Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

Published: October 19, 2017 doi: 10.3791/56281
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2
1The Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

Abstract

המאמצים שלנו כדי לקבוע דפוסי ביטוי ולוקליזציה subcellular של דרוזופילה RNAs על בסיס הגנום כולו, ו במגוון של רקמות, פיתחנו שינויים ושיפורים רבים כדי שלנו המקורי פלורסנט סיטו פרוטוקול הכלאה (דגים). כדי להקל על התפוקה ויחס עלות-תועלת, כל השלבים, מדור בדיקה לאיתור אות, מבוצעות באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter אקסון. Digoxygenin (מחדירים)-הגששים שכותרתה antisense RNA מיוצרים באמצעות שיבוטים cDNA או דנ א גנומי כתבניות. לאחר קיבוע הרקמה, permeabilization, הגששים הם hybridized כדי תעתיקים של הריבית, אז שזוהו באמצעות רצף של נוגדן אנטי החפירה מצומדת כדי ביוטין, streptavidin מצומדת כדי חזרת peroxidase (HRP) ו fluorescently מצומדת . tyramide, המייצרת בנוכחות HRP, בינוני מאוד תגובתי המאגד לאזורים צפופים אלקטרונים של חלבונים סמוכים מיידית. השלבים הגברה ולוקליזציה לייצר אות מקומי מאוד ועמיד המקל על שני לוקליזציה התעתיק סלולרית ו- subcellular. הפרוטוקולים סיפק מוטבו להפקת אותות ספציפי מאוד במגוון רחב של רקמות, שלבים התפתחותיים. הפניות ניתנים גם וריאציות נוספות המאפשרות זיהוי בו זמנית מספר תעתיקים, או תעתיקים, חלבונים, באותו זמן.

Introduction

שיטות זיהוי RNA של הגנום כולו חדשות כגון ה-RNA-seq הרחיבו מאוד את הידע שלנו של מתי ואיפה באים לידי ביטוי של גנים, ועל איזה רמות1. עם זאת, אלה מספקים טמפורלית הדלה יחסית ופתרון מרחבית. רנ א בהכלאה באתרו מאפשר את התפוצה המרחבית של תעתיקים חזותית שחלים ברקמות קבוע, ובכך לחשוף את הפרטים של לוקליזציה הסלולר, subcellular2. שימוש פלורסנט היברידיזציה (דגים) מאפשר רזולוציה מרחבית יותר שכן היא מאפשרת את השימוש בטכניקות מיקרוסקופ רב עוצמה, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי וגיליון אור3. סמני פלורסנט כגון דאפי יכול לשמש גם כדי ליצור קשרים subcellular4. דגים מקלה גם על התצפית של RNAs וחלבונים מרובים בו זמנית עם סימנים ברורים של חפיפה ברמת subcellular. ניתן למצוא ב-3,הפניות הבאות5ריאגנטים ייחודי השלבים הנדרשים עבור תיוג-כפול.

ההליכים המתוארים כאן לנצל microtiter 96-ובכן לוחות עבור כל השלבים, כולל ייצור תבנית cDNA (המושבה PCR), ייצור בדיקה RNA (באמצעות שעתוק תלויי-פולימראז הגשמים T7, T3 או SP6) באתרו בתוך הכלאה, ו פיתוח אות ניאון. מספר מספיק של העוברים או רקמות נוספות כל טוב של צלחת 96-ובכן כדי לאפשר הערכה של עקביות ולשינויים. כל אחד מקבל אז בדיקה שונים. לאחר פיתוח אות, העוברים או רקמות מכל קידוח נערכים בשקופיות בודדות מיקרוסקופ לבדיקה מיקרוסקופית.

השימוש tyramide אות הגברה (TSA) לצורך זיהוי המכשיר מייצר אותות חזקים עם רזולוציה יוצאת דופן subcellular 5,6,7,8. לוקליזציה subcellular של RNAs הוא מנגנון רגולטורי חשוב 9 שמופיע אצל כמעט כל RNAs 4,10,11. ניתוחים אלה הראו גם כי העותק רבים לא מזוהים על ידי RNA-seq מאותרים בקלות על ידי דגים 8. העיבוד של RNA בחיי עיר הכלאה ללוחות 96-ובכן מאפשר ניתוח של הגנים עד 96 של עניין בכל פעם (צלחות יותר אם נוספים משמשים), ביצוע ניתוח של אלגוריתמית אפשרי. על ידי חיתוך הלוחות למקטעים קטנים יותר, השיטה מותאם בקלות גם רק כמה דוגמאות. פרוטוקול סיפק מתאימה לניתוח של RNA התפלגויות של רוב סוגי רקמות. אמנם לא מוצג, זה וישימה הלא -דרוזופילה רקמות גם כן.

Protocol

1-PCR הגברה של cDNA של פלסמידים תבניות

הערה: להשתמש פלסמיד באיכות גבוהה או DNA שנוצר על-ידי ה-PCR תבניות עבור ה-RNA בדיקה סינתזה. הספריות ג'ין אוסף (DGC) דרוזופילה שנוצר על ידי פרויקט הגנום ברקלי דרוזופילה מעניק כיסוי של רוב הגנים קידוד נמצאו הגנום דרוזופילה (ראה טבלה 1 א). אלה גם מאפשרים את השימוש תחל אוניברסלי עבור ההגברה של כל הוספה cDNA. Amplifications PCR אלה מבוצעות על פלסמיד DNAs נוכח lysates של פלסמיד המכיל חיידקי תרבויות. המוצרים DNA ואז משמשים כתבניות עבור שעתוק במבחנה כדי ליצור antisense RNA רגשים (ראה טבלה 1 ב).

  1. עיצוב תחל כדי להגביר את אזור ספציפי אקסון של גנים של עניין על-ידי ה-PCR (למשל. מ- DNA גנומי), רצוי עם האתר זיהוי פולימראז T7 בקצה antisense.
  2. לניסויים עם דוגמאות פחות מ 96, לחתוך חלקים שאינם נחוצים של 96-ובכן צלחות. לכסות את לוחות עם אטימה קלטת (ראה חומרים) עבור כל incubations ואחסון. אם צינורות microcentrifuge משמשים, התאמת אמצעי אחסון בהתאם.
    הערה: 96-ובכן צלחות לאפשר את השימוש פיפטות רב-ערוצי עבור תפוקה מוגברת, וכן אמצעי אחסון קטן יותר עבור החיסכון בעלויות.
טבלה 1 א

וקטור		 אנטיביוטי
עובד ריכוז 1:1000
תחל		 RNA פולימראז
עבור
antisense		 RNA פולימראז.
עבור
הגיוני
pFLC-אני כח pBst_SK (-) _F/R T3 T7
pBSt(-) כח pBSt_SK(-) T7 T3
pOT2 Chlor pOT2_F/R SP6 T7
pOTB7 Chlor pOT2_F/R T7 SP6
טבלה 1 ב
תחל רצף
pOT2_Forward 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
_Forward pBst_SK (-) 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
pBst_SK (-) תיחה פנימה 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

טבלה 1: A) כללי DGC שיבוט מידע עבור הגברה cDNA מוסיף פלסמידים. B) רצפים של צבעי יסוד אוניברסליים DGC פלסמידים.

  1. 250 לגדול µL של פלסמיד המכיל התרבות חיידקי ב 96-ובכן תרבות הצלחות על-ידי הוספת µL 240 LB המדיה לכל באר עם בחירה נכונה לאנטיביוטיקה (דילול 1:1000 מניה לאנטיביוטיקה 1000 X), 10 µL של המקור פלסמיד המכיל חיידקים (מתוך מלאי גליצרול). חותם עם דבק סלוטייפ לסתימה.
  2. Incubate ע י ניעור-215 סל ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (O/N).
    הערה: צור עותק חדש של גליצרול חיידקי cDNA פלסמיד שיבוט מניות כדי להחליף את המקור. לא להקפיא מחדש מלאי חיידקי המקורי, כמו זה יכול להרוג את החיידקים.
  3. לייצר התבניות PCR, לדלל 10 µL של התרבות חיידקי O/N 90 µL ddH בלוק 2 O בכל טוב של צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. Denature ה-DNA עבור 5 דקות ב 95 ° C ב- thermocycler. מיד במקום את הצלחת על קרח לפחות 5 דק
  4. תגובות PCR להכין באמצעות תחל אוניברסלי המתאים לפי טבלה 2-
< /tr >
ריאגנטים התגובה מדגם 50 μl 96 לערבב היטב
(112 x התגובה)		 הריכוז הסופי
X PCR 2 פולימראז מיקס 25 μl 2800 μl 1 X
Primer_For (25 pmol/μl) 0.5 μl 5 6 μl 0.25 pmol/μl
Primer_Rev (25 pmol/μl) 56 μl 0.5 μl 0.25 pmol/μl
ddH2O 22 μl 2464 μl
48 μl הכולל 5376 μl

בטבלה 2: מיקס מאסטר PCR.

  1. באמצעות פיפטה של, aliquot 48 µL של המיקס מאסטר PCR לתוך כל טוב של צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. להוסיף 2 µL של כל תבנית ה-DNA פלסמיד שפגע בסימני לכל טוב.
    הערה: שימוש בין picogram 1 (עמוד) כדי nanogram 1 (ng) של פלסמיד ה-DNA. תבנית ה-DNA מופרז מפחית את התשואה PCR וספציפיות.
  2. תוכנית המכונה PCR 96-ובכן לפי טבלה 3 ולבצע ההגברה.
    הערה: הזמן סיומת ב-72 מעלות נקבע באמצעות הגודל של המוצר PCR (45 s עבור ≤ 2.0 kb, 1.5 דקות עבור ≤ 3.0 kb, 3 דקות עבור ≤ 4.0 kb ו- 3.5 דקות עבור 4.0-5.0 kb). הטמפרטורה מחזק (Tm) נקבע לפי הרצף של צבעי יסוד. כאשר פריימר הוא שווה או יותר מ 20 nt, ה-Tm מחושבת:
    Tm (° C) = (4 X מספר CG) + (2 X מספר AT)-4.
< td בשורה span = "3" > מחזורים
שלב הטמפרטורה זמן Cycle(s)
95 ° C דנטורציה הראשונית 3 דקות 1 מחזור
הגברה
דנטורציה, חישול והסיומת		 95 ° C שניה 45
54-58 ° C שניה 45
72 ° C שניה 45-3.5 מין
72 ° C סיומת הסופי 7 דקות 1 מחזור
אחסון 4 ° C להחזיק

טבלה 3: תוכנית ה-PCR מומלץ.

    אצטט
  1. PCR משקעים מוצר עם אתנול (EtOH), נתרן (NaOAC) (ראה טבלה 4).
    הערה: אם אמצעי האחסון התגובה PCR µL פחות מ-50, למלא את µL 50 עם ddH 2 O.
    1. כדי לזרז את ה-DNA, לערבב הרכיבים מדגימות בטבלה 4 וחנות O/N ב-20 ° C, או למשך 30 דקות ב-80 °C.Centrifuge את הצלחת 96-ובכן למשך 45-60 דקות ב g x 2,250-סעפת-פיפטה 4 של ° ג שימוש ערוץ 8, ל- carefully להסיר את תגובת שיקוע. תשטוף פעם אחת עם 160 µL קר 70% EtOH (חינם RNase) במשך 30 דקות ב- 2,250 g x-4 מעלות צלזיוס
      הערה: ניתן לראות את ה-DNA precipitated בחלק התחתון של וולס. מוצרי ה-PCR קצר יותר דורשים יותר centrifugations.
    2. בעדינות היפוך על הלוחית 96-ובכן מגבת נייר כדי להסיר את הטיפות האחרונות של נוזל מכל קידוח (ככל האפשר). האוויר יבש DNA גלולה עבור h 1 בטמפרטורת החדר (RT). Resuspend ה-DNA precipitated מים חינם RNase µL 25-
      הערה: 1 h האוויר יבש יאפשר כל עקבות של EtOH מתמוססות. עם זאת, נפח קטן מאוד של נוזלים (בערך µL) צריכים להישאר כל היטב כדי למנוע ייבוש לחלוטין בגדר ה-DNA. השתמש 25 µL לתגובה PCR 50 µL. אין להשתמש מים DEPC מטופלים בשלב זה כדי למנוע הפרעה במבחנה שעתוק בשלבים הבאים-
רכיב אחסון בחלק
ה-PCR 50 μl
100% אתנול 125 μl כרך X 2.5 של ה-PCR
NaOAc ז 3 (ה-pH = 5.2, RNase חינם) 5 μl % 10 כרך של ה-PCR
סה כ 180 μl

בטבלה 4: דוגמה לתגובה PCR 50 µL-

  1. לבדוק את הגודל ואת התשואה של מוצרי ה-PCR על-ידי הפעלת 5 µL של הפתרון דנ א resuspended-ג'ל agarose 1% 1 X טה מאגר.
    הערה: סך של 250-500 ננוגרם של תבנית ה-DNA נדרש עבור התגובה 15 µL במבחנה שעתוק. דגימות עם תשואות גבוהות יכול להיות מדולל יותר. התשואה RNA תלויה גם רצף ואורך תבנית ה-DNA. לפי המדריך הכללי של החפירה-RNA תיוג עם T7 RNA פולימראז, מופק µg כ 10 של התווית על-ידי החפירה RNA מתבנית ליניארית µg 1-

2. במבחנה שעתוק כדי להפיק הגששים antisense.

הערה: חשוב מאוד לעבוד בסביבה נטולת RNase. כל ריאגנטים המעבדה-ware חייבים להיות RNase (כמו מוסמך DNase/RNase חינם וואר פלסטיק)-

-- --- -
רכיב המניות ריכוז אמצעי האחסון ריכוז סופי
ATP100 מ מ7 μl10 מ מ
CTP100 מ מ7 μl10 מ מ
GTP 100 מ מ 7 & # 956; l 10 מ מ
שזור 100 מ מ 4.5 μl מ מ 6.5
החפירה-11-זוג שזור 10 מ מ 25 μl 3.5 מ מ
מים חינם RNase < /td > 19.5 μl
סה כ 70 μl

טבלה 5: הכנת תערובת החפירה-NTP.

< טבלה גבול = "1" fo:keep-together.within-דף = "1" fo:keep-עם-next.within-דף = "תמיד" > רכיב 15 μl תגובה 96 לערבב היטב
(112 x התגובה) סופי conc. מאגר שעתוק של 5 X 3.00 μl 3.00 μl 1 x החפירה-NTP לערבב (10 מ מ) 0.75 μl 0.75 μl 0.5 מ מ RNase מעכב 0.25 μl 0.25 μl 0.67 U / μl RNA פולימראז (T7 או T3 או SP6) 2.00 μl 2.00 μl 2.67 U / μl 1.50 μl RNase מים חינם 1.50 μl 7.50 μl הכולל 7.50 μl

שעתוק טבלה 6:2 X מיקס מאסטר.

  1. להכין החפירה-NTP לערבב לפי טבלה 5-
    הערה: כדי למנוע טעויות, תמיד ליישר את הצלחת כך A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה של הצלחת-
  2. הוסף רכיבים תיאר ב טבלה 6 מכל קידוח לתוך צלחת PCR 96-ובכן חדש (צלחת לווין). להוסיף אחד המתאים. ובכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצי של 7.5 µL של מוצר ה-PCR (תבנית ה-DNA). כיסוי לצלחת עם דבק סלוטייפ לסתימה.
    הערה: הכמות האופטימלית של מוצר ה-PCR הוסיף לכל שעתוק התגובה צריכה להיות בטווח של 0.5 עד 1 µg. אם להקות על הג'ל באופן משמעותי חלש או חזק יותר, ניתן לכוונן את עוצמת הקול של הדנ א להוסיף את התגובה בהתאם. הסכום המדויק אינה קריטית.
  3. דגירה לצלחת לווין ב 37 ° C עבור µL 3.5-4 ח' 15 שילוב של בדיקה מסונתז עם 35 µL של DEPC התייחסו ddH 2 O, 125 µL של 100% EtOH, ו µL 5 של 3 מ' NaOAC (ה-pH = 5.2, RNase חינם). לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות צנטריפוגה ולשטוף כפי שתואר בשלבים 1.10.2 ו 1.10.3.
  4. Resuspend המכשיר precipitated 25 µL של DEPC שטופלו ddH 2 O. לרוץ 5 µL על 1% agarose ג'ל (משך < 20 דקות) כדי לבדוק את תקינות ואת התשואה של המכשיר ( איור 2).
    הערה: הג'ל agarose חייב להיעשות עם DEPC התייחסו ddH 2 O ו טה מאגר. ג'ל אלקטרופורזה המנגנון להקצותם עבור ה-RNA עובדים בלבד. עוד ג'ל ריצה זמן במהירות נמוכה יכול להוביל השפלה RNA במהלך אלקטרופורזה.
  5. לערבב את µL 20 הנותרים של המכשיר מסונתז עם 100 µL הכלאה פתרון (טבלה 7) וחנות ב-80 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    הערה: ריכוז בדיקה יכולה להיות מדולל יותר אם הם חזקים במיוחד (ראה איור 2 לקבלת דוגמאות). הכלאה פתרון יעיל מאוד למניעת זיהום RNase. מיד להוסיף פתרון הכלאה החללית resuspended כדי למנוע השפלה RNA. הכלאה הפתרון חייב להיות מסונן דרך מסנן 0.2 µm. עבור דגימות רקמה, להעלות את ריכוז דטרגנט בפתרון הכלאה על-ידי הוספת טריטון-X-100 ריכוז סופי של 0.3%-
רכיב אחסון הריכוז הסופי
DEPC טיפול ddH2O 11.85 ml 23.7%
האס X 20 מ"ל 25% (5 X)
Formamide מ 25 ל 50%
הפרין (50 מ"ג/מ"ל) 0.1 מ"ל 0. 2% (0.1 mg/ml)
זרע סלמון DNA נטושים בודדת 0.5 ml 1.0%
Tween-20 מ"ל 0.05% 0.1%
50.00 ml סה כ 100%
< p class = "jove_content"fo:keep-together.within-דף ="1"> טבלה 7: פתרון הכלאה.

3. אוסף רקמת גידול של העובר, זחל, מבוגר דרוזופילה.

הערה: בקנה מידה קטן (בקבוקים) והן מסה (תיבות) לטוס לגידול, להשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים מעבדה לעוף על מזון קמח תירס מבוסס על 25 מעלות צלזיוס לשמור מתאים למבוגרים, זחל צפיפות, מספקים אבקת שמרים פעילים נוספים על מזון משטחים.

  1. לאסוף העוברים בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. הצעדים העיקריים של העובר אוסף מומחשים איור 3-
    הערה: לאחר שטיפה devitillinized עוברי, מתנול, העוברים קבוע ניתן לאחסן ב-20 ° C עד שנה אחת. העובר permeabilization, קיבוע שאחרי המבוצעות היום 1 של פרוטוקול דגים.
  2. הכן טרי 40% PFA מניות פתרון.
    1. הכן טרי פתרון מניות של 40% paraformaldehyde (PFA) על ידי ערבוב 10 מ"ל של DEPC התייחסו ddH 2 O ל- 3.68 g של כדורגלן, µL 70 של 2N KOH בבקבוקון זכוכית 20 מ"ל נצנוץ המכיל אנחנו חיים מערבבים קטן
      התראה: PFA רעיל מאוד עם פוטנציאל השפעות בריאותיות כרוניות וחמורות. לקרוא MSDS (חומר בטיחות גליונות נתונים) ולהשתמש עם הגנה ראויה על העיניים, העור, מערכת הנשימה-
    2. בשכונה fume, מחממים ומערבבים את המבחנה למשך 3-5 דקות על צלחת חימום ב 200 ° C עד התפרקה לחלוטין מחברים. להסיר הפתרון מניות PFA מהאש ברגע מחברים מפורקת (לא לחמם יותר מדי).
    3. מגניב את הפתרון מניות של כדורגלן 40% מומס על קרח למשך 5 דקות, ולסנן עם מזרק מסנן ו 10 מ ל 0.2 µm.
  3. Instar השלישי הזחלים (L3) או קיבוע הרקמה למבוגרים, מרווה, permeabilization
    הערה: פרוטוקול זה אמור להסתיים ביום אחד. הוא כולל רקמות לנתיחה, קיבוע, להרוות HRP אנדוגני, permeabilization, קיבוע שאחרי. פתרונות תיקון
    1. הכן (תיקון-I ו- II-תיקון) לפי טבלה 8.
      הערה: חומצה Picric משמש לשבועיים נוספים כאשר רקמות יש מבנה עדין שחייבים להשמר. זה לא מקבע טוב כאשר רקמת ultrastructure חייב להישמר עבור מיקרוסקופ אלקטרונים (EM).
      אזהרה: חומצה Picric לא יציב ויש לו את היכולת להגיב עם חומרים אחרים וליצור תרכובות חומר נפץ. השתמש ואחסן לפי הנחיות בטיחות.
    2. המקום הזחלים או הזבוב הבוגר של צינור פלסטיק 50 מל המכילה 10 מ"ל של קר 1 X PBS ו 100 µL של תיקון-אני הפתרון. הרגעה על קרח למשך 2 דקות להפחית את תנועתיות לטוס זחל או למבוגרים-
    3. לחתוך את הקצה של טיפ 1 מ"ל פלסטיק כדי ליצור פתח 2-3 מ מ. להעביר 10-30 הזחלים או מבוגר טס עם קצה 1 מ"ל לתוך צלחת פטרי (קוטר 9 ס מ) עם שכבה שטחית של 1 X PBS מהצינור 50 מ ל (שלב 3.3.2). הוספת קצת PBTT יכול להפחית מתח. בזהירות לנתח זחל (פתח קדמי וסוחטים רקמות מן האחוריים כדי קדמית) או רקמות בוגרות עניין עם זוג מלקחיים חדה תחת טווח ויבתר.
      הערה: בערך 200-300 הזחלים או האשכים למבוגרים יכולים להיות גזור ותוקנו ביום אחד על ידי אנשים מנוסים.
    4. העברת גזור רקמות עם פיפטה 200 µL (עם קצה מנותקים כדי ליצור בקוטר 2 מ מ פתיחה) לתוך צינור 1.5 mL החנות על קרח. להשלים את כל הסיבוב של ביתור בתוך 10-15 דקות לפני מתקדם לשלב הבא.
      הערה: המשך עם סיבובים נוספים (בתוך חלון הזמן 2 h) כפי הנדרש להפקת חומר מספיק.
    5. תיקון רקמות עם 800 µL של תיקון-אני פתרון במשך 30 דקות על הספסל מערבל העליון. רקמות שטיפה פעם עם 800 µL 1 X PBTT ולשמור צינורות בקרח לתקופה מקסימלית של 2.5 ח' עקב 30 דקות להגביל, צריך להתבצע batch-wise עד רקמה מספקת נאסף.
    6. מאגר לכל רקמות ביתור וקבוע לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל יחיד המכיל רשת במכסה (ראה איור 4 לעיצוב tube). האחות עודף נוזל מבעד לרשת במכסה שפופרת. רחץ 3 X 5 דקות כל אחד עם 10 מ"ל של 1 X PBTT. לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של PBS 1 X כדי להסיר דטרגנט. הדבר מונע בועות העודפים בשלב הבא.
      הערה: אם רקמות ביתור לשקוע לתחתית הצינור, השלבים ניתן לבצע גם צלחות microtiter רגיל או 0.5-1.5 mL microcentrifuge צינורות (300-800 µL נפח למחזור).
    7. להרוות אנדוגני HRP פעילות עם 5 מ של 0.3% H 2 O 2 ב- PBS למשך 15 דקות ב- RT. אני חוזר עוד פעם. להשאיר את המכסה פתוח במהלך שלב זה ללא ערבוב. יש לשטוף פעמיים באמצעות 10 מ"ל של 1 X PBTT. תשטוף פעמיים במשך חמש דקות עם 10 מ של 1 X PBTT.
    8. Permeabilize רקמות עם 10 מ"ל של 80% אצטון (-20 ° C, טרום מקורר) ב-20 ° C עבור 10 דק ' היפוך ' הצינור פעמיים במהלך תקופת הדגירה. תשטוף פעמיים במשך 10 דקות עם 10 מ"ל של PBTT X 1 כדי להחזיר נוזלים ברקמות.
      9. פתרון
    9. שטיפה עם 10 מ"ל תערובת של הכלאה PBTT פלוס 5 מ ל מ ל (1:1). למחוק את תמהיל ולהחליף עם פתרון הכלאה 10 מ"ל. דוגמאות ניתן לאחסן ב-20 ° C עד שהוא נדרש. לקבלת תוצאות מיטביות, אל תאחסן דגימות יותר משבוע.
רכיב לתקן לי (10 מ"ל) לתקן את השני (10 מ"ל)
מניות PFA 40% 1 מ"ל 1 מ"ל
PBTT מ"ל 8.99 9 מ ל
חומצה Picric פתרון 10 μl –
< p class ="jove_conte nt"fo:keep-together.within-דף ="1"> טבלה 8: פתרונות לתיקון רקמות.

4. הכלאה בחיי עיר

הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש מינימום של 2 ימים, עם הכנת הדוגמא, הכלאה קדם הכלאה לוקח מקום על זיהוי 1, בדיקה היום על יום 2. אם מספר דוגמאות הוא גבוה יחסית, אם לא מוכר עם הפרוטוקול, או יום שלם אינה אפשרית, הפרוטוקול צריכה להתבצע תוך שלושה ימים עם השלבים של בדיקה וזיהוי אותות הגברה מחולק ל 2 ימים. מספרים גדולים של העוברים או דגימות רקמה ביתור עשויים גם לדרוש ימים נוספים כדי לעבד. עבור דגימות רקמה גזור, להחליף 1 X PBT 1 X PBTT של כל השלבים, אלא אם צוין אחרת. ? הנוזל נוסף נדרש עבור חדירה של רקמות זחל ומבוגרים רבים, כגון המוח ואת testis. אף 1 לא נבדק, ניתן להשתמש X PBTT גם עבור עוברי. השתמש 100 µL לכל טוב צלחות 96-ובכן, µL 800 עבור צינורות 1.5 mL-

  1. הכלאה קדם, הכלאה
    הערה: השלבים 4.1.1-4.1.6.2 הן עבור העובר בחיי עיר הכלאה. עבור רקמות זחל או למבוגרים בחיי עיר hybridizations, דלג על שלבים אלה.
    1. להסיר 2 מ"ל של העוברים קבוע (המאוחסן מתנול ב-20 ° C) אל צינור 15 מ"ל. רחץ עוברי פעמיים במשך 7 דקות עם 10 מ"ל של מתנול לשטוף כל. ווהsh העוברים על 7 דקות עם 10 מ"ל תערובת של מתנול X 1 PBTT (1:1). לשטוף את עוברי פעמיים במשך 7 דקות עם 10 מ"ל של PBTT X 1 כדי להחזיר נוזלים.
    2. עבור העובר permeabilization, להכין פתרון ביניים proteinase K (40 µL/mL) על ידי דילול שבערך מהפתרון מניות (20 מ"ג/מ"ל). חנות ב-20 ° C. הופכים את הפתרון proteinase K עובד על ידי דילול הפתרון ביניים proteinase K-1/15 ב PBTT X 1 עבור ריכוז העבודה הסופית של ug 2.667/mL.
    3. Permeabilize עוברי עם 10 מ"ל של עובד פתרון proteinase K (שימוש פחות עבור מספר קטן יחסית של העוברים). דגירה הצינור ב RT עבור 13 מינימלית בעדינות היפוך הצינור 4 פעמים במהלך הדגירה. דגירה הדגימות בפתרון proteinase K על קרח לשעה ללא ערבוב.
      הערה: זו דגירה ארוך יחסית עם שתדללו proteinase K מבטיחה permeabilization reproducibly אחיד ולא מכתים עוקבות.
    4. בעוד עוברי permeabilize, להפוך 2 מ"ג/מ"ל גליצין פתרון מ X 10 מניות (20 מ"ג/מ"ל) ב 1 PBTT X עבור הנפח הכולל של 30 מ ל-
      5. פתרון
    5. הסר proteinase K, לשטוף עם 10 מ"ל של גליצין פתרון (2 מ"ג/מ"ל) ולשטוף פעמיים למשך 2 דקות כל אחד. לשטוף שלוש פעמים עם 10 מ"ל של PBTT 1 X כדי להסיר את גליצין.
    6. קיבוע שאחרי של העוברים.
      1. להכין 10 מ"ל של 4% מחברים (1 מ"ל של 40% מחברים ב 9 מ של PBTT, מסונן דרך מסנן מיקרומטר 0.45).
      2. דגירה בדגימות ב 4% מחברים עבור מינימלית 20 X 3 שטיפת למשך 2 דקות עם PBTT.
      3. להכין פתרון שפגע בסימני הכלאה, מרתיחים את הפתרון הכלאה במשך 5 דקות. לשימוש צלחת מלאה 96-ובכן, שלושה צינורות של 12 מ. מגניב על הקרח מיד עבור 5 דק
      4. שטיפה עוברי פעם אחת עם 10 מ"ל של 1 X PBTT: הכלאה פתרון (1:1). לשטוף פעמיים עם 5 מ של הכלאה פתרון. Aliquot µL ~ 20 לכל טוב של התיישבו עוברי (30-40 עוברי) או קבוע רקמות לתוך צלחת PCR 96-ובכן על קרח. הסרת פתרון הכלאה רקמות או עוברי באמצעות פיפטה סעפת של ערוץ 8 ( איור 1 / וידאו).
        הערה: יש פיפטה סעפת ‘ להפסיק ’ שמונע את הטיפים מ שוקעים הבארות והסרה של הדגימה. לניסויים באמצעות רקמות שצפים, להסיר את נוזלי בזהירות עם פיפטה 100 µL מלמעלה.
    7. µL להוסיף 100 של הכלאה שפגע בסימני לפתרון כל טוב. מראש hybridize עוברי למשך תקופה מינימלית של 2.5-3 h ב 56 ° C באמצעות יחידת חימום לאמבטיה יבשה המכיל חרוזי מתכת (ראה חומרים, איור 1).
      8. . בדיקת
    8. denature 100 µL של התוכנית בצלחת PCR 96-ובכן באמצעות thermocycler עבור 5 דקות-80 ° C. מיד מגניב על קרח למשך 5 דקות הסרת פתרון הכלאה קדם עוברי או רקמות. להוסיף שפגע בסימני הגששים גנים ספציפיים לכל אחד לטעום, לכסות עם דבק סלוטייפ לסתימה, hybridize ב 56 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h O/N, תחת חרוזי מתכת באמבט יבש חימום ההוראה

5. בדיקה לזיהוי

  1. לחמם את הפתרונות טבלה 9 ביחידת חימום 56 ° C. להסיר את הגששים מהצלחת.
    הערה: רגשים יכול לעשות שימוש חוזר בין 2 - 3 פעמים אם מאוחסנים ב- 80 ° C (לא החנות RNA כל דגימות ב-20 ° C). לאחר הכלאה, הרנ א נטושים זוגי יציב יותר סטרנד יחיד RNA, ויש פחות רגישים השפלה הנגרמת על ידי זיהום RNase.
    אם משתמש מערכת סינון ואקום צלחת רב טוב בשביל לרקמות, יש לכלול צלחת אוסף כתשר מסנן כדי לאסוף את הגששים (ראה וידאו עבור מכלול הפרטים). רקמות hybridized יהיה צורך ניתן להעביר את הצלחת microtiter 96-ובכן קבוע המשמש הכלאה אחת עם 1.2 מיקרומטר נקבובית גודל PVDF ממברנות על החלק התחתון של כל טוב.
< t r >
שלב טרום חימם פתרון (56 ° C) זמן נפח לכל טוב
הכלאה פתרון: PBTT (3:1) 1 15 דקות 100 μl
2 הכלאה פתרון: PBTT (3:1) 15 דקות 100 μl
הכלאה פתרון: PBTT (1:1) 3 15 דקות 100 μl
4 הכלאה פתרון: PBTT (1:3) 15 דקות 100 μl
5 שוטף PBTT 3 5 דקות 100 μl

טבלה 9: שטיפת הגששים לאחר הכלאה.

  1. , אם באמצעות לוחות נורמלי, שטיפת דוגמאות לפי טבלה 9 ביחידת חימום-56 ° C. אם באמצעות מערכת סעפת ואקום, להשתמש בפתרונות מחוממת עם מערכת ואקום על הספסל ולהסיר את הפתרונות מיד מהנשיאות מתחת על-ידי vaccuum. לאחר לשטוף את השלישי עם 1 X PBTT, ניתן להסיר את הצלחת נורמלי מן החימום ההוראה
  2. הכנת נוגדנים.
    1. 11 להכין מ"ל של נוגדן ראשוני פתרון (2.5 µg/mL) במלאי (1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול נוגדן אנטי החפירה monoclonal העכבר מצומדת ביוטין (ראה רשימת חומרים) ב- PBTTB (1:400). אם עיבוד הדגימות פחות, התאמת אמצעי אחסון בהתאם.
    2. 11 להכין מ"ל של streptavidin-HRP פתרון (1 µg/mL) במלאי (1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול 1:1000 streptavidin-HRP נזווג (ראה רשימת חומרים) ב- PBTTB. אם באמצעות דגימות פחות, התאמת אמצעי אחסון בהתאם.
  3. לחסום עוברי או רקמות עם PBTTB (חלב רזה 1% 1 X PBTT) במשך 20 דקות על הספסל העליון מיקסר-RT.
    הערה: מסנן PBTTB באמצעות נייר סינון (כיתה 3, 6 מיקרומטר) לפני השימוש בו על צלחות 96-ובכן מסנן כדי למנוע סתימת מסנני ' '. במקום PBTB, PBTTB (PBTB עם נוספים 0.3% טריטון-X-100) משמש לרקמות כל במהלך הפרוטוקול.
  4. Incubate עוברי או רקמות בפתרון נוגדנים (100 µL טוב) כבר שעתיים על הספסל-העליון מדגם מיקסר. לשטוף פעמיים עם 1 x PBTTB. לשטוף 3 X עבור 5 דקות ו- 5 X 10 דקות עם PBTTB. דגירה עוברי או רקמות עם streptavidin-HRP פתרון (100 µL טוב) h 1.5 באמצעות מערבל מדגם ספסל-העליון. לשטוף 2 X עבור 5 דקות עם PBTTB. לשמור דגימות בחושך מנקודה זו על.
    הערה: במהלך כל נוגדן שוטף, אם הרקמה הוא אובדן עקב אטימות המיוצר על ידי החלב, נסה כביסה בלי החלב (PBTT במקום PBTTB).
  5. להכין פתרון דאפי-100 המדללת X DAPI ב PBTTB (1: 100).
  6. Incubate עוברי או רקמות עם פתרון דאפי (100 µL טוב) למשך 15 דקות על מערבל מדגם ספסל-העליון. לשטוף 4 X 10 דקות עם PBTT. לאחסן את הצלחת 96-ובכן עם דגימות O/N ב 4 ° C או להמשיך לשלב הבא.
    הערה: ההליך אפשר לעצור כאן.

6. זיהוי נוגדנים באמצעות tyramide (ראה איור 5)

הערה: כאן תוצרת בית cyanine מצומדת 3 tyramide שימש, אשר הוכן לפי הפרוטוקול המתואר 12 . אם ביצוע ניסויים רבים או בדיקות דגימות רבות, פעולה זו שומרת את כמות משמעותית של כסף יעיל לעומת ריאגנטים מסחרי (מניסיון). עבור פחות ניסויים ודוגמאות, ניתן להשתמש cyanine זמינים מסחרית 3-tyramide (ראה חומרים).

  1. לדוגמה שטיפת צלחות 3 X עבור 5 דקות עם 1 X PBTT.
  2. הכנת tyramide הפעלת מאגר (הפעלת מאגר) המכיל 0.006% 2 O H 2 ב- PBTT (שתדללו 30% (w/w) H 2 O 2 מניות 1:5000).
    3. < lאני > לשטוף הצלחות עם מאגר הפעלה.
  3. הכנת cyanine 3-tyramide פתרון על ידי דילול זה הפעלת מאגר בשפופרת 15 מ"ל.
    1. לשימוש העוברים, דילול 1:80 (137 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). בשביל לרקמות זחל, להשתמש 1:150 דילול (73 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). לשימוש למבוגרים האשכים, דילול 1:200 (55 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). לשימוש למבוגרים שחלות, 1:300 דילול (36 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר).
  4. דגירה דגימות עם cyanine 3-tyramide פתרון 2 h על הספסל-העליון מדגם מיקסר. לשטוף ארבע פעמים עם PBTT. לשטוף 6 X 10 דקות עם PBTT. לשטוף X 3 עבור 5 דקות עם PBS להסיר את הנוזל.
  5. µL להוסיף 150/טוב של אנטי-עמעום הרכבה מדיה. לשמור דגימות O/N ב 4 ° C כדי לאפשר לרקמות או עוברי לשקוע לתחתית הצינור. הר דוגמאות על שקופיות מיקרוסקופ (תחת לנתח טווח לרקמות) ולכסות עם coverslip. לאטום את הקצוות של coverslip עם לק שקוף.
  6. התמונה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
    הערה: לנתח שליטה שלילי קודם כדי לקבל מושג על ‘ שאינם ספציפיים ’ רקע.

Representative Results

איור 6 מציג דוגמאות של התוצאות המתקבלות באמצעות הליך זה. הלוחות 3 העליון להראות דוגמאות של עוברי דרוזופילה מוקדם (איור 6, לוחות A-C), 3 הבא מראות דוגמאות של המנוח עוברי דרוזופילה עם אותות ברקמות שונות (amnioserosa, השרירים, מערכת העצבים המרכזית, בהתאמה (איור 6, לוחות D-F). הבא דוגמאות מ-3 לחלל זחל רקמות (איור 6, לוחות G-J). K ו- L מראות להחליפן בתמונות של בלוטות המין למבוגרים (השחלה ואת testis, בהתאמה). יש מאות תמונות שהועלו, מבואר ב שלנו ניתן לחיפוש 'פלורסנט בחיי עיר זבוב הפירות מסד' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

Figure 1
איור 1. קווי המתאר של פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דגים) פרוטוקול ומפתח מכשור. (א) PCR הגברה של cDNA. (B) במבחנה שעתוק כדי ליצור גנים ספציפיים antisense החפירה - תוויות RNA הגששים בצלחת 96-ובכן (צילום של צלחת שמוצג b). (ג) ו- (D): מבוגרים (נקבה: יחס זכר 2:1. 300-400 זבובים/בקבוק) זבובים מותר להזדווג במשך 3-4 ימים. העוברים של אוסף לילה על תקן קמח תירס מזון 25 ° c מועברים קופסת פלסטיק מאוורר היטב (1 ליטר של קמח תירס מזון במיכל בגודל: 8 "X 8" 3" LWH) או בקבוקים חדשים, שמירה על צפיפות זחל נאותה. אוסף רקמה, אבקת שמרים פעילים צריך להיות התיז על האוכל-24, 48 שעות לאחר הנחת (AEL) ביצה. (E עד H): פלורסנט בחיי עיר הכלאה ניסויים שבוצעו על פני 3 ימים רצופים. עבור עוברי או רקמות שצפים לא, השתמש צלחת PCR 96-ובכן כפי שמוצג ב' תצלום עם העצמות ערוץ 8 (תצלום c). בשביל לרקמות שצפים, כמו רוב רקמות זחל, להשתמש צלחת עם תחתית מסנן (צילום ברה) והסר נוזל מלמטה עם העצמות סעפת באמצעות לחץ נמוך (צילום ב- e). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. קביעת התשואה בדיקה RNA. לאחרונה מסונתז הגששים antisense RNA מובחנים ג'ל agarose 1% (5 µL lane). התשואה יכולים להיות מסווגים (מבוסס על האינטנסיביות של הלהקה) 'תשואה נמוכה' הנמצאים בסמטאות 3 ו-10, 'תשואה טיפוסי' הנמצאים בסמטאות 1, 4, 5, 6 ו 8 או 'תשואה גבוהה' הנמצאים בסמטאות 2, 7, 9, 11 ו- 12. לשימוש דגימות עם 'טיפוסי תשואות', 10-15 µL של בדיקה מעורבבת עם µL 100 של הכלאה פתרון עבור ניסוי ב באתרו . לדלל דגימות עם 'תפוקה גבוהה' של המכשיר עם פתרון הכלאה נוספים עם הלהקה כמות יחסית עוצמת 'אופייני בדיקה'. שואפים יש ריכוזים שווים בדיקה סופית מכל קידוח. החץ מצביע על אחד "הגששים RNA,' הלהקה גבוה יותר על כל ליין היא תבנית ה-DNA המקורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. רס ן צעדים אוסף העובר בקנה מידה גדול, קיבעון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. צינור תוצרת בית הסרת נוזל לרקמות זחל או צף. ממחטה זחל ומבוגרים מרחף בתמיסה במהלך קיבעון. כלי פשוט זה מורכב רשת ניילון מוחזק על ידי µL 200 לחתוך עצה, ואחריו טיפ 1 מ"ל בתור מתאם להתחבר העצמות. נוזל ניתן להסיר בבטחה מבלי לאבד את כל רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. הגברה של האות Tyramide. (1) לחפור התווית על-ידי בדיקה antisense RNA hybridizes בחוש אנדוגני RNA. (2) כריכת חיסונית-זיקה בין נוגדן ראשוני מצומדת ביוטין החפירה-UTP. (3) HRP מצומדת ביוטין איגודים streptavidin. (4) HRP מזרז את cyanine 3-tyramide, מימן על-חמצני התגובה כדי ליצור רדיקלים 3-tyramide cyanine קצרת ימים. (5) cyanine 3-tyramide רדיקלים לאגד טירוזין שאריות על חלבונים הסמוכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6. נציג בחיי עיר הכלאה תמונות. כל לוח מראה דוגמה של RNA שונים (מוצג בציאן) ואת הגרעינים צבעונית עם דאפי (מוצג בצבע אדום). (א-ג) דוגמאות עוברי דרוזופילה מוקדם. (D, F) דוגמאות מאוחר עוברי דרוזופילה . (G-J) דוגמאות של 3 instar רקמות זחל דרוזופילה (malphigian בקוריאנית, פיתול, בלוטות ושרירים בהתאמה). (K) השחלה למבוגרים. (יב) למבוגרים testis. כל לוח מציג את השם של הגן זה המכשיר הוא hybridizing ל. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול המתואר מספק שיטה לשחזור מאוד, רגישה, וחסכוני עבור הגילוי של RNAs רוב קבוע עוברי דרוזופילה או רקמות. למרות מעט יותר מסובך ממה יותר השתמשו באופן מסורתי phosphatase אלקליין בשיטה של בדיקה לזיהוי, הרזולוציה מתקבל על ידי דג גדול בהרבה, והוא הרגישות דומות או משופרת 7,8. באמצעות לוחות שלמים או חלקיים microtiter, הפרוטוקולים יכול לשמש עבור ניתוחים בקנה מידה גדול או מוגבלת של הגנים של עניין. יצוין כי הגששים שנוצר עשוי לזהות את כל או אחוי התעתיק מספר טפסים אלא אם הגששים נועדו יותר במיוחד (קרי, exons יחיד). למרות בדקנו הגששים קטן כמו נוקלאוטידים 200 עם הצלחה סבירים, הגששים קטנים נוטים להיות פחות יעיל, וייתכן שהוא פחות ספציפי. . בבירור, פרוטוקול זה אינו מתאים עבור זיהוי אינטרונים קטן, exons, או מעובד מיקרו Rna.

למרות גישה זו משתמשת צעד אנזימטי כדי להגביר את עוצמת האותות, עוצמת אות מופיעה כדי להיות פרופורציונלי היעד גנים במגוון יחסית לינארית ורחב של רמות הביטוי. בהגדלה גבוהה יותר, האות נתפסת puncta או ספאקלס בתוך תאים ורקמות. עבור תעתיקים נדירים יחסית נראים רק כמה puncta זעירים. התעתיק שפע גודלת, אלה גדלים מספר וגודל. כמו עם מולקולה בודדת דגים (smFISH), puncta קטן יחיד יתאימו גם ל- RNAs יחיד, צריך גם להיות ברצון לכמת באמצעות תוכנת הדמיה ואינפורמטיקה. השוואות של תמונות שפורסמו שהושג באמצעות smFISH עם תמונות כי לנו יש מספר פעמים עבור המטרות אותן מציע כי בסך הכל, רגישות ורזולוציה של שתי השיטות דומים יחסית, למרות זה צריך להיבדק על ידי השוואות קפדנית יותר. בהתחשב את חשבון גבוה יותר של smFISH, פעולת השירות שסופק כאן צריך לתת תוצאות דומות בכל חלק של העלות. עם זאת, אם המטרה היא לזהות תעתיקים קטן, או חלקים ברורים של הפרוטוקולים, מומלץ smFISH.

בשל גודל קטן יותר של הגששים דגים מסוימים, שיטה זו עשויה גם להיות יותר החודר לרקמות גדולים, או מכשולים משמעותיים. עם זאת, השימוש רמות גבוהות דטרגנט וצובטת רקמות קיבוע ו permeabilization מופיעים פתר בעיה זו. בסופו של דבר, למרות שפותח דרוזופילה לרקמות, המאגרים דטרגנט גבוהה המתוארים כאן בשביל לרקמות ביתור צריך גם לעבוד עבור עוברי דרוזופילה וכן רוב אחרים אורגניזמים ורקמות.

Disclosures

לעורכים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על ידי מענק כדי HMK על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק 133473 סמרטוט).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB15-500 Certified DNase and RNase free
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) Biomart (Canada) 141106-1K Certified DNase and RNase free
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB50-500 Certified DNase and RNase free
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane EMD MILLIPORE MSBVS1210 Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues
96-well PCR plate (200 μl) Denville C18096-10
Acrodisc syringe filter (0.2 u) PALL PN4612
Acrodisc syringe filter (0.45 u) PALL PN4614
Agarose Bioshop AGA002.500
AXYGEN 96-well assay storage plates UltiDent Scientific 24-P96-450V-C To store bacterial glycerol stocks
AXYGEN Aluminum Plate Seals UltiDent Scientific 24-PCR-AS-200 To seal plates
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) UltiDent Scientific 24-T205-WB-C To transfer samples
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin Jackson ImmunoResearch Lab 200062156 Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution.
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) BrandTech Scientific Inc. 704526 To remove liquids from the top of 96-well PCR plates
Chloramphenicol Sigma-aldrich C1919 Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) Home made Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) Sigma-aldrich D2522 Antifade reagent in mounting media
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Roche 11-209-256-910
Embryo collection cage Home made N/A Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate
Eppendorf centrifuge 5804 Eppendorf Model 5804 Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor
Formamide Bioshop FOR001.500
Glycerol Bioshop GLY002.4
Glycine Bioshop GLN001.500
Heparin Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution
Lab Armor Beads DiaMed LAA42370-001 Fill in heating unit
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer Fisher Scientific 50-998-347 Sample mixing
Mesh - 100 micons FlyStuff 57-103 For collecting embryos
Mesh - 800 microns SEFAR - Nytex 06-780/53 For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.
Micro Cover Glasses VWR 48366-067 Size: 22 X 22 mm
Micro slides,frstd VWR 48312-003 Size: 25 X 75 mm
Multi-Well Plate Vacuum Manifold Pall Corporation P/N 5017 Remove liquid from bottom of 96-well filter plate
Paraformaldehyd (PFA) Bioshop PAR070.500 Fixation
PCR machine Bio-Rad Model: DNA Engine PTC-200 96-well plate PCR and probe denature
Picric acid solution Sigma-aldrich 80456 For tissue fixation I solution
Potassium Chloride (KCL) Bioshop POC308
PP lid for 96-well plates, 100/case UltiDent Scientific 24-P-LID-PP Lid for storing plates
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) UltiDent Scientific 825-1-50-5S Liquid handling
Progene Pierceable Aluminum Foil UltiDent Scientific 87-CFILM-AL Seal 96-well plate, DNase and RNase free
Proteinase K Sigma-aldrich P2308- 5MG Embryo permeabilization
RiboLock Ribonuclease Inhibitor Thermo Scientific EO0381 40 Unit/ul
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set Roche 11277057001 RNA probe sythesis
RNase free water GIBCO 10977015-500ml RNA probe sythesis
RNaseZap Ambion AM9780 Remove RNase contamination
Single stranded DNA from salmon testes Sigma-aldrich D9156 For hybridization solution
Skim milk (non fat power) Bioshop SKI400.500 Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) Bioshop SAA333 Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation
SP6 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0131 20 Unit/ul
Stainless Steel Shot for Sand Bath VWR 13259-274. To fill the heating unit
Stereomicroscope & gooseneck light source Leica Model: MZ6 Tissue dissection and mounting
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate Molecular Probes S911 Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ.
T3 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0101 20 Unit/ul
T7 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0111 20 Unit/ul
Tip station (10 ul) Axygen T-300-STK-S Certified DNase and RNase free
Tip station (200 ul) Sorbio 27770T Certified DNase and RNase free
Tips ( 1ml) Sorbio 10200 Certified DNase and RNase free
TRITON X-100 Bioshop TRX506 Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ
Tween 20 Bioshop TWN510 Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 Sigma-aldrich WHA1003917
Name Company Catalog Number Comments
Solutions Preparation
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C
1 X PBT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)
1 X PBTT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)
1 X PBTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBT
1 X PBTTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
  4. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  5. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
  6. Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
  7. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
  8. Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
  9. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  10. Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
  11. Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
  12. Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).

Tags

גנטיקה גיליון 128 RNA לוקליזציה subcellular פלורסנט היברידיזציה דג דרוזופילה תפוקה גבוהה הגברה של האות tyramide העובר רקמות.
ברזולוציה גבוהה פלורסנט <em>בחיי עיר</em> הכלאה של עוברי <em>דרוזופילה</em> ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R.,… More

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter