करने और एक BBB phenotype में pBECs के भेदभाव में सुधार करने के प्रयास शामिल हैं । यह काम कम paracellular पारगम्यता और महत्वपूर्ण तंग जंक्शन प्रोटीन, ट्रांसपोर्टरों, और रिसेप्टर्स के अच्छे कार्यात्मक अभिव्यक्ति के साथ विश्वसनीय, उच्च तीळ मॉडल की स्थापना में हुई है । हालांकि, के रूप में astrocytes मस्तिष्क endothelial कोशिका phenotype के लिए एक योगदान कारक हैं, संस्कृति के तीन विभिंन परिस्थितियों मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के तीन विभिंन phenotypes प्रतिनिधित्व करते हैं । एनसीसी मॉडल विशेष रूप से दवा की खोज में शामिल कुछ विशेष तंत्र के अध्ययन के लिए उपयोगी है, परिवहन अध्ययन और intracellular तस्करी, साथ ही सेल सेल बातचीत की जांच के लिए जहां BBB सुविधाओं के अधिक से अधिक अभिव्यक्ति है लाभप्रद.
मूल और प्रोटोकॉल का इतिहास
pBEC मॉडल यहां वर्णित मुख्यतः सुअर Eisai प्रयोगशालाओं (लंदन) में डॉ लुईस मॉर्गन और सहयोगियों द्वारा विकसित मॉडल पर आधारित है, whichis एक सफल पहले गोजातीय मस्तिष्क endothelial सेल मॉडल13पर आधारित है । सेल तैयार करने की मूल विधि एक दो चरण microvessels को पकड़ने के लिए नायलॉन जाल का उपयोग छानने का यंत्र था, पवित्रता में सुधार करने के लिए एक subculturing कदम के बाद । विधि के पूर्व विकास में, इष्टतम BBB phenotype और बाधा तंगी ACM सहित पूरक माध्यम में वृद्धि से प्राप्त किया गया था । विधि में और संशोधन आर स्किनर द्वारा मैनचेस्टर यूके14,15में प्रो एन Rothwell लैब में किए गए । यह विधि एबॉट लेबोरेटरी, KCL लंदन द्वारा अपनायी गई, जहां Patabendige ने astrocytes या ACM के प्रयोग से परहेज करके और pericytes के साथ puromycin जैसे प्रदूषित कोशिकाओं को नष्ट करके तैयार करने को काफी सरल बनाया । पहले कागजात की पुष्टि की है कि एम सी मॉडल vivo में BBB के कई महत्वपूर्ण सुविधाओं को संरक्षित, प्रभावी तंग जंक्शनों सहित, झिल्ली परिवहन प्रणालियों और रिसेप्टर मध्यस्थता transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. बाद में एस Yusof फिर से astrocyte सह संस्कृति का परीक्षण किया और पाया कि यह काफी सुधार हुआ है, तो इस समय एबॉट लैब21में प्रयुक्त पसंदीदा संस्करण है । मॉडल अब सफलतापूर्वक आर्हस, जहां आगे संशोधनों में शुरू किया गया है एम. नीलसन लैब में स्थानांतरित किया गया है (इस प्रोटोकॉल), ग्रे बात निष्कर्षण सरल बनाने सहित, केवल एक जाल निस्पंदन कदम का उपयोग कर, और एक एकल फिल्टर कोटिंग कदम कोलेजन और fibronectin का मेल । सुअर astrocytes के अलगाव के लिए लागू की गई प्रक्रिया (इस प्रोटोकॉल) ऑलबोर्ग में मूॉ प्रयोगशाला द्वारा विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित था, Thomsen एट अल22द्वारा वर्णित है । तीळ और लंदन और आर्हस में उत्पन्न मॉडल के अन्य गुण समान हैं, जो धारणा है कि मॉडल आसानी से प्रयोगशालाओं के बीच स्थानांतरित कर दिया है और अच्छी तरह से सावधान अवलोकन और विधि कदम के युक्तिसंगत के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए विश्वास उधार देता है. दरअसल, एस Yusof अब एक उष्णकटिबंधीय देश (मलेशिया) में एम सी मॉडल की स्थापना की है23, जो स्थानीय परिस्थितियों और ऊतक स्रोतों के लिए आगे समायोजन शामिल है ।
वैकल्पिक तरीकों पर लाभ और वर्तमान में स्थापित मॉडल
गोजातीय और मूषक मूल के ब्रेन endothelial कोशिकाओं की तुलना में, pBECs अलगाव24के बाद vivo BBB phenotype में के नुकसान की कम दर होने का लाभ प्रदान करते हैं । इसके अलावा, pBECs अपेक्षाकृत तंग endothelial बाधाओं बनाने में सक्षम हैं, यहां तक कि जब एम सी में हो (८०० ω cm2)16 के रूप में इस तरह के बेंड .5 और बेंड के रूप में सेल लाइनों के monolayers के लिए आमतौर पर रिपोर्ट के स्तर की तुलना में । 3 (५० ω cm2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 ω cm2)28,29,30, और cerebEND (५०० ω cm2)29,31,३२, और प्राथमिक मस्तिष्क माउस के endothelial कोशिकाओं (100-300 Ω cm2)ss = “xref” > 33,३४,३५,३६ और चूहा (100-300 Ω cm2)३७,३८. हालांकि, तीळ शुद्धि और संस्कृति प्रक्रियाओं पर निर्भरता दिखाई गई है । ज्यादातर मामलों में, astrocytes के साथ ACM या सह संस्कृति के अलावा endothelial कोशिकाओं पर प्रभाव अंतर से पता चलता है और endothelial परतों की तंगी में एक वृद्धि1. फिर भी, संवर्धन शर्तों को अनुकूलित करने के प्रयासों के साथ, केवल गोजातीय आधारित मॉडल को दिखाया गया है तीळ सुअर आधारित मॉडल के तुलनीय मूल्यों (८०० ω सेमी2 के औसत दर्जे का एम सी में, २५०० ω सेमी2 में astrocyte सह संस्कृति)13 ,३९,४०,४१,४२,४३,४४,४५. प्राथमिक गोजातीय मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं पर आधारित मॉडल के रूप में बड़े बदलाव दिखाया गया है, दोनों के बीच और प्रयोगशालाओं के भीतर14,४५,४६,४७,४८, reproducibility एक मुद्दा हो सकता है । यहां pBEC मॉडल में, कालाबाजारी प्रयोगशालाओं कम परिवर्तनशीलता के साथ बहुत ही तीळ और paracellular पारगम्यता मूल्यों को हासिल किया है, दोनों में और प्रयोगशालाओं के बीच. अतः, अन्य प्रयोगशालाओं के लिए यह संभव होना चाहिए कि यहाँ प्रस्तुत पद्धति का उपयोग करके कम परिवर्तनशीलता के साथ एक सुदृढ़ मॉडल स्थापित किया जाए. तंग endothelial परतों के गठन के अलावा, pBECs के साथ मॉडल पहले तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा मान्य किया गया है, कार्यात्मक BBB ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स और एंजाइमों, और अध्ययन की एक सीमा के लिए उपयुक्तता का प्रदर्शन15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , ४९ , ५० , ५१ , ५२ , ५३ , ५४ , ५५ , ५६ , ५७ , ५८ , ५९. इसके अलावा, pBECs की सह संस्कृतियों पर अप्रकाशित transcriptome डेटा BBB ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स (अप्रकाशित परिणाम, नीलसन एट अल) के एक अपेक्षित प्रोफ़ाइल से पता चलता है ।
सुअर आधारित BBB मॉडल जीनोम, शरीर रचना विज्ञान, फिजियोलॉजी के रूप में एक और लाभ है, और सुअर के रोग प्रगति अंय स्थापित मॉडल६०, जो के लिए अनुकूल विशेषताएं है की तुलना में एक उच्च डिग्री के लिए मानव जीवविज्ञान को प्रतिबिंबित दवा उद्योग । के रूप में सुअर दिमाग एक आम द्वारा मांस उद्योग के उत्पाद हैं, वे मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के एक आसानी से सुलभ स्रोत का गठन, प्रयोगों के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या को कम करने, और एक सुअर मस्तिष्क से एक उच्च शोधन उपज प्रदान । हालांकि शुद्धि और प्राथमिक कोशिकाओं की खेती कुछ समय लेने वाली है और मॉडल की स्थापना में मानकीकरण के लिए विशेषज्ञता की आवश्यकता है, प्राथमिक कोशिकाओं सबसे विश्वसनीय BBB मॉडल उत्पन्न करते हैं । अमरता सेल लाइनों एक विकल्प नहीं हो सकता है, जैसे महत्वपूर्ण गुण के रूप में बाधा तंगी, ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति प्रोफाइल, और microenvironment विनियमन vivo मेंप्रयोगात्मक निष्कर्षों को प्रतिबिंबित नहीं करते६१, ६२. इन विट्रो मॉडल उच्च संकल्प के साथ लाइव सेल इमेजिंग का लाभ प्रदान करते हैं, intracellular प्रक्रियाओं का दृश्य नमूना या मनाया कोशिकाओं के लिए एक करीबी निकटता दृष्टिकोण की अनुमति से संभव बनाने, उद्देश्यों का उपयोग उच्च आवर्धन और बेहतर ऑप्टिकल गुणवत्ता६३के साथ । जीवित पशुओं में दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के इस्तेमाल के लिए यह मामला नहीं है । इसके अलावा, इन विट्रो मॉडल में कोशिकाओं transfect करने की क्षमता प्रदान करते हैं, टैग प्रोटीन और उनके तस्करी की जांच के दृश्य की अनुमति ।
मॉडल के अनुप्रयोग
BBB का समारोह तय नहीं है और गतिशील दोनों फिजियोलॉजी और विकृति विज्ञान में संग्राहक किया जा सकता है । neurodegenerative, भड़काऊ और संक्रामक रोगों, विघटन और BBB की वृद्धि हुई पारगम्यता सहित कई स्नायविक रोगों में मनाया जाता है६४,६५,६६,६७ . आदेश में कम करने और रोग की प्रगति और बाद में नुकसान को रोकने के लिए, BBB के मॉडुलन अंतर्निहित आणविक तंत्र के पहचान और लक्षण वर्णन प्रमुख महत्व के हैं । इस संदर्भ में, विश्वसनीय इन विट्रो मॉडल दवा उद्योग द्वारा उच्च मांग में हैं, और इसके अलावा सीएनएस के लिए दवाओं की BBB पारगम्यता की भविष्यवाणी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । किसी भी इन विट्रो मॉडल एक पारगम्यता स्क्रीन के रूप में सेवारत एक प्रतिबंधक paracellular मार्ग, एक शारीरिक यथार्थवादी सेल वास्तुकला और परिवहन तंत्र के कार्यात्मक अभिव्यक्ति६८प्रदर्शित करना चाहिए । पिछले अध्ययन16,17,५७में प्रदर्शन किया, और paracellular पारगम्यता और टी जे और ए जे प्रोटीन की अभिव्यक्ति यहां से, प्रस्तुत मॉडल इन सभी मानदंडों को पूरा करती है और BBB की एक सीमा के लिए उपयुक्त है दोनों सामान्य फिजियोलॉजी में और पैथोलॉजी में अध्ययन. प्रस्तुत शुद्धि और खेती विधि की शक्तियों में सादगी और reproducibility का एक संयोजन और एक जिसके परिणामस्वरूप मजबूत और विश्वसनीय उच्च तीळ के साथ astrocytic प्रभाव शामिल करने की क्षमता शामिल है इन विट्रो BBB मॉडल । इस प्रयोजन के लिए, सुअर और चूहे मूल के astrocytes एक समान तरीके से22में pBECs के BBB phenotype बढ़ाने के लिए दिखाया गया है ।
सुअर दिमाग डेनिश खाद्य उद्योग के शोधकार्य के रूप में प्राप्त किया गया । डेनिश बूचड़खानों सख्त पर्यवेक्षण और पर्यावरण और खाद्य मंत्रालय डेनमार्क द्वारा निरीक्षण के अधीन हैं ।
astrocytes के अल?…
pBEC का शुद्धिकरण और प्रसार
शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान, महत्वपूर्ण कदम मेनिन्जेस और सफेद और भूरे रंग की बात है, जो शुद्धि उपज और पवित्रता और मॉडल की उचित स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है की जुदाई क…
The authors have nothing to disclose.
लेखक Elisabeth हेलेना Bruun, सारा क्रिस्टीन Christensen, और नील्स एम Kristiansen तकनीकी सहायता के लिए, और Lundbeck फाउंडेशन अनुदान संख्या R155-2013-14113 स्वीकार करना चाहते हैं ।
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
DMEM/F-12 | Lonza | BE12-719F | |
DMEM/Low Glucose | Sigma-Aldrich | D6046 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco Invitrogen | 15140 | |
Plasma derived serum (PDS) | First Link UK Ltd. | 60-00-89 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10-270-106 | |
Trypsin/EDTA | Gibco Invitrogen | 15090-046 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
8-CPT-cAMP | Biolog | C010 | |
RO 20-1724 | Sigma-Aldrich | B8279 | |
Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 34896 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
EtOH | VWR | 20,824,296 | Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Collagenase CLS2 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
ddH2O | Made with Elga System | ||
T75 flasks | Thermo Scientific | 156499 | |
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) | Costar | CLS3401 | 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane |
15 ml centrifuge tubes | Cellstar | 188271 | |
50 ml centrifuge tubes | Cellstar | 227261 | |
Petri dishes | Thermo Scientific | 150350 | |
Cryo vials | Thermo Scientific | 377224 | |
500 ml bottle | Thermo Scientific | 159910/159920 | |
Scalpels | Swann-Morten | REF0211 | Type 24 |
Tissue homogenizer | Sigma | D9188 | |
140 μm filters | MERCK | NY4H04700 | |
40 μm filters | Corning | 431750 | |
EndOhm chamber system | World Precision Instruments | ENDOHM-12 | EndOhm chamber for 12mm Culture Cups |
EVOM2 electrode system | World Precision Instruments | 300523+STX100C | TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair |
Long needle | Sigma | Attach to a syringe | |
Fine-tip curved forceps | KLS Martin | 12-409-12-07 | |
Broad tip forceps | VWR | 82027-390 | |
Filter holder | MERCK Milipore | Swinnex-47 | |
50 ml syringe | Braun | 4617509F | |
10 ml syringe | Terumo | SSt20ESI | |
Anti-Occludin antibody | Abcam | ab31721 | 1:100 |
Anti-p120 Catenin antibody | BD Transduction laboratories | 610133 | 1:200 |
Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 61-7300 | 1:200 |
Anti-Claudin 5 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4502981 | 1:100 |
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 | Thermo Scientific | A10042 | 1:500 |
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 | Thermo Scientific | A21202 | 1:500 |
Sucrose | Perkin Elmer | NEC100X250UC | 0.15µl/ml final working conc |
Lucifer Yellow | Sigma | L0144 | 10 µg/ml final working conc |