Summary
Det nuvarande protokollet beskriver en metod genom vilken användare kan upprätthålla livskraften hos akut hippocampus och kortikala slice preparat under datainsamlingen magnetresonans mikroskopi.
Abstract
Det här protokollet beskriver förfarandena som är nödvändiga för att stödja normala metaboliska funktioner av akut hjärnskada slice preparat under datainsamlingen magnetresonans (MR) mikroskopi. Det är möjligt att utföra herr samlingar på levande, exciderad däggdjursvävnader, sådana experiment har traditionellt varit begränsas av resolution gränser och är således oförmögen att visualisera vävnad mikrostruktur. Omvänt, herr protokoll som uppnådde mikroskopiska bildupplösning krävs användning av fasta prover att rymma behovet av statisk, oföränderlig förhållanden över långa skanna gånger. Det nuvarande protokollet beskriver den första tillgängliga herr tekniken som möjliggör avbildning av levande, däggdjur vävnadsprover vid mikroskopisk upplösningar. Sådana uppgifter är av stor betydelse för förståelsen av hur patologi-baserade kontrast förändringar som sker på mikroskopisk nivå inflytande innehållet i makroskopiska herr skanningar som de används i kliniken. En gång sådan förståelse realiseras, diagnostiska metoder med större känslighet och noggrannhet kan utvecklas, vilket kommer att översätta direkt till tidigare sjukdomsbehandling, mer korrekt terapi övervakning och förbättrade behandlingsresultat.
Medan den beskrivna metoden fokuserar på hjärnan slice preparat, är protokollet anpassningsbar till alla exciderad vävnad segment eftersom ändringar görs på gas och perfusatet preparat att tillgodose vävnadens specifika metaboliska behov. Framgångsrikt genomförande av protokollet bör resultera i levande, akut slice preparat som uppvisar herr diffusion signal stabilitet för perioder upp till 15,5 h. De främsta fördelarna med det nuvarande systemet över andra herr kompatibel perfusion apparaturar är dess förenlighet med herr mikroskopi maskinvara krävs för att uppnå högre upplösning bilder och förmåga att ge konstant, oavbruten flöde med noggrant reglerade perfusatet villkor. Reducerat provgenomströmning är en övervägande med denna design som endast en vävnad slice kan avbildas i taget.
Introduction
Magnetisk resonanstomografi (MRT) system har stadigt utvecklats till allt högre fältstyrkor, blivit mer information om sammansättning och status för levande vävnader märkbara. Trots sådan maskinvara framsteg är MR imaging upplösningar som är tillräcklig för att visualisera de cellulära strukturerna av vävnader fortfarande inte tillgängliga i kliniken. Därför måste slutsatsen dras cellular-nivå kännetecken för vävnader när man beaktar innehållet i kliniska skanningar. Sådan slutledning kräver kunskap om motsvarande processer utläsa från data tas i modellsystem som kan observeras direkt. Traditionellt har ingår dessa modeller celler från vattenlevande organismer såsom Xenopus laevis äggcellen och Aplysia californica L7 neuron1,2. Dessa var bland de första djurceller tillgängliga för observation med herr metoder på grund av deras atypiskt storlek: cirka 1000 μm och 300 μm diameter, respektive. Mer nyligen, framsteg inom hårdvarudesign har gjort för en av de största exemplen på däggdjursceller — den α-motorneuronen — att avbildas med herr mikroskopi tekniker på fasta vävnad3,4. Medan dessa studier visat direkt visualisering av däggdjur cellulära material med hjälp av herr, fast proverna anställd skiljer sig avsevärt i deras Herr egenskaper från levande vävnad och därmed inte kan fungera som en motsvarande representativa modell5, 6. Viktigare kräver att observera herr kontrast förändringar som sker i samförstånd med komplexa biologiska processer levande prover som kan vara orolig och mätt under loppet av imaging experimentet.
För att underlätta herr mikroskopi studier på levande vävnader, presenteras ett protokoll som omfattar kommersiella microimaging hårdvara7 kopplats ihop till en specialbyggd, herr kompatibel, i-bore oxygenator och perfusion enhet som tidigare beskrivs8 . Unika fördelar av denna design inkluderar cellulär nivå upplösning funktioner i däggdjur vävnader och precisionskontroll över löst gasinnehåll och pH vid platsen för vävnadsperfusion. Också, till skillnad från majoriteten av explant herr studier som avbryter perfusion under bild förvärv att undvika flödet artefakter, denna design stöder användning av kontinuerlig perfusion under datainsamling som har visat sig förbättra fysiologiska tillstånd isolerade vävnader9,10. Slutligen dess stängda inspelning kammare och slice-lagring hårdvara stöd för att minska sannolikheten för rörelse artefakter som annars kan uppstå under utdragna bildsamling.
Medan det nuvarande protokollet beskriver förfaranden som är lämpliga för användning med akut hippocampus och kortikala skivor, kan exakt kontroll över perfusatet metaboliter detta system för att tillgodose en mängd olika vävnadstyper och experimentella förhållanden. Begränsningar av denna design inkluderar en minskning i provkapacitet jämfört med en multi slice perfusion kammare11; men kan denna begränsning övervinnas i framtiden använda multi spole arrayer.
Också, medan det beskrivna systemet kan användas i både horisontell eller vertikal konfigurationer, det nuvarande protokollet har dess användning i en lodrätt orienterad, 600 MHz spektrometer. Alla system som kan herr microimaging studier — vanligtvis narrow-bore (≤6 cm), hög fältet (≥500 MHz) spektrometrar — kommer att rymma oxygenator och perfusion utrustningen beskrivs. Dock kan ändringar imaging spolen, toning, sond system eller andra väsentliga imaging hårdvara anställd nödvändiggöra ändringar av perfusion utrustningen och herr scan parametrar.
Protocol
alla djurförsök beskrivs följa de riktlinjer som anges i National Academies of Sciences ' Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur och var granskats och godkänts av University of Florida ' s Institutionella djurens vård och användning kommittén (IACUC). Följ alla gällande regler och förordningar bergklättring i animaliskt ämne forskning.
1. beredning av perfusatet för underhåll av centralanervsystemet vävnader
- göra färska konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF).
- Att generera 2 L av bikarbonat-buffrat aCSF perfusatet, mäta ut 1500 mL vatten renas genom dubbel destillation eller omvänd osmos i en 4 L kolv. Placera en magnetiska rör bar i kolven och agitera vätskan med hjälp av en uppståndelse tallrik.
- i det rena vattnet, upplösa de följande mängder salter: 4,37 g (26 mM) natriumbikarbonat, 0,69 g (1,4 mM) magnesiumsulfat heptahydrat, 0,41 g (1,5 mM) monobasiskt kaliumfosfat, 14.03 g (120 mM) natriumklorid, 0,59 g (2 mM) kalcium klorid dihydrat, kaliumklorid 0,45 g (3 mM) och 3,6 gram (10 mM) glukos.
Obs: Det kemiska innehållet av perfusatet varierar beroende på specifika metaboliska kraven i vävnaden och önskad villkoren för experimentet. - Blanda denna lösning tills alla salter har upplöst. Justera volymen till 2 L med ytterligare renat vatten.
- Testa osmolalitet av den aCSF använder en fryspunkt depression osmometer. Justera till 300 mOsm/kg med sorbitol. Tillägg av 324 mg sorbitol till 2 L av 299 mOsm/kg aCSF perfusatet kommer att öka osmolalitet 300 mOsm/kg (cirka 1 mOsm per 324mg).
Obs: ACSF kan lagras vid 4 ° C i en lufttät, förseglad flaska för en period på högst 24 h.
2. Ställ upp the Perfusion System
- förbereda den aCSF perfusatet.
- Jämvikt aCSF till rumstemperatur (~ 23 ° C) medan gasning med 95% carbogen (95% O 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) via direkt bubblande för inte mindre än 1 h.
Obs: Olika vävnadstyper eller önskad experimentella förhållanden kan kräva justering av perfusatet temperatur eller gas innehållet. Önskad villkoren för upplöst gas innehållet i perfusatet kan styras exakt genom att variera procent koncentrationerna av enskilda komponenter i leverans gas ( figur 1). - När aCSF når önskad temperatur och carbogen mättnad, bekräfta att pH ligger i intervallet fysiologiska (7,3-7,4). Fortsätter att bubbla gas direkt in i perfusatet reservoaren (1/16 L/min) under hela experimentet för att upprätthålla korrekt upplöst syre innehåll och pH förhållanden bidrar till frisk vävnad metabolism.
- Jämvikt aCSF till rumstemperatur (~ 23 ° C) medan gasning med 95% carbogen (95% O 2, 5% CO 2; 1/16 L/min) via direkt bubblande för inte mindre än 1 h.
- Prime raderna perfusion.
- Sänk inlopp röret ansluts till peristaltiska micro-pumpen i den förberedda aCSF (300 mOsm, pH 7,3-7.4, kontinuerligt gasade).
- Pass oxygenator enhet ( figur 2) och perfusion linjer genom både magneten bore och gradient spole stack (uppifrån och ned) och rullar åt sidan tills sonden församling. Hänga oxygenator ovan en bägare för att fånga någon aCSF utflödet.
Obs: Beroende på MRI systemdesign, perfusion linjer kan behöva överföras genom magnet bore och gradient spolar eller sond kropp bas före grundning systemet med aCSF. Bekräfta denna perfusion linje placering inte kommer att störa monteringen av sonden kroppen eller införande av sonden i hålet innan grundningen proceduren. - Kontrollera avsedda flödet (2 mL/min) är markerat och börja fylla raderna perfusion genom att byta pumpen.
- Invertera tom, i linje bubbelfällan så att aCSF kommer att tränga undan luften innehållet insida.
- Ansluta oxygenator ' s gas hamn till en andra källa till carbogen (ett samlingsrör eller en sekundär carbogen cylinder) och ange ett flöde på 1 / 16L/min.
- Bekräfta att carbogen flödar över oxygenator ' s gasutbyte membran genom doppning avgasporten ovanpå oxygenator i vatten.
- När aCSF upptäcks droppande från perfusion kammaren, rensa eventuella synliga gasbubblor från raderna inflöde av manuell agitation.
- Bekräfta oxygenator fungerar korrekt genom att dränka syre elektroden i den aCSF flödar från perfusion kammaren.
Obs: Läsningen på syre mätaren bör ungefärliga andelen syre som finns i den medföljande gas.
3. Vävnad förberedelse
- dödshjälp
- plats en råtta (125-150 g) in induktion av anestesi maskin och exponera till 4% isofluran i en syre transportören gas med en hastighet av 1 L/min för 4 min.
- Ta bort medvetslös råtta från anestesi kammaren.
- Utföra en rätande reflex test genom att placera råtta i ryggläge. Kontrollera om eventuella förflyttningar — huvud svarvning, benet lyft, ryggraden böjning, etc. — vägledande som djuret vänder till dess mage.
- Utför en öga-blink reflexiv test genom att trycka öppna ögat av djuret med hjälp av en bomullspinne. Kontrollera om något svar — lock stängning, muskelryckningar, etc. — till denna sinnesintryck.
- Slutligen utföra en lem-återkalla reflex test genom att nypa huden mellan tårna på råtta ' s utsträckta bakre benet med hjälp av pincett eller Peanger. Kontrollera för böjning av leg.
Obs: vid reflexiv testats positivt resultat, Fortsätt inte med dödshjälp. - i händelse av att någon av de tre reflex testerna framkallar en reaktion, omedelbart återvända råtta till anestesi kammaren och möjliggör en ytterligare 2 min exponering för 4% isofluran.
- Utför alla tre reflexiv tester över i sin helhet. Upprepa 2 min anestesi exponeringen vid behov och fortsätt endast när en total avsaknad av svar på alla tre reflexiv tester har observerats.
- Euthanize råtta via giljotin halshuggning.
- Hjärnan resektion
- ta bort råtthjärna genom brutto dissektion. Börja med huvudet i liggande ställning. Med sax, klippa rostrally genom huden från baksidan av halsen till näsan och exponera skallen.
- Ta bort mjukdelar från ytan av skallen med en trubbig sond.
- Arbetar från kaudala slutet, bort occipital, parietala, och pannben av kraniet med hjälp av rongeurs.
- Återkalla dura genom att skära längs den längsgående sprickan med micro sax och peeling tillbaka lagret från båda halvkloten.
- Ta bort hjärnan från skallen genom att vrida huvudet till ryggläge och bryta kranialnerver på ventrala sida.
- Bit isolering
- tillbaka hjärnan till den liggande ställning och isolera den centrala delen som innehåller hippocampus genom att ta bort alla vävnader stjärtfenan till den tvärgående sprickan och rostralt om fimbria. Gör två snitt längs tvärplanet (dvs koronalt skivor) med en raka kanter rakhyvel.
- Anbringa hjärnan ' s caudal-mest planet till mitten av badkar vibratome skärning med cyanoakrylat lim.
- Lägg till iskall, carbogen bubblade aCSF till vibratome skära bad och placera den nylon lagring hårdvaran inuti.
- Skära 300 μm tjocka skivor att få 3 till 4 användbara slice preparat per halvklotet (6 till 8 totalt).
- Isolera en hippocampus eller kortikal avsnitt från ena hjärnhalvan och trimma skiva så att den passar i microcoil ' s 5 mm diameter vävnad väl.
4. Prova positionering och Perfusion systemmontage
- spole förberedelse
- Fyll i microcoil ' s vävnad kammare med syresatt aCSF från vibratome ' s skära bad med överföring pipett.
- Ta trimmade hjärnan provet och position regionen av intresse (t.ex. pyramidal celllagrar) över den microcoil som använder en dissekera omfattning.
- Infoga vävnad bevarande enheten (nylon mesh nät anbringas på nylon bricka) att behålla provposition hela imaging experimentet.
Obs: Gå snabbt igenom provet positionering förfarande för att minimera exponeringen för intensivt ljus. Ge extra syresatt aCSF som behövs med överföring pipett.
- Montering av i-bore oxygenator, microcoil och sond
- säkra den modifierade microcoil församlingen ( figur 3) i en tabell klämma och anbringa i-bore oxygenator enheten genom att sätta in den Acetal stöd peg i hålet ovanpå spolen.
- Tätning perfusion systemet genom att placera perfusion kammaren över microcoil ' s vävnad väl och cinching de två tillsammans med bandklamma miniatyr.
- Trimma överflödigt längden från buntbandet använder avbitare.
Obs: Vid framgångsrik tätning, perfusatet bör observeras avsluta genom raderna utflöde och inget läckage bör vara uppenbart runt silikontätning av perfusion kammaren. Underlåtenhet att bekräfta dessa villkor innan sonden montering kan leda till allvarliga skador för imaging hårdvara. - När aCSF kan ses droppade in i avfall reservoaren, ta microcoil och oxygenator och bifoga församlingen till toppen av imaging sonden kroppen.
- Skjut gradient stacken över församlingen och sits övertoningen ovanpå sonden. Fotografier med relativ placering och korrekt anslutning av spolen, oxygenator och sond maskinvarukomponenter tillhandahålls ( figur 4).
5. Utför herr bild samlingen
- Infoga monterade sonden in i magneten bore
- plats sonden kroppen i nära närhet till spektrometern bore öppning längst ned på magneten.
- Dra tillbaka överskjutande längd perfusion linjer genom hålet öppna överst i magneten.
- När alla tillgängliga slack har tagits upp från raderna perfusion, advance sonden kroppen in i magneten bore vid basen och samtidigt ta mer slack från perfusion linjer från toppen av hålet.
- Trä två låsskruvarna på basen av sonden i motsvarande skåror på shim bunten.
- Innan du fortsätter, kontrollera att perfusion linjerna inte kläms eller klämd under sonden insättningspunkten genom att bekräfta aCSF utflöde i avfall behållaren.
Obs: Om du inte bekräftar perfusatet utflöde kan resultera i permanent skada till perfusion linjer och risker katastrofala skador på MR imaging hårdvara. - Vid ingen perfusatet ses spännande returledningen i avfall behållaren, ta bort sonden kroppen och bekräfta att perfusatet flöde har återupptog innan du försöker återinträde. En Schematisk layout av den sammansatta perfusion system och imaging spektrometern har tidigare beskrivits 8.
- Ansluta Probe kroppen
- bifoga inflöde och utflöde vattenlinjer från gradient kylmaskinen.
- Slå på pumpen för gradient kylmaskin och bekräfta inställningen vatten temperatur (19 ° C).
- Bifoga luftslangen från kylmaskin aggregat till sonden kroppen med en slangklämma.
- Vrid vredet flöde på kylmaskin aggregat till de " 1 " ställning.
- Bifoga termoelement tråd till sonden kroppen.
- Tillmäter radiofrekvens (RF) input/output på sonden kroppen koaxialkabeln från preamp ' s proton (H) kanal.
- Koppla strömkabeln från gradient förstärkarna till sonden kroppen.
- Inuti the RF skåp, slå på strömmen till enheten B0 ersättning, alla tre gradient förstärkare (x, y, z), och den master affärsenhet
- Förbereder spektrometern
- ställa in avsedda hålet temperatur använder modulen variabel temperatur justering vid konsolen.
- Matchar (impedans) och finjustera (frekvens) RF krets genom att justera de variabla kondensatorerna i sonden. Detta åstadkoms genom att manipulera trollstavar vid basen av sonden kroppen.
- Justera de aktuella inställningarna för spektrometern ' s shim spolar att maximera magnetfältet homogenitet på provet.
- Påbörja bildsamling
- samla pilot bilder att avgöra ditt prov inom magneten rumsliga position bore. Typiska parametrar för två dimensionell gradient echo är följande (TR/TE = 100/4 ms, medelvärden = 1, puls vinkel = 30 o, tid = 6 SEK, matrix = 64 x 64, synfält = 0,3 x 0,3 cm, upplösning = 47 x 47 μm).
- Samla diffusion-viktade piloter för att bekräfta korrekt scan geometri och vävnad ståndpunkt om tillämpligt. Typiska parametrar för två dimensionell diffusion-viktade pilot scan är följande (TR/TE = 2000/11,6 ms, tid = 4,3 min, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, medelvärden = 1, b = 1200 (1860 effektiv) s/mm 2, matrix = 64 x 64, synfält = 0,2 x 0,2 cm upplösning = 31 μm).
- Samla en diffusion-viktade tidsserier för att bestämma stabilitet kännetecknar akut slice beredning. Typiska parametrar för två dimensionell diffusion vägda bild är följande (TR/TE = 2000/11,6 ms, tid = 1,5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, medelvärden = 42, b = 1200 s/mm 2, matrix = 64 x 64, synfält = 0,2 x 0,2 cm, upplösning = 31 μm). Obs: Karakterisera stabilitet i ett givet system kommer att variera från protokollet beskrivs beroende på faktorer som herr kontrasten anställd (t.ex. T1, T2, diffusion, mottaglighet), den fysiska störning som studerade och herr signal ändringen per tidsenhet följd av sade störning.
Representative Results
Perfusatet förberedelse
Vid lyckad anställning av i-bore syresättning enheten når gaser finns i den medföljande carbogen 100% mättnad villkor inom den aCSF perfusatet. Detta kan bevisas av varierande syrekoncentrationen i medföljande gasen och mäta förändringen i lösta syrehalten i den aCSF perfusatet inom perfusion kammaren använder en syre mätare (figur 1)8. Enligt Henrys lag är mängden upplöst gas som är i jämvikt med ett flytande prov direkt proportionell mot partialtrycket av denna gas under förutsättning att temperaturen är konstant12. Använda denna kunskap och precision gasnormer, är det möjligt att kvantifiera mängden löst syre som finns i en aCSF provet som beskrivs. Detta uppnås genom kalibrera mätaren syre med hjälp av mättade lösningar (direkt bubblade i 1 h eller mer) av aCSF utsätts för gaser med känd sammansättning: en gas med hög syrehalt såsom carbogen (95% O2) och en annan med låg syrehalt koncentration som kväve (0% O2). Efteråt, kan mätningar utföras genom att dränka spetsen av syre elektroden i ett urval. Bekräftelse att de i-bore oxygenator fungerar korrekt kan uppnås genom att mäta utflödet från perfusionen väl. Procent upplöst syre ska mätt med syre mätare matcha den procentiga koncentrationen av syre levereras i utbudet gasen. Om de uppmätta värdena är lägre än i gas som leverans, tyder detta på ett maskinvarufel som kan leda till metabola insufficiens i vävnad segmentet.
Prov utseende och beteende
Akut slice preparat som tar emot perfusion räcker för att leverera nödvändiga metaboliter och bära bort metabola avfall snart nå ett tillstånd av relativ stabilitet. Från den punkten, akut skivor kan utsättas för yttre störning och deras svar på dessa förändringar kan mätas för vetenskaplig studie. För herr experiment är spåra signalera av intresse över tid en vanligt förekommande praxis att demonstrera den relativa stabiliteten i akut slice preparat13. Diffusion-viktade signalen är särskilt känslig för förändringar i en vävnad vatten rörlighet, innehåll och distribution, som kan uppskattas genom användning av denna kontrast mekanism att upptäcka infarcts i ischemisk stroke14,15. Plottning normaliserade diffusion signalen över tid i akut kortikala skivor underhålls under en mängd perfusion villkor visar relativt stabilitet (2 ± 3% över 15,5 h) efter vävnad isolering uppnås (figur 5). Diffusion signal stabilitet upprätthölls oavsett perfusion villkor (intermittent eller kontinuerligt) eller MRI scan längd (kort [4 min] eller lång [1,5 h])8. Om skivor inte uppvisar signal stabilitet över tid, såsom skarpa diffusion signal ökningen observerade i levande cortex som inte fick perfusion, är suggestiva suboptimala experimentella betingelser. Störning experiment bör inte utföras innan bekräftelse av stabil signalvillkor i slice preparat.
Utöver signal stabilitet, måste rätta prov positionering bekräftas vid tidpunkten för bildsamling. Även om provposition kontrolleras under vävnad placering vid mikroskopet dissekera, kan förskjutningar i provposition uppstå under monteringen av perfusion apparater, eller på grund av ovarsam hantering av spole eller sonden innan införande i magneten. Bekräftelse av lämplig Hippocampus placering kan uppnås genom att samla kort (2 min), pilot File med diffusion kontrast (figur 6). Eftersom det pyramidala celllagrar är mer känsliga för diffusion viktning än de intilliggande Hippocampus bladskivan, visas denna struktur som ett mörkare band i diffusion-viktade bilder. Uppställningar som inte visar detta kännetecken innehåller off-center prover och kommer sannolikt att behöva upprepas.
Figur 1: Upplöst syrehalten i aCSF perfusatet som en funktion av procent O2 innehållet i medföljande gas. Carbogen blandningar som innehåller varierande koncentrationer av syrgas (95%, 60% och 19%) är anställd som en leverans gas. Procent löst syre avläsningar sedan tas från perfusionen väl och jämfört med två kända kontroller: en perfusatet reservoar bubblade direkt med carbogen (95% O2), och en perfusatet reservoar utsätts för atmosfäriska förhållanden (23% O2 ). I varje fall, procent syremättnad på platsen vävnad perfusion närmar sig 100% O2 koncentrationen inom carbogen blandningen används. Felstaplar är lika med standardavvikelsen för sampelmedelvärden. Figur Reproducerad med tillstånd från den ursprungliga artikel8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk ritning av i-bore oxygenator och perfusion kammaren. Detta diagram visar detaljerad designelement ansvarar för funktionen av dessa kritiska enheter. Färsk perfusatet som har pumpats genom en bubbelfälla träder oxygenator genom toppen av en 10 mm NMR tube. Därvid det övergångar till en gas som mycket genomsläpplig silikon slangar (blå segment) som är lindad runt en öppen, 5 mm NMR-röret inuti. Carbogen gas som levereras genom toppen av 5mm röret in i kammaren genom öppen botten och passerar över ringlar silikon slangar innan du avslutar oxygenator genom ett ventilationshål i 10 mm tube cap. Under denna exponering, blir den perfusatet strömmar genom silikon röret mättad med de kemiska komponenterna medföljande gasblandningen. När du lämnar oxygenator, passerar perfusatet direkt in i perfusion kammaren innan returledningen leder till en avfallsinsamling reservoar. Andra komponenter som är kritiska till denna design inkluderar acetal stöd peg som tillåter oxygenator stå vertikalt ovanpå den modifierade RF microcoil, en bricka med silikon (röd ring) som bildar den Vätsketäta tätningen mellan den oxygenator perfusion kammare och den microcoil vävnad väl och buntbandet notch som rymmer placeringen av ett buntband används för att bilda denna reversibel tätning. Denna siffra har modifierats och återges med tillstånd från den ursprungliga artikel8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ändringar i den microcoil församlingen som tillåter gränssnitt till den i-bore oxygenator. Två spår 3.0 mm x 1,5 mm (svarta pilar) var skuren i sidan av församlingen som rymma bredden på ett buntband används för att försegla kammaren perfusion. En kanal (15 x 3 x 4 mm) ansluter dungar över den baksida ytan av spolen. Två nylon utrymmen placerade i sidorna på kanalen (röda pilar) lagen som en fångst för kabel slips huvudet som underlättar förfarandet tätning. Ett hål (2 x 14 mm) borras i toppen av församlingens spole (gula arrow) stöder kopplingar till acetal peg för att säkra oxygenator. Denna siffra har modifierats och återges med tillstånd från den ursprungliga artikel8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: foto montage med relativ placering och korrekt montering av microcoil, oxygenator och sonden komponenter. Dessa bilder har nyckel hårdvarukomponenter av i-bore oxygenator och microperfusion enheten och illustrera hur de olika delarna gränssnitt med en another. (A) sprängskiss foto som visar den relativa placeringen av alla komponenter före försegling av vävnaden väl eller montering av sonden kroppen. Omsorg har tagits för att visa den relativa positionen av delar exakt; dock har ett avsnitt av perfusion raderna fördubblats tillbaka i denna serie så att alla komponenter passar inom bildramen. (1 = sonden huvud, 2 = microcoil församling, 3 = nylon vävnad bevarande ring, 4 = perfusion, 5 = buntband, 6 = i-bore oxygenator, 7 = lutning spolar, 8 = bubbelfälla). (B) komponenter efter montering av spole och oxygenator. I denna bild, har nylon retention ringen placerats inom den microcoil vävnad väl att säkra ett urval. Acetal stöd peg på basen av oxygenator har säkrats i motsvarande hål på toppen av microcoil. Silikon packningen på den öppna änden av perfusionen väl har placerats över vävnad brunnen och bandklamma har stramats åt dessa komponenter för att försegla kammaren perfusion. Slutligen har basen av microcoil varit ansluten till toppen av sonden huvudet. (C) komponenter efter sonden församling. I den sista panelen, har överskjutande längd från buntbandet trimmats jäms med microcoil. Gradient spole stacken är sedan gled in i position genom att omsorgsfullt främja cylindern mot sonden stundbortgång överskott perfusion linjer, oxygenator och microcoil genom sina ihåliga. När Övertoningarna är ansluten till sonden huvudet, är de hålls på plats genom att skruva den säkra kragen på sonden över den gängade bas av till övertoningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Diffusion signal stabilitet i superfused akut kortikala skivor. (A) Normalized diffusion signalen värden i fyra akut skivor utsätts för olika superfusion paradigm ritas över tiden för en period av upp till 21,5 h följande dödshjälp. Skivor hållas inom ± 5% av deras ursprungliga diffusion signal mätningen under en period av 15,5 h följande dödshjälp oavsett om superfusion är kontinuerlig eller intermittent och oberoende av herr scan längd (1,5 h eller 4 min). Signal inspelningar tas från formaldehyd-fasta cortex tjäna som positiv kontroll (n = 1) för stabilitet på grund av fasta vävnadsprover statisk, oföränderlig. Omvänt, diffusion signal mätt i en levande bit frånvarande superfusion stöd (n = 1) fungerar som en kontroll för metabola brist. Experimentet parametrar av olika superfusion prövningar är följande: kontinuerlig (superfusion alltid på, tid per skanning = 1,5 h), intermittent (superfusion på för 10 min intervall mellan skanningar, tid per skanning = 1,5 h), långa intervall, lång scan (superfusion på under genomsökning, men pausade för 10 min mellan skanningar, tid per skanning = 1,5 h), långa intervall, kort scan (superfusion på 1,5 h intervall mellan skanningar, tid per skanning = 4 min). (B) analyserade data visar gruppen innebär de fyra live-skiva superfusion experiment från panelen (A). Diffusionen signal profil från de grupperade superfused kortikala skivor uppvisar lite variation över tiden (2 ± 3% över 15,5 h) medan icke-perfusion kontroll (n = 1) uppvisar dramatiska signal instabilitet i början av experimentet (15% av 6,5 h). Denna siffra har modifierats och återges med tillstånd från den ursprungliga artikel8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: bekräftelse av hippocampus slice placering under pilot imaging. Innan du kör en utökad herr mikroskopi session, rätt placering av provet är avgörande för att säkerställa resurser såsom scanner tid och dyra perfusatet tillsatser är inte bortkastade. Den pyramidala cellager i regionen CA1 i hippocampus kan visualiseras i snabbare (4,3 min), lägre upplösning (31 μm x 31 μm i-plan) pilot skanningar att säkerställa vävnaden av intresse är korrekt placerad i förhållande till mikro-spolen. Scan parametrarna gemensamma för båda bilderna är som följer: TR/TE = 2000/11,6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 ms, medelvärden = 1. (A) b = 0 (227 effektiv) s/mm2. I detta preliminära scan syns de stratum pyramidale bara som en grå, diagonala bandet centrerad i spolens excitation profil. (B) b = 1200 (1 860 effektiv) s/mm2. Röstviktning, interlamellar kontrast ökar vid högre diffusion som det pyramidala celllagrar blir mörkare än vävnader i de intilliggande bladskivan (ovan: stratum oriens; nedan: stratum radiatum). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det nuvarande protokollet beskriver förfaranden som är nödvändiga för standarden metabola underhåll av akut hjärnskada slice preparat genomgår magnetisk resonans mikroskopi. Detta förfarande är den enda metoden för närvarande tillgängliga som möjliggör visualisering av levande däggdjur vävnader med herr upplösningar kan lösa celler. Medan de perfusatet villkor som beskrivs är skräddarsydda för centrala nervsystemet vävnader, protokollet är allmänt anpassas till någon slags levande vävnad förberedelse genom justeringar av beståndsdelarna perfusatet och gas samt perfusion flöde och temperatur.
De vanligaste problemen som kan påträffas under de beskrivna förfaranden omfattar de relaterade till brister i metaboliten leverans. Utfällning av kalciumsalter kan uppstå inuti aCSF under gasformiga insufficiens till följd av brister i den bikarbonat buffring system. Sådana fällningar kan täppa till raderna perfusion och svår hårdvara skada. Om salt fällningar observeras i den perfusatet efter sonden församling, perfusion flöde omedelbart upphöra genom att stänga av den peristaltiska pumpen. Bekräfta förekomsten av tillräcklig natriumbikarbonat (4,37 g/2 L) i perfusatet, CO2 nivåer (5,0%) i leverans samt carbogen gasflödet (1/16 L/min) till både reservoar och oxygenator. Slutligen bekräfta pH-nivåer är stabiliserad i fysiologiska intervallet (7,3-7,4). I händelse av att syrehalten gas och pH inte regleras fortfarande lämpligt, bör gasutbyte membranet ersättas.
Om skivor inte uppvisar signal stabilitet över avsedda experimentell tid-kursen, bekräfta att de rätta kemiska beståndsdelarna finns i aCSF blandningen och att de rätta osmolalitet (300 mOsm) och pH (7,3-7,4) upprätthålls. Kontrollera också carbogen gas levereras till perfusatet reservoar och oxygenator på 1/16 L/min. Om dessa steg inte löser perfusatet villkor, rekommenderas byte av gasutbyte membranet. Om vävnad stabilitet inte uppnås efter felsökning perfusatet villkoren, överväga förfining av kirurgiska protokollet med fokus på att minimera tidsintervallet mellan vävnad skörd och perfusion tillämpning.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637), och National Science Foundation (samarbetsavtal No. DMR-1157490) genom den nationella höga magnetfält laboratorium (NHMFL) avancerad magnetisk resonanstomografi och spektroskopi (AMRIS) anläggningen på UF och delstaten Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate Preparation | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
| Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
| Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
| pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
| Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
| Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
| Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Preparation | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
| Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion System | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
| Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
| e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
| in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MR Imaging Hardware | |||
| Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
| Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
| Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
| 600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
| Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
| Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
| Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |
References
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
