Summary
البروتوكول الحالي وصف أسلوب التي المستخدمين يمكن الحفاظ على استمرارية الأعمال التحضيرية شريحة هيبوكامبال والقشرية الحاد أثناء جمع البيانات الرنين المغناطيسي المجهري.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول الإجراءات الضرورية لدعم الوظائف الأيضية الطبيعية للدماغ الحادة شريحة الأعمال التحضيرية أثناء جمع البيانات مجهرية الرنين المغناطيسي (السيد). في حين أنه من الممكن لأداء مجموعات السيد في أنسجة الثدييات الحية، وقصت، هذه التجارب وقيدت تقليديا بحدود القرار وهي بالتالي عاجزة عن تصور الأنسجة المجهرية. على العكس من ذلك، السيد البروتوكولات التي تحقق دقة الصورة المجهرية تقتضي استخدام عينات الثابتة تلبية الحاجة لشروط ثابتة، لا تتغير خلال أوقات طويلة المسح الضوئي. البروتوكول الحالي يصف الأسلوب الأول السيد المتاحة التي تمكن من تصوير عينات الأنسجة الحية، والثدييات في قرارات مجهرية. هذه البيانات ذات أهمية كبيرة لفهم كيف المستندة إلى علم الأمراض التباين التغيرات التي تحدث في تأثير المستوى المجهري محتوى العيانية السيد المسح مثل تلك المستخدمة في العيادة. ويتحقق مرة واحدة مثل هذا فهم، أساليب التشخيص بحساسية ودقة أكبر يمكن تطويرها، التي سوف تترجم مباشرة إلى علاج الأمراض السابقة ورصد العلاج أكثر دقة وتحسين نتائج المرضى.
بينما وصف المنهجية تركز على الاستعدادات شريحة الدماغ، البروتوكول قابلة للتكيف لأي شريحة الأنسجة قصت نظراً إلى أن يتم إجراء تغييرات في الإعداد بيرفوساتي والغاز لتلبية احتياجات ايضية محددة في الأنسجة. ينبغي أن يؤدي التنفيذ الناجح للبروتوكول الأعمال التحضيرية شريحة العيش، الحاد الذي يحمل السيد نشر إشارة الاستقرار لفترات تصل إلى 15.5 ح. المزايا الأساسية للنظام الحالي على أجهزة التروية متوافق مع السيد الأخرى هي توافقه مع أجهزة الفحص المجهري MR اللازمة لبلوغ أعلى الصور ذات الدقة والقدرة على توفير تدفق مستمر ودون انقطاع مع بعناية شروط بيرفوساتي الخاضعة للتنظيم. عينة انخفاض الإنتاجية نظر مع هذا التصميم كما قد تصويرها شريحة نسيج واحد فقط في كل مرة.
Introduction
كما نظم التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) تقدمت باطراد إلى مواطن القوة الميدانية أعلى من أي وقت مضى، أصبحت ملحوظة مزيد من التفاصيل حول تكوين وحالة الأنسجة الحية. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه الأجهزة، لا تزال غير متوفرة في العيادة MR التصوير بدقة كافية لتصور الهياكل الخلوية للأنسجة. كنتيجة لذلك، يجب أن يمكن استنتاج خصائص المستوى الخلوي للأنسجة عند النظر في مضمون عمليات الفحص السريري. يتطلب مثل هذا الاستدلال معرفة عمليات المماثلة التي استقاها من البيانات المأخوذة في النظم النموذجية التي يمكن ملاحظتها مباشرة. تقليديا، شملت هذه النماذج الخلايا من الكائنات المائية مثل البويضيه ليفيس النمو و كاليفورنية Aplysia L7 العصبية1،2. كانت هذه من بين الخلايا الحيوانية الأولى المتاحة للمراقبة مع أساليب السيد بسبب حجمها الكبير يظهر: حوالي 1000 ميكرومتر و 300 ميكرومتر القطر، على التوالي. في الآونة الأخيرة، قد أتاح التقدم في تصميم الأجهزة لواحد من أكبر الأمثلة على خلايا الثدييات – α-العصبون – تصويرها باستخدام تقنيات الفحص المجهري السيد على الأنسجة الثابتة3،4. في حين أظهرت هذه الدراسات التصور المباشر للمواد الخلوية الثدييات استخدام السيد، عينات الثابتة المستخدمة تختلف إلى حد كبير في خصائصها السيد من الأنسجة الحية ولا يمكن أن تكون بمثابة وبالتالي نموذج تمثيلي يعادل5، 6. الأهم من ذلك، مراقبة السيد التباين التغيرات التي تحدث في الحفل مع العمليات البيولوجية المعقدة يتطلب العينات الحية التي يمكن قلق وقياس مدى التجربة التصوير.
تيسير السيد دراسات مجهرية في الأنسجة الحية، يرد بروتوكول الذي يشمل ميكرويماجينج التجارية الأجهزة7 ربطه بنيت لهذا الغرض، والسيد مكساج متوافقة، في تحمل ونضح الجهاز السابق وصف8 . وتشمل مزايا فريدة من نوعها لهذا التصميم قدرات حل المستوى الخلوي في أنسجة الثدييات والدقة في السيطرة على محتوى الغاز المذاب، ودرجة الحموضة في موقع نضح الأنسجة. أيضا، على عكس غالبية الدراسات السيد اكسبلانت الذي يقطع التروية أثناء الحصول على الصور لتجنب تدفق المصنوعات اليدوية، هذا التصميم يدعم استخدام التروية المستمرة أثناء جمع البيانات التي تبين أن تحسين الحالة الفسيولوجية عزل الأنسجة9،10. وأخيراً، مطولة تسجيل مغلق الدائرة والاحتفاظ بشريحة المعونة الأجهزة في الحد من احتمال التحف الحركة التي يمكن أن تحدث إلا من خلال مجموعة الصور.
بينما البروتوكول الحالي يصف الإجراءات المناسبة للاستخدام مع شرائح هيبوكامبال والقشرية الحادة، يتيح مراقبة دقيقة على نواتج الأيض بيرفوساتي هذا النظام لاستيعاب مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة المتنوعة والظروف التجريبية. وتشمل القيود المفروضة على هذا التصميم انخفاض الإنتاجية عينة مقارنة بشريحة متعددة نضح دائرة11؛ ومع ذلك، يمكن التغلب هذا القيد في المستقبل باستخدام صفائف لفائف متعددة.
أيضا، في حين يمكن أن تستخدم النظام المبين في تكوينات سواء أفقياً أو رأسياً، يتميز البروتوكول الحالي استخدامها في مطياف 600 ميغاهرتز ذات اتجاه أفقي،. أي نظام قادر على الدراسات ميكرويماجينج السيد – عادة ما تحمل الضيق (دي سيكس سم)، المطيافات ارتفاع الحقل (إيه فايف زيرو زيرو ميجاهرتز) – سوف تستوعب معدات مكساج ونضح ووصف. بيد التغييرات اللولب التصوير، والتدرج، ونظام التحقيق أو أخرى أجهزة التصوير الأساسية المستخدمة قد تستلزم إجراء تعديلات على معدات نضح والسيد المسح معلمات.
Protocol
جميع التجارب على الحيوانات ووصف اتباع المبادئ التوجيهية المبينة في الأكاديميات الوطنية للعلوم ' دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وجرى استعراضها والموافقة عليها جامعة فلوريدا ' s مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة (إياكوك). اتباع جميع القواعد والأنظمة المطبقة عند الدخول في بحث موضوع الحيوان.
1. "إعداد بيرفوساتي" "الحفاظ على أنسجة الجهاز العصبي المركزي"
- جعل النخاعي اصطناعية جديدة (قام)-
- لتوليد 2 لتر بيرفوساتي قام بيكربونات مخزنة، وقياس مل 1,500 تنقيته بالتقطير أو التناضح العكسي المزدوج في قارورة 4 لتر المياه. وضع شريط إثارة مغناطيسية في قارورة وتحرض السائل باستخدام لوحة ضجة.
- في المياه النقية، وتذوب كميات الأملاح التالية: كلوريد الصوديوم 14.03 ز (120 ملم)، وبيكربونات الصوديوم ز 4.37 (26 ملم)، فوسفات البوتاسيوم مونوباسيك 0.41 ز (1.5 مم)، هيبتاهيدراتي سلفات المغنيزيوم ز 0.69 (1.4 ملم)، الكالسيوم 0.59 ز (2 مم) كلوريد ثنائي هيدرات، وكلوريد البوتاسيوم ز 0.45 (3 مم) والجلوكوز 3.6 غ (10 مم)-
ملاحظة: محتويات الكيميائية بيرفوساتي سوف تختلف تبعاً لمتطلبات محددة الأيضية الأنسجة والشروط المطلوبة للتجربة- - ميكس هذا الحل جيدا حتى يكون حل جميع الأملاح. ضبط حجم الصوت إلى ل 2 استخدام كميات إضافية من الماء المنقي. اختبار
- أوسمولاليتي قام استخدام أوسموميتير اكتئاب نقطة التجمد. ضبط إلى 300 كيلوجرام موسم استخدام السوربيتول. إضافة السوربيتول مغ 324 إلى ل 2 من 299 بيرفوساتي قام موسم/كغ ستزيد osmolality لموسم 300/كغ (موسم 1 تقريبا كل مغ 324)-
ملاحظة: يمكن تخزين قام في 4 درجات مئوية في زجاجة الغلق، مختومة لفترة لا تتجاوز 24 h.
2. تعيين نظام التروية
- إعداد بيرفوساتي قام.
- قام اكويليبراتي إلى درجة الحرارة المحيطة (~ 23 درجة مئوية) بينما الغاز مع كاربوجين 95% (95% O 2، 5% CO 2؛ 1/16 لتر في الدقيقة) عبر محتدما مباشر للا تقل عن 1 h.
ملاحظة: قد تتطلب أنواع مختلفة من الأنسجة أو الظروف التجريبية المطلوب تعديل محتويات بيرفوساتي درجة الحرارة أو الغاز. يمكن التحكم بالشروط المطلوبة لمحتوى الغازات المذابة في بيرفوساتي الضبط باختلاف نسبة تركيزات المكونات الفردية للإمداد بالغاز ( الشكل 1). - بمجرد قام تصل إلى درجة الحرارة المطلوبة وتشبع كاربوجين، التأكد من أن درجة الحموضة في نطاق الفسيولوجية (7.3-7.4). تواصل فقاعة الغاز مباشرة إلى الخزان بيرفوساتي (1/16 لتر في الدقيقة) طوال فترة التجربة بغية الحفاظ على السليم حل محتوى الأكسجين ودرجة الحموضة الظروف المؤدية إلى الأنسجة السليمة الأيض.
- قام اكويليبراتي إلى درجة الحرارة المحيطة (~ 23 درجة مئوية) بينما الغاز مع كاربوجين 95% (95% O 2، 5% CO 2؛ 1/16 لتر في الدقيقة) عبر محتدما مباشر للا تقل عن 1 h.
- رئيس خطوط التروية.
- سوبميرجي أنبوب مدخل متصل بالدقيقة-مضخة تمعجية إلى قام استعداد (300 موسم، الأس الهيدروجيني 7.3-7.4، بشكل مستمر بالغاز)-
- تمر مكساج الجهاز ( الشكل 2) وخطوط التروية من خلال كل تتحمل المغناطيس ولفائف متدرجة المكدس (من أعلى إلى أسفل) ومجموعة لفائف جانبا حتى الجمعية التحقيق. إنهاء مكساج أعلاه كوب لالتقاط أي النفايات السائلة قام.
ملاحظة: استناداً إلى تصميم نظام التصوير بالرنين المغناطيسي، قد تحتاج خطوط نضح لتمريرها من خلال تحمل المغناطيس ولفائف متدرجة أو هيئة التحقيق الأساسي قبل فتيلة النظام مع قام. تأكيد الإيداع خط التروية لن تتداخل مع الجمعية العامة لهيئة التحقيق أو الإدراج من التحقيق إلى تتحمل قبل بدء الإجراء فتيلة. - تأكد من تحديد معدل التدفق المقصودة (2 مل/دقيقة) والبدء في ملء خطوط التروية بتبديل على المضخة.
- عكس فخ فقاعة فارغة، في السطر حيث أنه قام وسوف تحل محل الهواء الموجود داخل-
- الاتصال مكساج ' s الغاز منفذ لمصدر ثاني كاربوجين (متعددة أو اسطوانة كاربوجين ثانوية) وتعيين معدل تدفق من 1/16 لتر/دقيقة
- تؤكد أن كاربوجين تتدفق عبر مكساج ' s غشاء تبادل الغازات بغمس منفذ العادم على رأس مكساج في المياه-
- بمجرد اكتشاف قام تتساقط من قاعة التروية، تطهير أي فقاعات الغاز مرئية من خطوط تدفق بالانفعالات اليدوي. تأكيد
- مكساج تعمل بشكل صحيح بغمر مسرى الأوكسجين في قام المتدفقة من قاعة نضح.
ملاحظة: ينبغي التقريبي القراءة على مقياس الأكسجين نسبة الأكسجين الواردة ضمن الغاز الموردة.
3. إعداد الأنسجة
- القتل الرحيم
- مكان الفئران (125-150 غ) في قاعة التعريفي آلة التخدير وفضح إلى إيسوفلوراني 4 ٪ في حاملة أكسجين الغاز بمعدل 1 لتر في الدقيقة لدقيقة 4
- إزالة الفئران فاقد الوعي من دائرة التخدير.
- إجراء اختبار منعكس رايتينج بوضع الفئران في موقف ضعيف. التحقق من وجود أي تحركات — رئيس تحول، رفع الساق، العمود الفقري الثناء، إلخ — الإرشادية التي تحول الحيوان إلى المعدة.
- تنفيذ اختبار انعكاسي طرفه عين بلمس العين المفتوحة للحيوان باستخدام مسحه القطن. التحقق من وجود أي رد — غطاء الإغلاق، ارتعاش العضلات، وما — لهذه المدخلات الحسية.
- وأخيراً، إجراء أطرافهم تسحب اختبار منعكس معسر الجلد بين أصابع القدم الفئران ' s الممدودة الساق الخلفية باستخدام الملقط أو هيموستاتس. التحقق من وجود الانحناء leg.
ملاحظة: في حالة نتيجة اختبار انعكاسية إيجابية، لا تقم بالمتابعة مع القتل الرحيم. - في حالة ما إذا أي من الاختبارات الثلاثة منعكس يتسبب استجابة، العودة الفئران فورا إلى غرفة التخدير والسماح مين 2 إضافية من التعرض إلى 4% إيسوفلوراني-
- تنفيذ كافة الاختبارات الثلاثة انعكاسي عبر في مجملها. تكرار التعرض التخدير 2 دقيقة حسب الضرورة والمضي قدما فقط مرة واحدة وقد لوحظ انعدام تام للاستجابة لكافة الاختبارات الثلاثة انعكاسي.
- Euthanize في الفئران عن طريق قطع الرأس مقصلة.
- بتر المخ
- إزالة الدماغ الفئران بالتشريح الإجمالي. بدء تشغيل مع الرأس في موقف المعرضة. باستخدام مقص، قص روسترالي عن طريق الجلد من الجزء الخلفي الرقبة للأنف وفضح الجمجمة.
- إزالة الأنسجة الرخوة من سطح الجمجمة مع تحقيق كليلة.
- العمل من نهاية والذيلية، إزالة قذالي، الجداري، وأمامي عظام الجمجمة استخدام رونجيورس-
- تتراجع في بلده دوراً بالقطع على طول الشق الطولي مع المقص الصغير وتقشير مرة أخرى الطبقة من كلا نصفي الكرة الأرضية-
- إزالة الدماغ من الجمجمة بتحول الرئيس في موقف ضعيف وقطع أعصاب على الجانب البطني.
- عزلة شريحة
- العودة الدماغ للموقف الذي عرضه وعزل الجزء المركزي الذي يحتوي على الحصين عن طريق إزالة جميع الأنسجة والذيلية للشق عرضية وروسترال إلى فيمبريا. إجراء تخفيضات اثنين على طول الطائرة عرضية (أي شرائح الاكليلية) بشفرة حلاقة مستقيمة.
- إلصاق الدماغ ' s والذيلية معظم الطائرة إلى وسط حمام قطع فيبرتوم استخدام الغراء cyanoacrylate.
- إضافة المثلج، كاربوجين bubbled قام إلى الحمام قطع فيبرتوم ومكان داخل الأجهزة استبقاء النايلون.
- قطع 300 ميكرومتر شرائح سميكة للحصول على 3 إلى 4 شريحة للاستخدام التحضيرات في نصف الكرة الغربي (مجموع 6 إلى 8)-
- عزل الحصين أو قسم القشرية من واحد في نصف الكرة وتقليم الشريحة حتى يتم احتواؤه ضمن ميكروكويل ' s الأنسجة قطرها 5 ملم جيدا.
4. عينة من تحديد المواقع ونظام التروية الجمعية
- لفائف إعداد
- التعبئة ميكروكويل ' s الأنسجة الدائرة مع اﻷوكسيجين قام من فيبرتوم ' حمام قطع s استخدام ماصة نقل.
- أخذ العينة الدماغ المشذبة ووضع منطقة الفائدة (على سبيل المثال-طبقة الخلايا الهرمية) على ميكروكويل استخدام نطاق تشريح.
- إدراج الجهاز الإبقاء على الأنسجة (النايلون شباك الملصقة على الغسالة النايلون) الاحتفاظ بالموقف عينة طوال تجربة التصوير-
ملاحظة: الانتقال بسرعة من خلال عينة وضع إجراءات للحد من التعرض للضوء المكثف. توفير قام اﻷوكسيجين إضافية حسب الحاجة باستخدام ماصة نقل.
- تجميع في تحمل مكساج وميكروكويل والتحقيق
- آمنة ميكروكويل تعديل الجمعية العامة ( الشكل 3) في المشبك جدول وإلصاق الجهاز مكساج في التجويف بإدراج أسيتال الدعم شماعة في حفرة على رأس الملف.
- ختم نظام التروية بوضع الدائرة التروية ميكروكويل ' الأنسجة s وكذلك سينتشينج وهما معا باستخدام ربطه عنق كابل مصغرة.
- تقليم طول الزائدة من ربط الكابل باستخدام قواطع للأسلاك.
ملاحظة: عند ختم ناجحة، بيرفوساتي ينبغي التقيد بالخروج من خلال خطوط التدفق والتسرب لا ينبغي أن يكون واضحا حول ختم سيليكون الدائرة التروية. يمكن أن يؤدي عدم تأكيد هذه الشروط قبل الجمعية التحقيق في أضرار خطيرة للتصوير الأجهزة. - مرة واحدة يمكن أن نرى قام تتساقط في خزان النفايات، أخذ ميكروكويل ومكساج وتولى الجمعية العامة للجزء العلوي من الجسم مسبار التصوير- الشريحة المكدس التدرج عبر الجمعية العامة
- ومقعد التدرج على رأس المجس. صور تفصيل الموضع النسبي والاتصال مناسب للفائف، تتوفر مكونات الأجهزة مكساج والتحقيق ( الشكل 4).
5. القيام "جمع صورة السيد"
- إدراج التحقيق المجتمعون في المغناطيس وتتحمل
- مكانة هيئة التحقيق بالقرب من والمطياف تحمل الافتتاحية في الجزء السفلي من المغناطيس.
- سحب فائض طول خطوط التروية من خلال تحمل فتح في الجزء العلوي من المغناطيس.
- مرة واحدة قد تناول كل من فترة السماح المتاحة من خطوط التروية، تقدم هيئة التحقيق داخل المغناطيس تتحمل في القاعدة بينما في نفس الوقت إزالة الركود المزيد من خطوط نضح من الجزء العلوي من تتحمل.
- الخيط مسامير تأمين اثنين في القاعدة للتحقيق في فتحات المقابلة من المكدس الرقاقة.
- قبل المتابعة، تحقق من أن خطوط التروية لا مقروص أو متلوي أثناء الإدراج التحقيق من تأكيد تدفق قام خزان النفايات.
ملاحظة: عدم تأكيد تدفق بيرفوساتي يمكن أن ينتج ضرر دائم لنضح خطوط ومخاطر أضرار كارثية للسيد التصوير الأجهزة. - في حالة بيرفوساتي لا يعتبر إنهاء السطر الإرجاع في خزان النفايات، إزالة هيئة التحقيق والتأكد من أن تدفق بيرفوساتي وقد استؤنف قبل محاولة إعادة الإدماج. وقد تم تخطيط تخطيطي من مطياف النظام وتصوير نضح المجتمعون الموصوفة سابقا 8-
- الاتصال "هيئة التحقيق"
- إرفاق خطوط تدفق وتدفق المياه من المبردات التدرج.
- تشغيل المضخة للمبردات التدرج وتأكيد الإعداد درجة حرارة المياه (19 درجة مئوية)-
- إرفاق خرطوم الهواء من الوحدة وحدة تبريد الهواء إلى هيئة التحقيق باستخدام المشبك خرطوم.
- أدر التدفق في وحدة وحدة تبريد الهواء إلى " 1 " الموقف.
- إرفاق الأسلاك الحرارية إلى هيئة التحقيق-
- توصيل كبل coaxial من preamp تردد الراديو (RF) المدخلات والمخرجات على هيئة التحقيق ' قناة بروتون (ح) s-
- توصيل كبل الطاقة من مكبرات الصوت التدرج إلى هيئة التحقيق-
- داخل الترددات اللاسلكية مجلس الوزراء، تشغيل الطاقة إلى وحدة تعويض B0، جميع المضخمات التدرج ثلاثة (x, y, z)، و unit. الرئيسية
- إعداد والمطياف
- ضبط درجة حرارة تحمل المقصود استخدام الوحدة النمطية لضبط درجة الحرارة متغير في وحدة التحكم-
- تطابق (مقاومة) ولحن (التردد) RF الدائرة عن طريق ضبط المكثفات المتغيرة داخل التحقيق. ويتم ذلك عن طريق التلاعب عصا على القاعدة هيئة التحقيق.
- ضبط الإعدادات الحالية المطياف ' s لفائف الرقائق تحقيق أقصى قدر من التجانس المجال المغناطيسي في العينة-
- تبدأ مجموعة الصور
- جمع الصور التجريبية لتحديد موقف المكانية للنموذج الخاص بك داخل المغناطيس وتتحمل. المعلمات نموذجية لاثنين صدى متدرجة الأبعاد كما يلي (TR/TE = 100/4 مللي ثانية، المتوسطات = 1، زاوية نبض = 30 س، والوقت = مصفوفة ثانية، 6 = 64 x 64، مجال الرؤية = 0.3 × 0.3 سم، القرار = 47 × 47 ميكرومتر).
- جمع الطيارين المرجحة نشرها بغية تأكيد موقف الهندسة والأنسجة الفحص السليم إذا كان ذلك ممكناً. معايير نموذجية لاثنين الأبعاد المسح التجريبي المرجحة نشرها فيما يلي (TR/TE = 2000/11.6 مرض التصلب العصبي المتعدد، والوقت = 4.3 دقيقة، Δ = 6 مللي ثانية، δ = 1 مرض التصلب العصبي المتعدد، والمتوسطات = 1، ب = 1200 (اعتبارا من عام 1860) s/مم 2، ومصفوفة = 64 x 64، مجال الرؤية = 0.2 x 0.2 سم ، القرار = 31 ميكرومتر).
- جمع سلسلة زمنية نشر المرجحة لتحديد خصائص الاستقرار إعداد شريحة الحادة. المعلمات نموذجية لصورة نشرها الأبعاد هما مرجحة كما يلي (TR/TE = 2000/11.6 مرض التصلب العصبي المتعدد، والوقت = 1.5 ح، Δ = 6 مللي ثانية، δ = 1 مرض التصلب العصبي المتعدد، والمتوسطات = 42، ب = 1200 s/مم 2، ومصفوفة = 64 x 64، مجال الرؤية = 0.2 x 0.2 سم، القرار = ميكرومترات 31). ملاحظة: وصف الاستقرار في نظام معين سوف تختلف عن البروتوكول وصف تبعاً لعوامل مثل التباين MR المستخدمة (مثل T1، T2، نشر، قابلية)، اضطراب المادية التي درست، وتغيير إشارة السيد كل وحدة زمنية وقال أن الناتج عن اضطراب.
Representative Results
إعداد بيرفوساتي
عند التوظيف الناجح للجهاز في تحمل الأوكسجين، الغازات الموجودة في كاربوجين الموردة سوف تصل إلى 100 ٪ التشبع الظروف داخل بيرفوساتي قام. ويمكن التدليل على هذا باختلاف تركيز الأكسجين من الغاز الذي تم توفيره، وقياس التغير في محتوى الأكسجين الذائب في بيرفوساتي قام داخل قاعة نضح استخدام الأوكسجين متر (الشكل 1)8. ووفقا لقانون هنري، كمية الغاز المذابة في توازن مع عينة سائل طرديا مع الضغط الجزئي لهذا الغاز شريطة أن تبقى درجة الحرارة ثابتة12. باستخدام هذه المعرفة ودقة معايير الغاز، من الممكن قياس كمية الأوكسجين الذائب الواردة ضمن نموذج قام كما هو موضح. ويتحقق ذلك بمعايرة المقياس الأكسجين باستخدام حلول المشبعة (bubbled مباشرة ح 1 أو أكثر) من قام تم تعريضهم للغازات تكوين المعروفة: غاز واحدة مع تركيز الأكسجين عالية مثل كاربوجين (95% O2) وآخر مع الأكسجين المنخفض التركيز مثل النيتروجين (0% O2). بعد ذلك، يمكنك أخذ قياسات بغمر غيض مسرى الأوكسجين في عينة. يمكن تأكيد أن مكساج في تحمل يعمل بشكل صحيح بقياس النفايات السائلة من التروية شكل جيد. نسبة الأكسجين المذاب مقاسا بمقياس الأكسجين يجب أن تتطابق مع نسبة تركيز الأكسجين في إمدادات الغاز. إذا كانت القيم المقاسة أقل من تلك التي في إمدادات الغاز، وهذا يوحي فشل في أجهزة التي يمكن أن تؤدي إلى عدم كفاية التمثيل الغذائي في شريحة الأنسجة.
نموذج المظهر والسلوك
الاستعدادات شريحة الحادة التي تتلقى التروية كافية للإمدادات الضرورية من الأيض وحمل النفايات الأيضية قريبا التوصل إلى حالة من الاستقرار النسبي. ومن هذا المنطلق، شرائح الحاد يمكن أن تخضع لاضطراب خارجي وردودها على هذه التغييرات يمكن أن تقاس للدراسة العلمية. لإجراء التجارب على السيد، تتبع الإشارة الواردة من الاهتمام على مر الزمن ممارسة استخداماً تثبت الاستقرار النسبي لشريحة الحادة الاستعدادات13. إشارة نشر المرجحة حساسية خاصة للتغيرات في حركة المياه في الأنسجة والمحتوى والتوزيع، كما يمكن أن يكون موضع تقدير باستخدام هذه الآلية على النقيض للكشف عن الاحتشاءات الدماغية14،15. التآمر إشارة نشر تطبيع مع مرور الوقت في شرائح القشرية الحادة الاحتفاظ بها ضمن مجموعة متنوعة من الظروف نضح يوضح نسبيا من الاستقرار (3 ± 2% أكثر من 15.5 ح) بعد تحقيق عزل الأنسجة (الشكل 5). وأبقى على نشر إشارة الاستقرار بغض النظر عن ظروف التروية (متقطع أو مستمر) أو التصوير بالرنين المغناطيسي مسح طول (قصيرة [4 دقيقة] أو طويل [1.5 h])8. إذا كانت الشرائح لا يحمل إشارة الاستقرار على مر الزمن، مثل زيادة إشارة نشر حادة لوحظت في قشرة الحية التي لا تتلقى التروية، هذا توحي الظروف التجريبية دون الحد الأمثل. ينبغي عدم محاولة تجارب اضطراب قبل تأكيد الأحوال إشارة مستقرة في شريحة الأعمال التحضيرية.
بالإضافة إلى إشارة الاستقرار، يجب تأكيد النموذج الصحيح لتحديد المواقع في وقت جمع صورة. على الرغم من أن يتم التحكم في الموقف عينة أثناء وضع الأنسجة في مجهر تشريح، قد تحدث تحولات في الموقف عينة أثناء الجمعية العامة جهاز التروية، أو بسبب معالجة الخام من فائف أو التحقيق قبل الإدراج في المغناطيس. تأكيد الإيداع هيبوكامبال السليم يمكن أن يتحقق عن طريق جمع اختصار يمسح الطيار (2 دقيقة)، مع نشر التباين (الشكل 6). لأن طبقة الخلايا الهرمية أكثر حساسية لنشرها في الترجيح من عن هيبوكامبال المتاخمة، سوف تظهر هذا الهيكل كعصابة أكثر قتامة في المرجحة نشر الصور. الأجهزة التي لا تعرض هذا سمة مميزة تحتوي على عينات خارج المركز، وسوف تحتاج المرجح أن تتكرر.
الشكل 1: حل محتوى الأكسجين في بيرفوساتي قام كدالة س2 محتوى الغاز التي تم توفيرها في المائة. كاربوجين الخلائط المحتوية على تركيزات متغيرة من الأوكسجين (95% و 60% و 19 في المائة) يعملون كإمدادات غاز. قراءات نسبة الأكسجين المذاب ثم تؤخذ من نضح جيدا ومقارنة لعنصري تحكم معروفة: bubbled خزان بيرفوساتي مباشرة مع كاربوجين (95% س2)، وخزان بيرفوساتي المعرضة للظروف الجوية (23% O2 ). وفي كل حالة تشبع الأكسجين في المائة في الموقع نضح الأنسجة النهج 100 في المائة من تركيز O2 داخل الخليط كاربوجين المستخدمة. أشرطة الخطأ مساوية للانحراف المعياري للعينة الوسائل. الشكل المستنسخ بإذن من المادة الأصلية8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التخطيطي رسم الدائرة في تحمل مكساج والتروية. يوضح هذا المخطط عناصر التصميم التفصيلي المسؤولة عن وظيفة هذه الأجهزة الهامة. ويدخل بيرفوساتي الطازجة التي تم ضخها من خلال فخ فقاعة مكساج عبر الجزء العلوي من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي 10 ملم. عند القيام بذلك، الانتقال إلى غاز العالية أنابيب سيليكون نفاذية (الجزء الأزرق) الذي هو ملفوف حول أنبوب 5 مم الرنين المغناطيسي مفتوح، متداخلة. كاربوجين الغاز الموردة عبر الجزء العلوي من الأنبوب 5 مم يدخل الدائرة من خلال الجزء السفلي مفتوحة ويمر عبر أنابيب سيليكون ملفوف قبل إنهاء مكساج من خلال فتحه تنفيس في غطاء أنبوب 10 ملم. أثناء هذا التعرض، ويصبح مشبعة بيرفوساتي يتدفق من خلال أنبوب سيليكون مع المكونات الكيميائية الخليط الغاز التي تم توفيرها. عند الإنهاء مكساج، يمر بيرفوساتي مباشرة في قاعة التروية قبل الدخول إلى خط العودة مما يؤدي إلى مستودع لجمع نفايات. تشمل المكونات الأخرى الهامة لهذا التصميم شماعة الدعم أسيتال مما يسمح مكساج الوقوف عمودياً فوق ميكروكويل RF المعدلة، غسالة سيليكون (حزام أحمر) الذي يشكل ختم السائل محكم بين الدائرة التروية مكساج و الدرجة الأنسجة ميكروكويل جيدا، وربط الكابل الذي يلائم وضع ربطه عنق كابل المستخدمة لتكوين هذا الختم عكسها. تم تعديل هذا الرقم واستنساخها بإذن من المادة الأصلية8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تعديلات للجمعية ميكروكويل التي تسمح واجهة إلى مكساج في التجويف. وقطعت اثنين الأخاديد 3.0 x 1.5 مم (الأسهم السوداء) إلى جانب الجمعية العامة بأن استيعاب عرض التعادل كابل يستخدم لختم الدائرة التروية. قناة (15 ملم × 3 مم × 4 مم) يتصل البساتين على الوجه الخلفي للملف. وضع مسافتين النايلون في الجانبين من قانون قناة (الأسهم الحمراء) كصيد للرأس التعادل الكابل الذي يخفف هذا الإجراء الختم. حفر حفرة (2 مم × 14 مم) في الجزء العلوي من الجمعية لفائف (arr أصفرآه) ينضم إلى أسيتال الدعم شماعة لتأمين مكساج. تم تعديل هذا الرقم واستنساخها بإذن من المادة الأصلية8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: صور المونتاج تفصيل الموضع النسبي والجمعية سليم ميكروكويل ومكساج ومكونات المسبار. تتميز المكونات الرئيسية للجهاز مكساج وميكروبيرفوسيون في تحمل هذه الصور وتوضيح كيفية الواجهة أجزاء منفصلة مع بعضها البعض. (أ) -عرض صور عرض موضع نسبي لكافة المكونات قبل ختم الأنسجة جيدا أو الجمعية هيئة التحقيق. وقد تم الحرص على عرض الموقع النسبي لأجزاء بدقة؛ ومع ذلك، قسم من خطوط نضح تم مضاعفة مرة أخرى في هذه السلسلة حتى يتم احتواء كافة المكونات داخل إطار الصورة. (1 = رئيس التحقيق، 2 = ميكروكويل الجمعية، 3 = النايلون الأنسجة الاحتفاظ بخاتم، 4 = نضح جيدا، 5 = ربط الكابل، 6 = مكساج في التجويف، 7 = التدرج لفائف، 8 = فخ فقاعة). (ب) مكونات عقب الجمعية لفائف ومكساج. في هذه الصورة، ووضعت الحلبة استبقاء النايلون داخل الأنسجة جيدا ميكروكويل الحصول على عينة. تم تأمين شماعة الدعم أسيتال على قاعدة مكساج في حفرة المقابلة على رأس ميكروكويل. وضعت طوقا سيليكون في النهاية المفتوحة التروية جيدا على البئر الأنسجة، وأحكمت ربطه عنق كابل حول هذه المكونات لختم الدائرة التروية. وأخيراً، تم ربط قاعدة ميكروكويل إلى الجزء العلوي من الرأس التحقيق. (ج) مكونات عقب التحقيق الجمعية. الطول الزائد من ربط الكابل في الفريق الأخير، قد تم قلصت تدفق مع ميكروكويل. ثم هو انزلق المكدس لفائف التدرج في الموقف بدفع الاسطوانة نحو التحقيق بعناية حين يمر مركز جوفاء خطوط نضح الزائد ومكساج وميكروكويل. مرة واحدة متصلة التدرجات إلى رئيس التحقيق، كنت عقدت في مكان بالشد تأمين ذوي الياقات البيضاء في التحقيق حول قاعدة الخيوط من التدرجات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: نشر إشارة الاستقرار في شرائح القشرية الحادة سوبيرفوسيد. (أ) يتم رسم Normalized نشر القيم إشارة أربعة شرائح حادة تعرض لنماذج سوبيرفوسيون مختلفة على مر الزمن لفترة تصل إلى 21.5 ح عقب القتل الرحيم. شرائح تظل في حدود ± 5% لقياسها إشارة أولية نشرها لفترة 15.5 ح عقب القتل الرحيم بغض النظر عن ما إذا كان سوبيرفوسيون هو مستمرة أو متقطعة ومستقلة عن طول السيد المسح الضوئي (1.5 ح أو 4 دقيقة). تسجيلات الإشارات مأخوذة من اللحاء فورمالدهايد ثابتة بمثابة عنصر إيجابي (n = 1) للاستقرار بسبب طبيعة ثابتة، لا تتغير من عينات الأنسجة الثابتة. على العكس من ذلك، إشارة نشر تقاس في شريحة حية في غياب الدعم سوبيرفوسيون (n = 1) بمثابة عنصر تحكم لنقص التمثيل الغذائي. معلمات تجربة من التجارب سوبيرفوسيون مختلفة كما يلي: مستمر (سوبيرفوسيون دائماً في المرة الواحدة والمسح الضوئي = 1.5 ح)، متقطعة (سوبيرفوسيون في 10 دقيقة الفاصل الزمني بين عمليات المسح، للمرة الواحدة والمسح الضوئي = 1.5 ح) طويلة الفاصل الزمني، تفحص طويلة (سوبيرفوسيون في أثناء الفحص، لكن الإيقاف المؤقت لمدة 10 دقائق بين المسح، المرة الواحدة ومسح = 1.5 ح)، الفاصل الزمني بوقت طويل، قصيرة المسح الضوئي (سوبيرفوسيون على 1.5 ح الفاصل الزمني بين عمليات المسح، للمرة الواحدة وتفحص = 4 دقيقة). (ب) تحليل البيانات تظهر مجموعة وسائل أربع تجارب سوبيرفوسيون تعيش شريحة من الفريق (أ). نشر الإشارات الشخصية من المجمعة، شرائح القشرية سوبيرفوسيد المعارض اختلاف بسيط على مر الزمن (3 ± 2% أكثر من 15.5 ح) بينما عنصر التحكم غير perfused (n = 1) المعارض عدم الاستقرار إشارة مثيرة في بداية التجربة (15% من 6.5 h). تم تعديل هذا الرقم واستنساخها بإذن من المادة الأصلية8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تأكيد الإيداع شريحة هيبوكامبال أثناء التصوير التجريبية. قبل أن يعمل السيد موسعة دورة الفحص المجهري، الصحيح وضع العينة دوراً حاسما في كفالة الموارد مثل الوقت الماسح الضوئي ومكلفة المضافات بيرفوساتي لا تضيع. طبقة الخلايا الهرمية في منطقة CA1 في قرن آمون يمكن تصور في أسرع (4.3 دقيقة)، وانخفاض القرار (31 ميكرو x 31 ميكرومترات في الطائرة) بمسح تجريبي إلى ضمان وضع أنسجة الفائدة بشكل صحيح بالنسبة للصغير-اللولب. معلمات مسح مشترك لكل الصور كما يلي: TR/TE = 2000/11.6 مرض التصلب العصبي المتعدد، Δ = 6 مللي ثانية، δ = 1 مرض التصلب العصبي المتعدد، والمتوسطات = 1. (أ) ب = 0 (227 فعالة) s/مم2. في هذا المسح الأولية، pyramidale الطبقة مرئياً فقط رمادي، قطري الفرقة تتمحور في الإثارة الشخصية فائف. (ب) ب = 1,200 (1,860 فعالة) s/مم2. يزيد التباين وزن، إينتيرلاميلار في نشر أعلى طبقة الخلايا الهرمية يصبح أكثر قتامة من الأنسجة في عن المتاخمة (أعلاه: oriens الطبقة؛ وأدناه: رادياتوم الطبقة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ويصف البروتوكول الحالي بالإجراءات اللازمة لصيانة الأيضية القياسية الاستعدادات شريحة الدماغ الحادة تمر بالرنين المغناطيسي المجهري. هذا الإجراء هو الطريقة الوحيدة المتاحة حاليا أن يسمح تصور أنسجة الثدييات العيش مع السيد في قرارات قادرة على حل الخلايا. بينما بيرفوساتي الشروط الموصوفة مصممة خصيصا لانسجة الجهاز العصبي المركزي، البروتوكول قابل للتكيف على نطاق واسع إلى أي أسلوب معيشة إعداد الأنسجة من خلال تعديلات مكونات بيرفوساتي والغاز، فضلا عن معدل تدفق التروية ودرجة الحرارة.
أكثر المشاكل شيوعاً التي يرجح أن تواجهها أثناء الإجراءات الموصوفة تشمل تلك المتعلقة بالفشل في إمداد المستقلب. يمكن أن يحدث ترسيب لأملاح الكالسيوم داخل قام أثناء عدم كفاية الغازية نتيجة للفشل في بيكربونات التخزين المؤقت للنظام. هذه رواسب يمكن أن تسد خطوط نضح ويؤدي إلى تلف الجهاز الشديدة. إذا لوحظت رواسب الملح في بيرفوساتي عقب التحقيق الجمعية، وقف تدفق نضح على الفور بإيقاف مضخة تمعجية. تأكيد وجود مستويات كافية من بيكربونات الصوديوم (غ 4.37/2 لتر) في بيرفوساتي، مستويات2 CO (5.0 في المائة) في إمدادات الغاز، وتدفق الغاز كاربوجين (1/16 لتر في الدقيقة) إلى الخزان ومكساج. وأخيراً، تأكيد استقرت مستويات الحموضة في نطاق الفسيولوجية (7.3-7.4). في حال أن مستويات الأكسجين في الحموضة والغاز لا تزال تنظم لا على نحو ملائم، ينبغي الاستعاضة عن غشاء تبادل الغازات.
إذا كانت الشرائح لا يحمل إشارة الاستقرار على مدى المقصود التجريبية الوقت-، تأكيد أن المكونات الكيميائية الصحيحة موجودة في الخليط قام والإبقاء على أوسمولاليتي الصحيح (300 موسم) والأس الهيدروجيني (7.3-7.4). أيضا، تأكد من هو تزويد الغاز كاربوجين إلى خزان بيرفوساتي ومكساج في 1/16 لتر في الدقيقة. إذا كانت هذه الخطوات لا تصحح الأوضاع بيرفوساتي، ينصح باستبدال غشاء تبادل الغازات. وإذا لم يتحقق الاستقرار الأنسجة بعد استكشاف الأخطاء وإصلاحها في ظروف بيرفوساتي، النظر في تنقيح البروتوكول الجراحي مع تركيز على تقليل الفاصل الزمني بين التطبيق الحصاد ونضح الأنسجة.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة" (1R21NS094061-01A1) (المعاهد الوطنية للصحة 1R01EB012874-01) (S10RR031637)، و "المؤسسة الوطنية للعلوم" (اتفاق تعاوني رقم DMR-1157490) من خلال مرفق مختبر المجال المغناطيسي عالية الوطنية (نهمفل) "متقدمة التصوير بالرنين المغناطيسي" و "التحليل الطيفي" (أمريس) في الجبهة المتحدة وولاية فلوريدا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate Preparation | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
| Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
| Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
| pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
| Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
| Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
| Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Preparation | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
| Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion System | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
| Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
| e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
| in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MR Imaging Hardware | |||
| Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
| Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
| Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
| 600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
| Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
| Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
| Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |
References
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
