Summary
يصف لنا تقنية للجمع بين التدفق الخلوي وتسلسل الإنتاجية العالية لتحديد مناطق تكرار التأخر الجينوم.
Abstract
وقد وضعت العديد من التقنيات لمتابعة التقدم المحرز في تكرار الحمض النووي من خلال المرحلة S من دورة الخلية. وتم توجيه معظم هذه التقنيات نحو توضيح مكان وتوقيت بدء ازدواج الجينوم بدلاً من إتمامها. ومع ذلك، من المهم أن نفهم مناطق الجينوم التي آخر لإكمال النسخ المتماثل، نظراً لأن هذه المناطق تعاني من مستويات مرتفعة من الكسر الصبغية والطفرات، وأنها كانت مرتبطة بالمرض والشيخوخة. هنا يصف لنا كيف قدمنا تقنية التي استخدمت لرصد بدء النسخ المتماثل بدلاً من ذلك تحديد تلك المناطق للجينوم آخر لإكمال النسخ المتماثل. ويستند هذا النهج مزيجاً من التدفق الخلوي وتسلسل إنتاجية عالية. على الرغم من أن هذا التقرير يركز على تطبيق هذه التقنية على الخميرة، يمكن استخدام هذا النهج مع أي الخلايا التي يمكن تخزينها في سيتوميتير تدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي.
Introduction
يتم بدء النسخ المتماثل للجينوم حقيقية النواة في عدة مواقع منفصلة، تسمى أصول النسخ المتماثل للنسخ المتماثل التي تنطلق شوك في كلا الاتجاهين (استعرض في فركوس et al.، 20151). أصول تختلف في التوقيت والكفاءة لإطلاق النار على حد سواء، وقد وضعت العديد من التقنيات مراقبة نشاط المنشأ النسخ المتماثل وتوضيح أسباب هذا الاختلاف. النشاط الفردي إلى أصول يمكن أن يستدل من مستويات واحدة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي2، الذي يشكل حول أصول نشطة، أو باستخدام هلام 2D التفريد لمراقبة النسخ المتماثل محددة وسيطة3، اللتين يمكن اكتشافه مع المسابر المشعة. كل من هذه التقنيات تطبق بسهولة أكبر في S. cerevisiae مما في خلايا الثدييات، لأن أصول محدودة لمتواليات محددة معروفة في السابق. ومع ظهور [ميكروارس]، أصبح من الممكن لتقييم الأصل يطلقون النار على الصعيد العالمي. وكان ذلك أولاً بوسم الحمض النووي مع النظائر الثقيلة وإطلاق الخلايا من كتلة G1 في النظائر الخفيفة التي تحتوي على المتوسط ثم رصد تشكيل الهجين الخفيفة الثقيلة الحمض النووي عبر الجينوم4. إدخال تسلسل إنتاجية عالية سمح مماثلة على نطاق الجينوم رصد نشاط المنشأ دون اشتراط وسم النظائر باهظة الثمن. تم فرز الخلايا في سيتوميتير تدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي وعينات من الحمض النووي تخضع لتسلسل عميق. لأن التغطية تسلسل عائدات من س 1 إلى 2 x خلال المرحلة S، يمكن تقييم توقيت تكرار نسبي بمقارنة قراءة أعماق الخلايا في مرحلة ثانية إلى تلك الموجودة في G1 أو G25،6. وأدت هذه التقنيات، خاصة تطبق على الخميرة، إلى فهم أعمق لكيفية تنظيم تسلسل الحمض النووي وهيكل الكروماتين، والبروتينات النسخ المتماثل الحمض النووي توقيت المنشأ والكفاءة.
المؤمنين انتقال المعلومات الوراثية من خلال انتشار الهاتف الخلوي يتطلب ليس فقط نجاح بدء تكرار الحمض النووي، الذي يقام في أصول، ولكن أيضا إتمام النسخ المتماثل, الذي يحدث حيث يجتمع شوك النسخ المتماثل بنجاح. مثل بدء النسخ المتماثل، يختلف توقيت الانتهاء من النسخ المتماثل عبر الجينوم مع بعض المناطق المتبقية unreplicated حتى وقت متأخر في دورة الخلية. هذه المناطق قد تكون خاصة بعيدة عن أصول النسخ المتماثل النشط أو قد تحتوي على تسلسلات أو هياكل الكروماتين التي تعوق بولمرس الحمض النووي. تأخر النسخ المتماثل المناطق يمكن أن تعبر عن نفسها كالمواقع الهشة، والتي ترتبط بمعدلات الطفرة والكسر الصبغية، وقد تورط في السرطان وشيخوخة7،،من89. ومع ذلك، على الرغم من أهمية الإنجاز السليم لتكرار الحمض النووي في صون الاستقرار الجينوم، فهمنا لاين وكيف يحدث ذلك تخلفت لبدء النسخ المتماثل. وبينما الجينات الفردية النسخ المتماثل المتأخرة التي تم إقرانها مع المرض وقد درست مع، على سبيل المثال، قبكر10، الدراسات العالمية التي تستهدف توضيح المواقع والأسباب في وقت متأخر قد تفتقر إلى النسخ المتماثل. هنا يصف لنا تقنية نشير إليه بوصفه "seq G2" التي نجمع بين التدفق الخلوي مع تسلسل الإنتاجية العالية لتسليط الضوء على إكمال النسخ المتماثل الجينوم في الخميرة11. مع بعض التغييرات الطفيفة، يمكن أن تتكيف مع هذا البروتوكول أي الخلايا التي يمكن فرز التدفق وفقا لمحتوى الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الخلايا للتدفق الخلوي الفرز
- تطعيم 15 مل أنابيب الاختبار التي تحتوي على 8 مل من كل من مرق ييبد أن الثقافات تصل كثافة 5 × 106 إلى 1.5 × 107 خلايا كل مل بعد النمو بين عشية وضحاها (انظر مناقشة الملاحظة 1).
- تدور أسفل خلايا الخميرة (1,400 س ز، في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجة مئوية) في أنبوب الطرد مركزي ملولبة 15 مل لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند الخلايا في الإيثانول 70% 1.5 مل، ونقل إلى 1.6 مل [ميكروفوج] أنابيب، ترك هذا الجلوس ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو على الأقل 3 ح على الجليد ( ويمكن تخزين إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية) (انظر المناقشة نقطة (2)).
- تدور أسفل خلايا الخميرة في [ميكروفوج] (14,000 س ز، 4 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة، ريسوسبيند في 1 مل سترات الصوديوم 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2، تدور إلى أسفل (س 14,000 ز، 4 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة، نضح المادة طافية، ريسوسبيند في 1 مل سترات الصوديوم 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2 ، التي تحتوي على 0.25 مغ/مل الحل رناسي ح 1 عند 50 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حمام الحرارة كتلة أو المياه.
- إضافة 50 ميليلتر بروتيناز ك حل (20 ملغ/مل حراكه في 10 ملم تريس pH 7.5، كاكل 2 مم2، الوزن 50% لحجم والغليسيرول) واحتضانها ح 1 في 50 درجة مئوية.
- تدور أسفل الخلايا (14,000 س ز، 4 درجة مئوية)، ريسوسبيند الخلايا في 1 مل سترات الصوديوم 50 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2، تدور إلى أسفل (14,000 س ز، 4 درجة مئوية)، ونضح المادة طافية مع الفراغ، ريسوسبيند في 1 مل 1 ميكرومتر الحمض النووي الأخضر سلالة حراكه في سترات الصوديوم 50 مم ، الرقم الهيدروجيني 7.2 واحتضان في الظلام ح 1 في درجة حرارة الغرفة، sonicate 2 x 2 s كل (إنتاج الطاقة 2 واط).
2-الخلية الفرز
- استخدام أرز خلية، فرز الخلايا وفقا لمحتوى الحمض النووي في المراحل G1 و S، "G2 المبكر" و "أواخر G2"، جمع الخلايا فرداني مالا يقل عن 1.6 مليون من كل مرحلة من مراحل دورة الخلية كما هو الحال في الشكل 1 (انظر مناقشة نقطة (3)).
- نقل الخلايا إلى [ميكروفوج] أنابيب وتدور أسفل الخلايا لمدة 20 دقيقة في ز س 14,000 في 4 درجات مئوية في [ميكروفوج] ونضح المادة طافية مع فراغ (يمكن تخزين بيليه المجمدة في-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى؛ وانظر المناقشة في النقطة (4)).
3. استخراج الحمض النووي وإعداد ترتيب المكتبات
ملاحظة: الخطوات التالية تستند إلى "البروتوكول الأول" في استخراج "الحمض النووي الخميرة" كيت (انظر الجدول للمواد).
- إضافة ميليلتر 120 "المخزن المؤقت الهضم," المخزن مؤقت ملكية مما يتيح الخميرة الإنزيم الحال هضم جدار الخلية، و 5 ميليلتر من الخميرة الإنزيم الحال وريسوسبيند فورتيكسينج، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 40-60 دقيقة.
- إضافة ميليلتر 120 "تحلل المخزن المؤقت," المخزن مؤقت ملكية التي تحتوي على مواد التنظيف، ودوامه الثابت ل s 10-20.
- إضافة 250 ميليلتر كلوروفورم--مزيج دقيق لمدة 1 دقيقة.
- تدور بأقصى سرعة ممكنة في [ميكروفوج] لمدة 2 دقيقة.
- تحميل المادة طافية على عمود ربط الحمض النووي وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة في [ميكروفوج] مدة 1 دقيقة.
- إضافة 300 ميليلتر "الحمض النووي الغسيل المخزن المؤقت," المخزن مؤقت ملكية التي تحتوي على الإيثانول، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة في [ميكروفوج]. تجاهل التدفق من خلال إضافة 300 ميليلتر من "المخزن المؤقت ليغسل الحمض النووي" وكرر عملية الغسيل.
- نقل العمود تدور أنبوب [ميكروفوج] جديدة وإضافة 60 ميليلتر من الماء (ليست الشركة المصرية للاتصالات)--الانتظار 1-3 دقيقة وثم الطرد المركزي لمدة 10 ق الوت الحمض النووي.
- قياس تركيز بإضافة 5 ميليلتر من الحمض النووي إلى 195 ميكروليتر من دسدنا حساسية عالية الكاشف الذي تم المخفف 1: 200 في المخزن المؤقت لحساسية عالية دسدنا ومن ثم تدبير الأسفار في فلوروميتير، باستخدام 10 ميليلتر من المعايير التي تم توفيرها للمعايرة؛ نتوقع بين 10 و 50 نانوغرام من الحمض النووي العائد الإجمالي.
- Sonicate (ذروة الحادث قوة 450، وعامل واجب 30 ٪، دورات الواحدة 200 انفجر، العلاج وقت 60 ثانية، 6 منسوب المياه) تفكك الحمض النووي إلى 250-350 شركة بريتيش بتروليوم شظايا.
- إعداد مكتبة باستخدام مجموعة إعداد عينة من الحمض النووي وتسلسل (bp 50 على الأقل 10 مليون واحد في نهاية القراءة) أنه على أداة تسلسل الحمض النووي في الوضع السريع (انظر مذكرة للمناقشة (5)).
4-تحليل تسلسل البيانات وتوليد للنسخ المتماثل بملفات التعريف
- محاذاة متواليات الجينوم sacCer3 Saccharomyces cerevisiae باستخدام جسناب12 (انظر مذكرة للمناقشة (6)).
- تحديد زوج كل قاعدة قراءة الأعماق باستخدام برنامج "جينوميكوفيراجيبيد" بيدتولس13.
- إزالة أرتيفاكتوال من طفرات في أعماق القراءة، إذا كانت موجودة (انظر مذكرة للمناقشة (7)).
- قراءة سلسة أعماق كروموسوم استخدام المتوسطات في 20 كيلو بايت انزلاق النافذة باستخدام الدالة "رنمين" في البحث والتطوير حزمة "كاتولس" (انظر مذكرة للمناقشة (8)).
- قراءة المؤامرة الأعماق في المرحلة وأوائل G2 G2 أواخر S كنسبة مئوية من أعماق قراءة منسوخة تماما (انظر مذكرة للمناقشة (9)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدمنا الإجراء الموضح أعلاه لتحديد المواقع تكرار التأخر في مهدها الخميرة. اختبار هذا النهج باستخدام منطقة تكرار تأخر معروفة على كروموسوم اصطناعي أثبتت هذه التقنية أن تكون دقيقة وموثوق بها. لدينا أيضا أظهرت النتائج الأهمية البيولوجية لإكمال النسخ المتماثل في الوقت المناسب من خلال إظهار أن منطقة تكرار تأخر على كروموسوم 7، التي حددناها كتكرار التأخر استناداً إلى النتائج التي توصلنا إليها G2 seq، قد فقدت تقريبا ثلاثة إضعاف أكثر مما يمكن مقارنتها مراقبة المنطقة11.
ويرد مثال محدد للنتائج مع G2 seq في الشكل 2. وقد افترضنا أن هناك سوف تكون مناطق الجينوم تكرارها لا سيما المتأخرة في خلايا تفتقر deacetylase بروتين يسمى Sir2. ويبين الشكل 2 ألف التقدم لتحليل البيانات لنوع البري (الأزرق) و sir2 (أحمر). تحتوي على البيانات الخام (الصفوف العليا) طفرات كبيرة، معظمها من المقرر أن وجود عناصر تاي. تتم إزالة هذه المسامير بوضع حد أقصى أعماق القراءة في 2.5 x متوسط قراءة متعمقة لكل عينة (الصفوف المتوسطة). ثم هي ممهدة البيانات ديسبيكيد مع نافذة منزلقة 20 كيلو بايت (الصف السفلي). وأخيراً، تطبيع البيانات ورسم كنسب إلى المستويات في G1. يتم تمييز منطقة نموذجية تأخر النسخ المتماثل التي تظهر في الطور sir2 في الشكل 2.
رقم 1- التدفق الخلوي الشخصية التي تشير إلى كسور دورة الخلية المستخدمة؛ وضع علامة على الحدود الخارجية لجميع البوابات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2- (أ-ب) ديسبيكيد البيانات (الصفوف المتوسطة) التقدم لمعالجة البيانات من البيانات الخام (الصفوف العليا)، وصقل البيانات (الصفوف أسفل) للبرية من النوع (A) و sir2 (ب). (ج) نسب S المرحلة المبكرة G2، وأواخر G2-G1 قراءة الأعماق. نوع البرية في sir2 باللون الأحمر والأزرق. المنطقة المبرزة في الجزء العلوي الأيمن يظهر تأخر النسخ المتماثل منطقة محددة للمسخ sir2 . يشير الجدول إلى جزء من النسخ المتماثل الكامل (2N)؛ سوف تظهر خلية unreplicated تماما في 0.5، خلية المنسوخة نسخاً متماثلاً تماما في 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن هذا الأسلوب قوية ومستقيمة نسبيا، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لما يلي:
(1) نوصي بأن الثقافات تنمو على الأقل 12 ح قبل أن تصل إلى مرحلة سجل، نظراً لاختلافات واضحة في توزيع دورة الخلية إذا الثقافات يتم حصادها بعد بعد أن بلغت ح الكثافة المطلوب 4 فقط بعد التطعيم. لدينا الافتراض هو أن توزيع دورة الخلية التي وصلت إلى توازن مستقر نسبيا يمثل أفضل توزيع مرحلة سجل "حقيقي" من توزيع التي لا تزال في التمويه عندما تم نقل ثقافة مشبعة في الآونة الأخيرة إلى متوسطة جديدة.
(2) بدلاً من الغزل أسفل الخلايا قبل تحديد، يمكن أن تكون الخلايا ثابتة أيضا بإضافة الإيثانول 100% لثقافة الخميرة مباشرة حيث يكون التركيز النهائي من الإيثانول 70%. يمكن زراعة الخلايا في المتوسطة (ييبد) الاصطناعية أو الغنية.
(3) هي تصور مراحل دورة الخلية للفرز حسب عدد الخلايا التآمر كدالة مجال الانبعاثات 530 نانومتر. وقد وجدنا أن نقطة انعطاف بين G1 و S وبين S و G2 بمثابة معالم قوية لتحديد مرحلة ثانية، ونحن نستخدم الحد الأقصى G2 الحدود لفصل G2 المبكرة والمتأخرة. ونحن نستخدم المصطلحات "G2 المبكر" و "G2 الراحل" للوضوح والإيجاز، وربما على حساب الدقة، بمعنى أن الخلايا من الناحية الفنية في مرحلة ثانية حتى أنهم أكملوا تكرار الحمض النووي. على الرغم من أن هدف G2 seq هو تحديد مواقع النسخ المتماثل متأخرة جداً، والتي من المتوقع أن يكون كشفت في أواخر الكسر G2، نقوم بجمع المرحلة S وخلايا G2 المبكر لمتابعة النسخ المتماثل من خلال جميع مراحل دورة الخلية.
(4) من المهم أن الخلايا تكون نسج أسفل فورا بعد الفرز. لا تدع الخلايا الجلوس بين عشية وضحاها قبل الغزل منها إلى أسفل. وقد كان لدينا مشاكل استعادة الخلايا باستخدام الطرد المركزي إذا قد تم تخزينها في 4 درجات مئوية، مما يشير إلى أن تصبح هشة عند الفرز ومع مرور الوقت.
(5) كعدد قليل كما يقرأ 5 مليون الكافية، ولكن المؤامرات أصبحت أقل سلاسة مع عدد أقل من ما يلي. مجموعات البيانات بأقل ما يلي: قد تكون قادرة على استيعاب بتجانس مع windows أكبر من 20 كيلو بايت، ولكن نحن لم أحاول هذا.
(6) وسيعمل برنامج المحاذاة المستخدمة على نطاق واسع أي (مثلاً، Bowtie14، نوفاليجن (http://www.novocraft.com)، والتحالف15، أو جسناب12).
(7) إظهار بيانات التسلسل عالية الإنتاجية من الخميرة التموج أحياناً في أعماق القراءة، التي غالباً ما تعكس عناصر تاي. علينا القضاء على هذه عن طريق الاستعاضة عن 2.5 x متوسط العينة قراءة الأعماق للأعماق قراءة خارج المناطق المعروفة لاحتواء الامتدادات متكررة (مثلاً، المتاشب) التي أكبر من 2.5 x متوسط. المتاشب ونهايات الكروموسومات مستبعدة نظراً لأنها معروفة لاحتواء العناصر المتكررة. مثال على هذا "ديسبيكينج" باستخدام لغة R هي ما يلي:
# إنشاء إطار بيانات يسمى "يقرأ" الذي يحتوي على البيانات:
لجنة حقوق الإنسان <-مندوب ('شري'، 10)
نقاط البيع <-seq (1، 10)
rd <-ج (3، 4، 6، 5، 88، 2، 9، 10، 900، 1)
يقرأ <--data.frame ('كروموسوم' = لجنة حقوق الإنسان،
'موقف' = نقاط البيع،
'read_depth' = rd)
# "ديسبيكي" أعماق القراءة:
يقرأ [، 'ديسبيكيد'] <--إيفيلسي (ما يلي]، 3] > (2.5 * median(reads[,3]))،
(2.5 * median(reads[,3]))،
reads[,3])
"الحد" أو "ديسبيكينج" يمكن أيضا أن يتحقق باستثناء ما يلي: يتم تعيينها إلى أكثر من موقع، ولكن هذا سيقضي على ما يلي: تعيين إلى، على سبيل المثال، موقعين فقط. مثيلات من يقرأ خريطة لموقع واحد أو أكثر، ولكن لا يزال يوفر معلومات قيمة، ليست غير شائعة عند العمل مع S. cerevisiae، الجينوم التي نتجت عن ازدواجية أجداد16.
(8) نحصل على نتائج قابلة للمقارنة مع الدالة "رولميديان" في حزمة آر "حديقة الحيوان" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) والدالة "رنمين" في حزمة آر "كاتولس" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) ونحن قد جربت طرق عديدة لتطبيع أعماق القراءة، التي أعطت نتائج مماثلة. نهجنا يفضل يستند إلى الافتراض بأن على الأقل بعض مناطق الجينوم يتم نسخها نسخاً متماثلاً تماما في عينة المرحلة S. نحن مصممون على عمق القراءة التي تمثل النسخ المتماثل الكامل كما تقرأ المتوسط العمق في لدينا مجموعة البيانات في المواقع المقابلة 12 أقرب إطلاق الثقة العالية (درجة "الثقة" > = 7) أصول في مجموعة البيانات متاحة للجمهور. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & الجدول = Raghu2001_ori & ext_format = & تنسيق = علامة التبويب). معظم التطبيقات، النهج المتبع للتطبيع ليست حاسمة وهناك العديد من الخيارات المعقولة، تطبيع الأكثر بساطة مجرد قراءة حساب الإجماليات. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في أرقام تسلسل المتكررة بين العينات، تطبيع ليصبح إجمالي عدد يمكن أن تكون مضللة. على سبيل المثال، عند مقارنة اثنين سلالات صفائف المتاشب التي تختلف بإضعاف عدة، تطبيع لمجموع قراءة التهم يمكن جعل بعض أرتيفاكتوالي تظهر مناطق جينوم السلالة مع الصفيف المتاشب أكبر لتكرار يتجاوز الضغط مع أصغر الصفيف.
وباختصار، يمثل G2 seq امتداداً منطقياً للتقنيات الحالية للتنميط النسخ المتماثل. مثل غيرها من التقنيات المستندة إلى التسلسل وميكرواري، G2 seq مزايا أكثر 2D جل تحليل الجينوم تغطية واسعة، وعدم وجود شرط لمعرفة مكان أصول النسخ المتماثل. هذه الأخيرة ذات أهمية خاصة في خلايا الثدييات فيها، على خلاف في مهدها الخميرة، أصول النسخ المتماثل لا تقتصر على تسلسل معين. من ناحية أخرى، توفر المواد الهلامية في 2D على مستوى القرار لوسيطة الجزيئية في تكرار الحمض النووي لا يمكن تحقيقه تماما بما يليها G2 توسيع G2 seq للكائنات الحية الأخرى يمكن فرز الخلايا التي وفقا لمحتوى الحمض النووي ينبغي أن يكون نسبيا على التوالي إلى الأمام، ومع ذلك، يجعل الطبيعة العالية المتكررة للجينوم من حقيقيات النوى أعلى محاذاة تسلسلات قراءة قصيرة تحديا أكبر بكثير. التسلسل التكنولوجيات التي توفر إلى حد كبير يعد الناشئة قراءة الطول قد يكون مفيداً في هذا الصدد، لا سيما منذ G2 seq ينبغي أن تكون قوية نسبيا إلى ارتفاع معدلات الخطأ التي يمكن أن ترتبط بأطول ما يلي:17. في تجربتنا، هو ترك المشكلة التقنية التي الأكثر احتمالاً أن يسبب مشاكل خلايا الجلوس بعد أن كانوا قد تم فرزها وقبل عزل الحمض النووي. تظهر هذه الخلايا لتكون هشة خاصة ومع مرور الوقت، والحمض النووي ينبغي أن تكون معزولة داخل على الأكثر ساعة أو ساعتين للفرز. اتجاهات المستقبل الواعد لهذه التقنية تشمل تقسيم إعداد متزايدة من الكسور للحصول على دقة أعلى من القوى المحركة للنسخ المتماثل للجينوم، من الشروع في وقت مبكر إلى التأخر في إنجاز المراحل S و G2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل بمنحه GM117446 المعاهد الوطنية للصحة أن أتال بيهاري
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
