Улучшен метод для создания в Vitro гематоэнцефалического барьера модель, основанная на эндотелиальных клеток свиного мозга

Summary

Цель Протокола заключается в представлении оптимизированная процедура для создания в vitro гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) модели на основе первичных свиного мозга эндотелиальных клеток (pBECs). Модель показывает высокую воспроизводимость, высокая герметичность и подходит для исследования транспорта и внутриклеточных оборота лекарственных препаратов.

Abstract

Целью настоящего Протокола представляет оптимизированная процедура для очистки и выращивание pBECs и установить в vitro гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) модели, основанные на pBECs в моно культура (MC), MC с кондиционером экзоцитоз среднего (ACM), и Бесконтактный культуры (НКК) совместно с астроциты свинины или крыса происхождения. pBECs были изолированы и культивировали из фрагментов капилляров от мозга коре домашних свиней 5-6 месяцев. Эти фрагменты были очищены путем тщательного удаления мозговых оболочек, изоляции и гомогенизации серого вещества, фильтрации, ферментативного пищеварения и центрифугирования. Для дальнейшей ликвидации загрязняющих клетки, капиллярные фрагменты были культивируемых с puromycin содержащих среднего. Когда 60-95% притока, pBECs, растущих из капилляра фрагменты были пассированной на проницаемой мембраны фильтра вставляет и созданы в модели. Для повышения герметичности барьер и BBB характерные фенотип pBECs, клетки рассматриваются следующие факторы дифференциации: мембраны permeant 8-CPT-лагерь (здесь сокращенный), гидрокортизон и ингибитор фосфодиэстеразы, RO-20-1724 (RO). Процедура была проведена в течение 9-11 дней, а при создании модели НКК, астроциты были культивированный 2-8 недель заранее. Соблюдение описанных процедур в протоколе позволило создание эндотелиального слоя с весьма ограниченным параклеточный проницаемости, с НКК модели показаны средние трансэндотелиальной электрическое сопротивление (ТЕЕР) 1249 ± 80 см Ω ²и параклеточный проницаемости (P_app) для Люцифера желтый 0,90 10^-6 ± 0,13 10^-6 см сек^-1 (означает ± SEM, n = 55). Дальнейшая оценка этой pBEC фенотип показал хорошее выражение туго белков соединительной Клаудин 5, ZO-1, occludin и adherens перекрестка белка p120 катенина. Представленная модель может использоваться для ряда исследований BBB в здоровье и болезни, и, с строгими параклеточный проницаемости, эта модель подходит для исследования транспорта и внутриклеточных людьми.

Introduction

Сотовая структура и функции гематоэнцефалического барьера

В интерфейсе кровообращения и центральной нервной системы (ЦНС) BBB выступает в качестве ключевых нормативных сайт для управления homoeostatic ЦНС микроокружения, который необходим для правильного функционирования и защиты нервной системы. На сайте BBB является эндотелиальных клеток, выстилающих просвета кровеносного сосуда. В капилляров мозга эндотелиальные клетки образуют комплекс межклеточных плотные соединения и сильно поляризованных выражение структуры конкретной приток и измеряем перевозчиков обеспечить весьма конкретные молекулярные транспорта между кровью и мозг ¹. Структурные компоненты жесткие соединения комплексов белки из семьи occludin и Клаудин, zonula occludens (ЗО) белки, cingulin и связанные молекулы адгезии соединительной (джемы). Клаудин 5 особенно важна в параклеточный соединительной ограничения. Индукция и поддержание этой характерной BBB эндотелиальной фенотип включают динамические взаимодействия с окружающих клеток, включая pericytes, астроциты, нейроны и подвал мембраны, которые вместе с мозга эндотелиальных клеток формы нервно-сосудистого блок (NVU)^2,3. Механизмы, участвующие в этих взаимодействиях пока еще не полностью изучены, но включают в себя обмен химических сигналов между клетками, которые позволяет модуляции BBB проницаемости в краткосрочной перспективе и вызывает долгосрочные BBB особенности⁴. Астроциты особенно известны вносить фенотип эндотелиальных клеток мозга и являются источником регулирования факторов, таких как глиальных нейротрофического фактором (внутриклеточный лагерь)⁵, основные фибробластический фактор роста⁶, Гидрокортизон⁷и преобразование фактор роста β (TGF-β)⁸. Однако, эффект TGF-β, был обсуждается⁹.

В естественных условиях в Vitro BBB

В vivo исследований по-прежнему предоставляют ценную информацию по биологии BBB. Однако модели культуры клеток может предоставить дополнительные идеи и представляют собой полезные инструменты для понимания детальные молекулярной и функциональные аспекты BBB в здоровье и болезни. Хотя сложных взаимодействий между типами клеток и составляющих BBB трудно полностью достичь в моделях в пробирке , там был, начиная с первой очистки эндотелиальных клеток мозга и применение их в моно культур ^{10 , 11 , 12}, экстенсивное развитие очистительных процедур и условий роста BBB ячейки модели культуры, что приводит к большей сходство барьер в естественных условиях . Часто используемые в vitro BBB модели основаны на первичной клетки грызуна, свинину и говядину происхождения и на увековечен клеточных линий. Каждая модель имеет свои преимущества и недостатки. Для сравнения и модель выбора проверки маркеров, такие как выражение BBB ферментов, транспортеры, рецепторы, и структурных белков используются для создания обзоры текущей установленной модели¹.

Цель протокола

Одной важной особенностью BBB барьер герметичности и высокой ТЕЕР, но большое количество доступных моделей также не отражают уровни в естественных условиях . Включение развития и оптимизации вклада от нескольких лабораторий, Цель настоящего Протокола заключается в представлении метод для создания высокой ТЕЕР в vitro BBB модель на основе первичных pBECs в MC с или без ACM, или в НКК с начальной Астроциты крыса или свиного происхождения. Применяемые процедуры и создание модели включают в себя усилия по ликвидации загрязняющих клеток и для улучшения дифференциации pBECs в BBB фенотип. Эта работа привела в создании надежных, высококачественных ТЕЕР моделей с низким параклеточный проницаемости и хорошее функциональное выражение ключевых туго соединительной белков, перевозчиков и рецепторы. Однако как астроциты являются фактором, способствующим фенотип эндотелиальных клеток мозга, три различных условий культуры представляют собой три разных фенотипов эндотелиальных клеток мозга. НКК модель специально полезно для исследования некоторых специализированных механизмов, участвующих в лекарственных препаратах, транспортных исследований и внутриклеточных людьми, а также для исследования взаимодействия клеток где максимальное выражение BBB функций является выгодно.

Происхождение и история протокола

Модель pBEC, описанные здесь в основном основана на свинину модель, разработанная в лаборатории «Eisai» (Лондон) д-р Луизы Морган и его коллеги, whichis, на основе успешных ранее мозга эндотелиальных клеток модель¹³. Оригинальный метод подготовка клетки была двухступенчатой фильтрации с помощью нейлоновых сетки поймать микрососудов, последовал subculturing шаг для улучшения чистоты. В более ранних разработки метода оптимального BBB фенотипа и барьер герметичность были достигнуты роста в дополнение среде, включая ACM. В лаборатории проф. н. Rothwell в Манчестер Великобритания^14,15р. Скиннер были сделаны дальнейшие изменения в метод. Этот метод был принят в лаборатории Эбботт, KCL Лондон, где Патабендиге сделали это значительно проще подготовить, избегая использования астроциты или ACM и устраняя вредные клетки, такие как pericytes с puromycin. Документы первой подтвердил, что модель MC сохранились несколько важных особенностей в vivo BBB, включая эффективные плотные соединения, мембранных транспортных систем и рецептор опосредованный Трансцитоз^{16,17 , 18 , 19 , 20}. позднее S. Юсуф снова протестировано экзоцитоз Сопредседатель культуры и она значительно улучшилась ТЕЕР, так что это предпочтительный вариант, в настоящее время используется в лабораторию Эббот²¹. Модели был успешно передан M. Nielsen лаборатории в Орхусе, где дальнейшие изменения были введены (этот протокол), включая упрощение серый вопрос извлечения, используя только один сетки фильтрации шаг и шаг покрытие один фильтр сочетание коллагена и фибронектина. Прикладная процедура изоляции свинину астроциты (этот протокол) был основан на протоколах, разработанных лабораторией т. Moos в Ольборг, описываемого Thomsen et al²². ТЕЕР и другие свойства модель, созданная в Лондоне и Орхус похожи, который придает уверенность в том, что модель легко передается между лабораториями и хорошо реагирует на тщательное наблюдение и рационализации метода действия. Действительно S. Юсуф теперь создана модель MC в тропические страны (Малайзия)²³, предполагающей дополнительную корректировку для местных условий и ткани источников.

Преимущества над альтернативными методами и в настоящее время созданы модели

По сравнению с эндотелиальных клеток мозга крупного рогатого скота и грызунов происхождения, pBECs обеспечивают преимущество более низкий уровень потерь в vivo фенотипа BBB после изоляции²⁴. Кроме того pBECs способны образовывать относительно жесткая эндотелиальной барьеров, даже когда выросла в¹⁶ MC (800 Ω см²) по сравнению с часто сообщаемых уровней для монослои клеточных линий, таких как bEND.5 и bEND.3 (50 Ω см²) ^{25 , 26 , 27}, cEND (300-800 Ω см²)^28,29,30и cerebEND (500 Ω см²)^29,,3132и первичного мозга эндотелиальные клетки мыши (100-300 Ω см²)SS = «внешней» > 33^,34,,3536 и крыса (100-300 Ω см²)^37,38. Однако ТЕЕР показал зависимость на процедурах очистки и культуры. В большинстве случаев добавлением ACM или совместного культуры с астроциты показывает дифференциации воздействия на эндотелиальных клеток и увеличение в герметичности эндотелиального слоя¹. Тем не менее, с усилиями по оптимизации условий культивирования, только говядину на основе модели показали значения ТЕЕР сопоставимы с свинину на основе моделей (в среднем 800 Ω см² в MC, до 2500 Ω см² экзоцитоз Сопредседатель культуры)^{13 ,39,40,,4142,,4344,45}. Как модели, основанные на первичного мозга эндотелиальных клеток показали большие вариации, как между, так и в лаборатории^{14,45,46,47,48}, воспроизводимости может быть проблемой. В модели pBEC, сообщили здесь участвующих лабораторий достигли очень похожие ТЕЕР и параклеточный проницаемости значения с низкой изменчивости, как в, так и между лабораториями. Следовательно должно быть возможно для других лабораторий учредить надежную модель с низкой изменчивости, с помощью метода, представленные здесь. Помимо формирования жесткой эндотелиального слоя, модели с pBECs ранее были подтверждены выражением туго Джанкшен белков, функциональные BBB перевозчиков, рецепторы и ферментов и продемонстрирована пригодность для ряда исследований^{15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59}. Кроме того, неопубликованные транскриптом данные о сотрудничестве культур pBECs показывает ожидаемое профиль BBB перевозчиков и рецепторов (неопубликованные результаты, Нильсен и др.).

BBB свинину ориентированная модель имеет еще одно преимущество как генома, анатомии, физиологии, и прогрессирования заболевания свиней отражают биологии человека в большей степени, чем другие установленные модели⁶⁰, которые являются благоприятные возможности для Фармацевтическая промышленность. Как свиные мозги общим побочным продуктом мясной промышленности, они представляют собой легко доступного источника мозга эндотелиальных клеток, свести к минимуму количество животных для экспериментов и обеспечение высокой очистки доходность от одной свиного мозга. Хотя очистки и культивирования клеток первичного несколько трудоемкий и требует знаний для стандартизации в создании модели, первичные элементы генерировать самые надежные модели BBB. Увековечен клеточных линий не могут заменить, как важные свойства, такие как барьер герметичность, транспортер выражение профили и микроокружения регулирование не отражают экспериментальной выводы в vivo^{61, 62}. в vitro модели обеспечивают преимущество клеток изображений с высоким разрешением, возможность визуализации внутриклеточных процессов, позволяя близость подход к пробы или наблюдаемых ячейки, используя цели с увеличение и лучше оптическое качество⁶³. Это не дело для использования двух Фотон микроскопии в живых животных. Кроме того в пробирке модели обеспечивают возможность transfect клетки, позволяя визуализации тегами белков и расследования их незаконной торговли.

Применение модели

Функция BBB не является фиксированной и может быть динамически модулированный в физиологии и патологии. Во многих неврологических заболеваний, в том числе нейродегенеративных воспалительные и инфекционные заболевания, нарушения и повышение проницаемости BBB наблюдается^64,65,66,67 . Для того, чтобы уменьшить и предотвратить прогрессирование заболевания и последующего ущерба, определение и характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе модуляции BBB являются большое значение. В этом контексте надежные в vitro модели пользуются большим спросом в фармацевтической промышленности и Кроме того играют важную роль в прогнозировании BBB проницаемость наркотиков в ЦНС. Любая модель в пробирке , выступающей в качестве экрана проницаемости должен отображаться ограничительные параклеточный путь, физиологически реалистичные клеток архитектуры и функциональных выражение транспортер механизмы⁶⁸. Продемонстрировал в предыдущих исследованиях^16,17,57и параклеточный проницаемости и выражение AJ и TJ белков здесь, представленная модель отвечает всем этим критериям и подходит для диапазона BBB исследования в обеих нормальной физиологии и патологии. Преимущества метода представленных очищения и культивирования включают в себя сочетание простоты и воспроизводимость и возможность включать Астроцитарная влияние с результирующей надежные и высокой ТЕЕР в vitro BBB моделью. Для этого назначения, астроциты свинины и крыса происхождения было показано для увеличения BBB фенотипа pBECs в аналогичный способ²².

Protocol

свиные мозги были получены как побочные продукты Датский пищевой промышленности. Датский бойнях находятся под строгим надзором и наблюдением датского министерства охраны окружающей среды и продовольствия. крыс, используется для изоляции астроциты были воспитанные и …

Representative Results

Создание моделей в Vitro BBB В методе представлены, оптимизированный выращивание pBECs и создание системы Вставка проницаемой мембраны с MC или без ACM или НКК с астроциты (рис. 1) была проведена в течение 9-11 дней (р?…

Discussion

Очистка и распространение pBEC

Во время процедуры очистки критические шаги включают быстрое и эффективное удаление мозговых оболочек и разделение белых и серых вопроса, который имеет важное значение для очистки урожайность и чистоты и для надлежащего создания модели. Для ?…

Materials

Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Plasma derived serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Collagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Made with Elga System
T75 flasks	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)	Costar	CLS3401	12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes	Cellstar	188271
50 ml centrifuge tubes	Cellstar	227261
Petri dishes	Thermo Scientific	150350
Cryo vials	Thermo Scientific	377224
500 ml bottle	Thermo Scientific	159910/159920
Scalpels	Swann-Morten	REF0211	Type 24
Tissue homogenizer	Sigma	D9188
140 μm filters	MERCK	NY4H04700
40 μm filters	Corning	431750
EndOhm chamber system	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle	Sigma		Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps	KLS Martin	12-409-12-07
Broad tip forceps	VWR	82027-390
Filter holder	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml syringe	Braun	4617509F
10 ml syringe	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin antibody	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin antibody	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 antibody	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Sucrose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 µg/ml final working conc