Summary
אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.
Abstract
טכניקות רבות פותחו כדי לעקוב אחר ההתקדמות של שכפול ה-DNA באמצעות שלב S של מחזור התא. רוב שיטות אלה מכוונת כלפי הבהרה של המיקום והעיתוי של חניכה של שכפול גנום ולא להשלמתו. עם זאת, קריטי כי אנחנו מבינים אזורים בגנום כי הם אחרון להשלמת השכפול, כי אזורים אלה סובלים רמות גבוהות של כרומוזומלית, מוטציה, הם קושרו עם מחלה והזדקנות. כאן נתאר איך הרחבנו את טכניקה בה נעשה שימוש כדי לפקח על שכפול חניכה במקום לזהות אזורים אלה של הגנום אחרונה על שכפול מלאה. גישה זו מבוססת על שילוב של cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה. למרות הדו ח מתמקד היישום של טכניקה זו שמרים, הגישה ניתן להשתמש עם כל התאים ניתן למיין ב cytometer זרימה לפי תוכן ה-DNA.
Introduction
שכפול גנום האיקריוטים מאותחלת באתרים נפרדים מרובים, שנקרא מקורותיה של שכפול, בשכפול אילו מזלגות להמשיך בשני הכיוונים (שבתוך Fragkos. et al., 20151). המקורות נבדלים הן שלהם העיתוי ואת היעילות של ירי, מספר טכניקות פותחו כדי לעקוב אחר פעילות מקור שכפול, להבהיר את הסיבות של וריאציה זו. הפעילות של המקורות הבודדים שניתן להסיק מן רמות של דנ א חד גדילי2, המהווה סביב מקורות פעילים, או באמצעות דו-ממדית בג'ל כדי לפקח על שכפול ספציפי ביניים3, אשר שניהם להיות מזוהה עם הגששים רדיואקטיבי. שניהם של טכניקות אלה יוחלו ביתר קלות לפי cerevisiae ס מאשר בתאי יונקים, כי מקורות מוגבלים ספציפית ידועים רצפי לשעבר. עם כניסתו של מיקרו-מערכים, זה הפך אפשרי להעריך מקור ירי באופן גלובלי. זה נעשה לראשונה על ידי תיוג DNA עם איזוטופים כבדים, שחרור תאים בלוק G1 לתוך בינוני המכיל אור האיזוטופים, וניטור ואז היווצרות של כבד-אור היברידית DNA ברחבי הגנום4. המבוא של רצפי התפוקה גבוהה מותר הגנום כולו דומה ניטור של מקור פעילות ללא הדרישה של תיוג איזוטרופי יקר. התאים היו ממויין של cytometer הזרימה על פי תוכן ה-DNA ו- DNA שלהם נתון רצף עמוק. בגלל רצף כיסוי בהתאמה מ 1 x 2 x במהלך שלב S, תזמון שכפול יחסית יכול להיות מוערך על ידי השוואת בעומק קריאה של תאים בשלב S לאלה ב- G1 או G25,6. שיטות אלה, במיוחד שהוחל שמרים, הובילה הבנה עמוקה יותר של כיצד רצף הדנ א הכרומטין, חלבונים שכפול ה-DNA להסדיר מקור תזמון ויעילות.
הנאמן והעברת מידע גנטי במהלך ההפצה הסלולר מחייב חניכה לא רק מוצלח של שכפול ה-DNA, באישון מוצאו, אלא גם סיומו המוצלח של שכפול, אשר מתרחשת שבו נפגשים מזלגות שכפול. כמו חניכה של שכפול, העיתוי של השלמת השכפול משתנה לאורך הגנום עם אזורים מסוימים שנותרו unreplicated אפילו מאוחר במחזור התא. אזורים כאלה עשויים להיות רחוקים במיוחד ממוצא שכפול active או עשוי להכיל רצפים או מבנים כרומטין הפוגעים דנ א polymerases. מאוחר לבצע שיכפול אזורים עלולים להתבטא כמו אתרים שבירים, אשר משויכות כרומוזומלית וקצבי מוטציה גבוהה יותר, היו מעורבים בסרטן, הזדקנות-7,-8,-9. עם זאת, למרות החשיבות של השלמה נאותה של שכפול ה-DNA בתחזוקה של יציבות הגנום, ההבנה שלנו של איפה ואיך זה מתרחש יש פיגרה של שכפול חניכה. בעוד גנים בודדים שכפול מאוחר אשר שויכה המחלה נחקרו עם, למשל, qPCR10, מחקרים הכללית מכוונת שחקרתי את המיקומים, שבבסיס גורם של המנוח מחסירה שכפול. כאן נתאר טכניקה שאנו מתייחסים כאל "G2 seq" שבו אנו משלבים cytometry זרימה עם תפוקה גבוהה רצף לשפוך אור על השלמתו של שכפול גנום של שמרים11. עם שינויים קלים, ניתן להתאים פרוטוקול זה תאים שניתן זרימה ממוין על פי תוכן ה-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת התאים עבור Flow Cytometry מיון
- לחסן 15 מ"ל מבחנות המכילות 8 מ ל כל אחד YEPD מרק כזה התרבויות להגיע צפיפות של 5 x 106 כדי 1.5 x 107 תאים לכל mL לאחר צמיחה לילה (ראה דיון הערה 1).
- ספין למטה תאי שמרים (1,400 x g, בטמפרטורת החדר או 4 ° C) בשפופרת צנטרפוגה בורג מכסה 15 mL במשך 5 דקות, resuspend תאים 1.5 מ ל-70% אתנול, העברת צינור microfuge מ ל 1.6, נותן זה שב h 1 בטמפרטורת החדר או לפחות 3 h בקרח ( ניתן לאחסן עד אין סוף ב 4 ° C) (ראה דיון פוינט (2)).
- ספין למטה תאי שמרים microfuge (14,000 x g, 4 ° C) במשך 1 דקה, resuspend ב 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2, ספין למטה (g 14,000 x, 4 ° C) במשך 1 דקה, תשאף תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2 , המכילה 0.25 מ"ג/מ"ל פתרון RNAse h 1 ב 50 מעלות צלזיוס או ללון ב 37 מעלות צלזיוס באמבטיה בלוק או מים חום.
- הוספת µL 50 proteinase K פתרון (20 מ"ג/מ"ל resuspended ב- 10 מ מ טריס pH 7.5, מ מ 2 CaCl2, 50% משקל נפח גליצרול) ואת תקופת דגירה של h 1 ב 50 º C.
- ספין למטה תאים (14,000 x g, 4 ° C), resuspend תאים 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2, ספין למטה (14,000 x g, 4 ° C), תשאף תגובת שיקוע עם ואקום, resuspend ב 1 מ"ל 1 מיקרומטר חומצת גרעין ירוק זן resuspended ב-50 מ מ סודיום ציטרט , pH 7.2 ו דגירה בחושך לשעה בטמפרטורת החדר, sonicate 2 x עבור 2 s כל (פלט כוח 2 וואט).
2. התא מיון
- שימוש של סדרן התא, למיין תאים על פי תוכן ה-DNA לשלבים G1 ', ' S ', "G2 מוקדם", ו "G2 מאוחר", איסוף תאים הפלואידי לפחות 1.6 מיליון כל שלב מחזור התא כמו באיור 1 (ראה הדיון בנקודה (3)).
- להעביר תאים microfuge צינורות ו ספין למטה תאים עבור 20 דקות ב g 14,000 x-4 מעלות צלזיוס ב microfuge האחות תגובת שיקוע עם ואקום (בגדר ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C ללא הגבלת זמן; ראה דיון הצבע (4)).
3. דנ א החילוץ, הכנת רצף ספריות
הערה: השלבים הבאים מבוססים על "פרוטוקול אני" בהפקת דנ א גנומי שמרים קיט (ראה טבלה של חומרים).
- הוסף µL 120 "מאגר עיכול," מאגר קנייני המאפשרת שמרים אנזים lytic לעכל את דופן התא, µL 5 של האנזים lytic שמרים, resuspend על ידי vortexing של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40-60 דקות.
- הוסף µL 120 "מאגר פירוק," מאגר קניינית המכיל חומרי ניקוי, ואת מערבולת קשה עבור s 10-20.
- הוסף כלורופורם µL 250 - לערבב היטב עבור 1 דקות.
- ספין במהירות מקסימלית microfuge למשך 2 דקות.
- לטעון את תגובת שיקוע עמודה איגוד ה-DNA ועל צנטריפוגה במהירות מקסימלית microfuge עבור 1 דקות.
- להוסיף 300 µL "ה-DNA שטיפה מאגר," מאגר קניינית המכיל אתנול, צנטריפוגה עבור 1 דקות במהירות מקסימלית microfuge. למחוק את הזרימה, להוסיף 300 µL מאגר ה-DNA לשטוף, לחזור על התהליך לשטוף.
- להעביר את העמודה ספין צינור microfuge טריים, להוסיף 60 µL של מים (לא טה) - לחכות 1-3 דקות, ואז צנטריפוגה 10 s כדי elute את ה-DNA.
- למדוד ריכוז על ידי הוספת 5 µL של ה-DNA µL 195 של ריאגנט רגישות גבוהה dsDNA, כי כבר 1:200 מדולל במאגר רגישות גבוהה dsDNA ולאחר מכן פלורסצנטיות מדידה ב fluorometer, באמצעות µL 10 התקנים שסופקו לכיול; מצפה בין 10 עד 50 ng של התשואה הכוללת הדנ א.
- Sonicate (שיא האירוע כוח 450, פקטור חובה 30%, מחזורים לכל פרץ 200, טיפול זמן 60 s, מפלס המים 6) כדי לשבור את ה-DNA לחלקים bp 250-350.
- להכין ספריה באמצעות ערכת הכנה דגימת דנ א, רצף זה (לפחות 10 מיליון 50 bp יחיד-end reads) על הכלי רצפי DNA במצב מהיר (ראה הערה לדיון (5)).
4. ניתוח של רצף נתונים והפקת שכפול פרופילים
- ליישר רצפי הגנום sacCer3 האפייה באמצעות Gsnap12 (ראה הערה לדיון (6)).
- לקבוע לכל בסיס זוג לקרוא לעומק באמצעות תוכנת Bedtools' "genomeCoverageBed"13.
- להסיר קוצים artefactual בעומקים קרא, אם מתנה (ראה הערה לדיון (7)).
- חלקה לקרוא לעומק על ידי כרומוזום באמצעות medians 20 kb הזזה חלון באמצעות הפונקציה "runMean" ב- R חבילת "caTools" (ראה הערה לדיון (8)).
- מגרש לקרוא לעומק שלב S, G2 מוקדם ו G2 מאוחר כאחוז משוכפל לגמרי במעמקי קריאה (ראה הערה לדיון (9)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו ההליך המתואר לעיל כדי לזהות אתרים שכפול מאוחר ניצני שמרים. בדיקות גישה זו באמצעות אזור שכפול מאוחר ידוע על כרומוזום מלאכותי הוכיח את הטכניקה להיות מדויקות ואמינות. התוצאות שלנו הוכיחו את חשיבות במועד השלמת השכפול הביולוגית על-ידי הצגת מאוחר שכפול אזור בכרומוזום 7, אשר זיהינו כמו שכפול מאוחרת על בסיס התוצאות G2-seq שלנו, אבד יבול בתדירות גבוהה יותר מאשר דומות לשלוט באזור11.
דוגמה ספציפית את התוצאות G2-seq מוצג באיור2. ההשערה שלנו הייתה כי שם אזורים בגנום זה שוכפל במיוחד מאוחר בתאים בחסר של deacetylase חלבון הנקרא Sir2. איור 2A מראה את ההתקדמות של ניתוח נתונים עבור סוג בר (כחול) ו- sir2 (אדום). הנתונים הגולמיים (שורות העליון) מכילים קוצים גדולים, שרובם אינם עקב הנוכחות של טיי אלמנטים. דוקרנים אלו יוסרו על ידי מיצוי לקרוא לעומק על 2.5 x החציון לקרוא עומק עבור כל דגימה (שורות האמצעי). הנתונים despiked הם מכן החליק עם חלון הזזה 20 kb (השורה התחתונה). לבסוף, נתונים מנורמל, התווה יחסי את רמות ב- G1. אזור טיפוסי מאוחר-שכפול המופיע המוטציה sir2 יסומן ב- 2C איור.
איור 1. Flow cytometry פרופיל המציינת את מחזור התא שברים להשתמש; הגבולות החיצוניים של כל השערים מסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2- (A-B) ההתקדמות של עיבוד נתונים של נתונים גולמיים (השורות), despiked נתונים (שורות האמצעי) והרגעתי את הנתונים (שורות למטה) עבור פראי סוג (A) ו- sir2 (B). (ג) יחסי של S שלב, G2 מוקדם-G2 מאוחר-G1 קרא לעומק. סוג הפרוע sir2 באדום ובכחול. האזור המסומן בפינה הימנית העליונה מציגה אזור שכפול מאוחר ספציפיים כדי sir2 מוטציה. קנה המידה מציין שבר של שכפול מלאה (2N); תא unreplicated לחלוטין יופיע ב 0.5, תא לחלוטין משוכפל ב- 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקה זו היא חזקה, יחסית ישר קדימה, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות מוקדש הבאות:
(1) אנו ממליצים כי תרבויות לגדול במשך לפחות 12 שעות לפני שהם מגיעים שלב יומן, שכן ההבדלים באה לידי ביטוי מחזור התא הפצות אם תרבויות נקצרים לאחר שהגיעו ה הרצוי צפיפות 4 רק לאחר חיסון. ההנחה שלנו היא כי התפלגות מחזור התא זה הגיע שיווי משקל יציב יחסית מייצג טוב יותר התפלגות שלב יומן "אמיתי" יותר התפלגות זה עדיין בתוך השטף כאשר תרבות רווי הועבר לאחרונה כדי בינוני טרי.
(2) במקום של ספינינג למטה התאים לפני תיקון, התאים ניתן לתקן גם בהוספת ישירות 100% אתנול לתרבות שמרים, כך הריכוז הסופי של אתנול הוא 70%. ניתן לגדל תאים או סינתטי או עשיר בינוני (YEPD).
(3) מחזור התא שלבים הם דמיינו למיון לפי מספר התא ההתוויה כפונקציה של 530 ננומטר פליטה באזור. מצאנו כי הנקודות פיתול בין G1 ל- S, בין S ל G2 לשמש אתרים חזקים עבור בהתוויית שלב S, נשתמש המרבי G2 כגבול להפרדת G2 מוקדם ומאוחר. אנו משתמשים המונחים "G2 מוקדם" "מאוחר G2" עבור בהירות ותמצות, אולי על חשבון דיוק במובן זה התאים נמצאים טכנית בשלב S עד שהשלימו שכפול ה-DNA. אמנם המטרה של G2-seq לזהות אתרים מאוד מאוחר-שכפול, אשר צפויים להיחשף ב השבר G2 מאוחר, אנו אוספים שלב S ותאים G2 מוקדם לבצע שכפול במהלך כל שלבי של מחזור התא.
(4) חשוב באופן קריטי כי התאים להיות טוו למטה מיד לאחר המיון. אל תתנו תאים לשבת בין לילה לפני ספינינג אותם למטה. . היו לנו בעיות מתאושש תאים על ידי צנטריפוגה אם הם אוחסנו ב 4 ° C, רומז כי הם הופכים שברירי על המיון ואת lyse עם הזמן.
(5) כמו כמה קריאות 5 מיליון מספיקה, אך מתווה הופכים פחות חלקים עם מספרים נמוכים הקריאות. ערכות נתונים עם קריאות אפילו פחות יוכל להיות מוכלים החלקה עם חלונות גדולים יותר מ- 20 kb, אבל לא ניסינו את זה.
(6) כל תוכנה יישור נפוץ (למשל, עניבת הפרפר14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15או Gsnap12) יפעל.
(7) תפוקה גבוהה רצף נתונים שמרים הצג קוצים ומדי פעם לקרוא לעומק, המשקפות לעיתים קרובות אלמנטים טיי. נוכל לחסל את אלו על ידי החלפת 2.5 x התווך לדוגמה לקרוא לעומק על המעמקים קראו מחוץ לאזורים ידוע מכילות מתיחות חוזרות (למשל, את rDNA) מהערך חציון x 2.5. את rDNA, בקצות הכרומוזומים אינם נכללים כי ידוע שהם מכילים רכיבים חוזרים. דוגמה זו "despiking" באמצעות השפה R היא הבאות:
# ליצור מסגרת נתונים שנקרא "קריאות" המכיל נתונים:
chr <-נציג ('אלוהים', 10)
pos <-seq (1, 10)
rd <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
קורא <-data.frame ('כרומוזום' = chr.
'מיקום' = pos.
'read_depth' = rd)
# "despike" המעמקים קראו:
קריאות [, 'despiked'] <-ifelse (קריאות [, 3] > (2.5 * median(reads[,3])),
(2.5 * median(reads[,3])),
reads[,3])
"מיצוי" או "despiking" יכולה גם להיות מושגת על ידי לא כולל קריאות הממפות יותר ממיקום אחד, אך הדבר יבטל את קורא את המפה, לדוגמה, רק בשני מקומות. מופעים של קורא את המפה למיקום אחד או יותר, אבל עדיין מספקים מידע רב ערך, אינן נדירות בעת עבודה עם cerevisiae ס, הגנום שלו נבעה מטוס שכפול אב קדמון16.
(8) יש השגנו תוצאות דומות עם הפונקציה "rollmedian" בחבילת ה-R "גן החיות" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) וגם את הפונקציה "runmean" בחבילת ה-R "caTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) אנחנו ניסויים בשיטות רבות לנרמל את המעמקים קראו, אשר נתן תוצאות דומות. הגישה המועדף שלנו מבוססת על ההנחה כי לפחות חלק אזורים בגנום מלאה ישוכפלו ב הדגימה שלב S. קבענו את עומק קריאה שייצג שכפול מלא כפי החציון לקרוא לעומק את ערכת הנתונים שלנו באתרים המתאימים ה-12 המוקדם ירי ביטחון מלא ("אמון" ציון > = 7) מקורו בערכת נתונים זמין לציבור. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & טבלת = Raghu2001_ori & ext_format = & לעצב = tab). עבור מרבית היישומים, הגישה של הנורמליזציה אינה קריטית, ויש הרבה אפשרויות סבירות, נרמול הכי פשוט לקרוא את סיכומי הספירה. עם זאת, ראוי לציין כי אם ישנם הבדלים גדולים את המספרים של רצפים חוזרים בין דגימות, נורמליזציה לקרוא סכומים. count יכול להיות מטעה. לדוגמה, בעת השוואת שני זנים של מי מערכים rDNA נבדלים קיפול מספר, נרמול הכולל לקרוא ספירות יכול לוודא אזורים בגנום של המתח עם המערך rDNA גדול יותר artefactually מופיעים כדי לשכפל מאוחר יותר המתח עם הקטנה מערך.
לסיכום, G2-seq מייצג סיומת לוגי מהטכניקות הקיימות עבור שכפול פרופיל. כמו טכניקות רצף microarray מבוססות אחרות, G2-seq יש יתרונות על פני 2D ג'ל ניתוח של הגנום כיסוי רחב, היעדר דרישה של ידע של המיקום של מקור השכפול. האחרון רלוונטי במיוחד בתאים בתרבית של שבו, בניגוד בניצני שמרים, שכפול המקורות אינם מוגבלים רצפים ספציפיים. מצד שני, ג'לים 2D לספק רמה של הרזולוציה של intermediates מולקולרית של ההכפלה לחלוטין בלתי ניתן להשגה על ידי G2-תת סעיף Extending G2-seq לאורגניזמים אחרים אשר התאים ניתן למיין על פי תוכן דנ א צריך להיות יחסית ישר קדימה, עם זאת, הטבע מאוד חוזרות של הגנום של פרוקריוטים גבוה עושה יישור רצפים קריאה קצרה הרבה יותר מאתגר. מתעוררים טכנולוגיות רצף המספקים באופן משמעותי יותר לקרוא אורך עשוי להיות מועיל בהקשר זה, במיוחד מאז G2-seq צריכים להיות חזקים יחסית כדי שיעור שגיאה גבוה יותר זה יכול להיות קשור עם קריאות עוד17. מניסיוננו, הבעיה הטכנית אשר ככל הנראה לגרום לבעיות נותן תאים לשבת אחרי הם מוינו ולפני בידוד של דנ א. תאים אלה מופיעות להיות שביר במיוחד וכדי lyse עם הזמן, דנ א צריך להיות מבודד בתוך מקסימום שעה או שעתיים של מיון. כיוונים לעתיד מבטיח עבור טכניקה זו כוללות חלוקת שלבי S ו- G2 מספר גדל והולך של שברים להשיג רזולוציה גבוהה יותר של הדינמיקה של שכפול גנום, של חניכה מוקדם לסיום מאוחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM117446 א.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al.
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W.
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
