Summary
Descriviamo una tecnica per combinare la citometria a flusso e sequenziamento ad alta per identificare regioni tarda replicazione del genoma.
Abstract
Numerose tecniche sono state sviluppate per seguire l'avanzamento della replica del DNA attraverso la fase S del ciclo cellulare. La maggior parte di queste tecniche sono state dirette verso delucidazione della posizione e la tempistica di apertura di duplicazione del genoma piuttosto che il suo completamento. Tuttavia, è fondamentale che capiamo regioni del genoma che sono ultima per completare la replica, perché queste regioni soffrono i livelli elevati di rottura cromosomica e mutazione, e sono stati associati con la malattia e invecchiamento. Qui descriviamo come siamo ad una tecnica che è stata utilizzata per monitorare l'inizio di replica per invece identificare quelle regioni del genoma Ultima replica completa. Questo approccio si basa su una combinazione di citometria a flusso e sequenziamento ad alta. Anche se la relazione si concentra sull'applicazione di questa tecnica di lievito, l'approccio può essere utilizzato con tutte le celle che possono essere ordinate in un citometro a flusso in base al contenuto di DNA.
Introduction
In più siti discreti, chiamati origini di replicazione, da cui la replica forcelle procedere in entrambe le direzioni (rivisto in Fragkos et al., 20151) viene avviata la replica del genoma eucariotico. Origini variano nella loro tempistica e l'efficienza di cottura, e sono state sviluppate diverse tecniche per monitorare l'attività di origine di replica e delucidare le cause di questa variazione. L'attività delle singole origini può essere dedotto dai livelli di single-stranded DNA2, che si forma intorno origini attivi, o utilizzando 2D elettroforesi del gel per monitorare specifiche replica intermedi3, entrambi i quali possono essere rilevati con sonde radioattive. Entrambe queste tecniche sono più facilmente applicate in S. cerevisiae rispetto in cellule di mammifero, perché origini sono limitati a specifiche sequenze conosciute nel precedente. Con l'avvento dei microarray, è diventato possibile valutare origine sparando a livello globale. Questo è stato fatto prima di etichettatura del DNA con gli isotopi pesanti, rilasciando le cellule da un blocco di G1 in medi contenenti isotopi leggeri e monitoraggio quindi la formazione di pesante-leggero ibrido DNA attraverso il genoma4. L'introduzione di sequenziamento ad alta permesso simili genoma monitoraggio dell'attività di origine senza l'obbligo di etichettatura isotopica costosi. Le cellule sono state ordinate in un citometro a flusso in base al contenuto di DNA e il loro DNA sottoposti a sequenziamento profondo. Perché copertura sequenza procede da 1x a 2x nel corso della fase S, tempo di replicazione relativa può essere valutata confrontando la lettura profondità delle cellule in fase S a quelli in G1 o G25,6. Queste tecniche, in particolare applicate ai lieviti, ha portato ad una più profonda comprensione di come sequenza di DNA, struttura della cromatina e DNA replica proteine regolano la efficienza e la tempistica di origine.
L'inizio non solo successo della replicazione del DNA, che si svolge alle origini, ma anche il completamento della replica, che si verifica dove si incontrano le forcelle replica richiede fedele trasmissione dell'informazione genetica durante la proliferazione cellulare. Come l'inizio della replica, i tempi di completamento della replica variano in tutto il genoma con alcune regioni restanti non replicate anche tardi nel ciclo cellulare. Tali regioni possono essere particolarmente distante dalle origini di replicazione attiva o possono contenere sequenze o strutture di cromatina che ostacolano la polimerasi del DNA. Replica ritardata regioni possa manifestarsi come siti fragili, che sono associate con rottura cromosomica e più elevati tassi di mutazione e sono stati implicati nel cancro e invecchiamento7,8,9. Tuttavia, nonostante l'importanza del corretto completamento della replica del DNA nel mantenimento della stabilità del genoma, la nostra comprensione di come e dove questo avviene è rimasta lontano dietro quella dell'iniziazione di replica. E mentre singoli geni cui replica tarda è stata associata con la malattia sono stati studiati con, ad esempio, qPCR10globali studi rivolti a chiarire le posizioni e cause di ritardo replica sono mancati. Qui descriviamo una tecnica che ci si riferisce a come "G2 seq" in cui uniamo la citometria a flusso con sequenziamento ad alta per far luce sul completamento della replicazione del genoma in lievito11. Con modifiche minori, il presente protocollo può essere adattato a tutte le celle che possono essere ordinato flusso in base al contenuto di DNA.
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Protocol
1. preparazione delle cellule per flusso Cytometry ordinamento
- Inoculare provette da 15 mL contenente 8 mL di brodo YEPD tale che le culture raggiungono una densità di 5 x 106 a 1,5 x 107 cellule per mL dopo crescita durante la notte (vedi discussione Nota 1).
- Rotazione verso il basso le cellule di lievito (1.400 x g, a temperatura ambiente o a 4 ° C) in una provetta da centrifuga da 15 mL tappo a vite per 5 min, risospendere le cellule in 1,5 mL di etanolo al 70% e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,6 mL, lasciando questo sedersi per 1 h a temperatura ambiente o almeno 3 h sul ghiaccio ( possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ° C) (Vedi punto di discussione (2)).
- Rotazione verso il basso le cellule di lievito in microfuge (14.000 x g, 4 ° C) per 1 min, risospendere in 1 mL 50 millimetri citrato di sodio, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C) per 1 min, aspirare il surnatante e risospendere in 1 mL 50 millimetri citrato di sodio, pH 7,2 , contenente 0,25 mg/mL soluzione di RNAsi per 1 h a 50 ° C o una notte a 37 ° C in bagno di acqua o blocco di calore.
- Aggiungere 50 µ l di soluzione di proteinasi K (20 mg/mL risospesi in 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 2mm CaCl2, 50% in peso di glicerolo di volume) e incubare per 1 h a 50 ° C.
- Rotazione verso il basso delle cellule (14.000 x g, 4 ° C), risospendere le cellule in 1 mL 50 millimetri di citrato di sodio, pH 7,2, rotazione verso il basso (14.000 x g, 4 ° C), aspirare il surnatante con vuoto, risospendere in 1 mL 1 µM verde acido nucleico ceppo risospeso in citrato di sodio 50 mM , pH 7.2 ed incubare al buio per 1 h a temperatura ambiente, Sonicare x 2 per 2 s ciascuno (2 watt di potenza di uscita).
2. cella ordinamento
- Usando un Classificatore celle, ordinare le celle in base al contenuto di DNA in fasi G1, S, "primi G2" e "fine G2", raccolta di cellule aploidi almeno 1,6 milioni da ogni fase del ciclo cellulare come in Figura 1 (Vedi punto di discussione (3)).
- Trasferire le cellule microfuge provette e spin giù cellule per 20 min a 14.000 x g a 4 ° C nel microfuge e aspirare il surnatante con vuoto (il pellet può essere conservato congelati a-20 ° C a tempo indeterminato; veda discussione punto (4)).
3. DNA estrazione e preparazione di sequenziamento librerie
Nota: La procedura seguente si basata su "protocollo I" nell'estrazione del DNA genomico di lievito Kit (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 120 µ l di "Buffer di digestione," un buffer proprietario che consente degli enzimi litici di lievito a digerire la parete cellulare e 5 µ l di enzima litico lievito, risospendere nel vortex e incubare a 37 ° C per 40-60 min.
- Aggiungere 120 µ l di tampone di Lisi"," un buffer proprietario che contiene detergente e vortice dura per 10-20 s.
- Aggiungi 250 cloroformio µ l - Mescolare accuratamente per 1 min.
- Girare alla massima velocità in un microfuge per 2 min.
- Caricare il surnatante nella colonna associazione DNA e centrifugare in un microfuge alla massima velocità per 1 min.
- Aggiungere 300 µ l di "DNA lavaggio Buffer," un buffer proprietario che contiene etanolo e centrifugare per 1 min in un microfuge alla massima velocità. Scartare il flusso attraverso, aggiungere 300 µ l di tampone di lavaggio di DNA e ripetere il processo di lavaggio.
- Trasferire la colonna di spin in una provetta di microfuge fresco, aggiungere 60 µ l di acqua (non TE) - attendere 1-3 min e poi Centrifugare per 10 s per eluire il DNA.
- Misurare la concentrazione aggiungendo 5 µ l di DNA a 195 µ l di reagente di dsDNA ad alta sensibilità che è stato diluito 1: 200 in buffer di dsDNA ad alta sensibilità e quindi misura fluorescenza in un fluorimetro, utilizzando 10 µ l di dotazione standard per la calibrazione; si aspettano tra 10 e 50 ng di rendimento totale del DNA.
- Sottoporre ad ultrasuoni (picco incidente potenza 450, fattore di utilizzo del 30%, cicli al Burst 200, trattamento tempo 60 s, livello acqua 6) per spezzare il DNA in frammenti di 250-350 bp.
- Preparare una libreria utilizzando il kit di preparazione del campione del DNA e la sequenza è (almeno 10 milioni di 50 bp singolo fine letture) dello strumento di sequenziamento del DNA in modalità rapida (vedi discussione nota (5)).
4. analisi di sequenziamento dati e generazione di replica profili
- Allineare sequenze di genoma di Saccharomyces cerevisiae sacCer3 utilizzando Gsnap12 (Vedi nota di discussione (6)).
- Determinare a base pair leggi di profondità utilizzando "genomeCoverageBed" software13 degli Bedtools.
- Se presente, rimuovere punte artefactual nelle profondità di lettura, (vedi discussione nota (7)).
- Liscio leggere profondità dal cromosoma utilizzando mediane in un 20kb scorrevoli finestra utilizzando la funzione "runMean" in R pacchetto "caTools" (vedi discussione nota (8)).
- Trama leggere profondità in fase S, G2 presto e tardi G2 come percentuale della profondità di lettura completamente replicata (Vedi nota di discussione (9)).
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Representative Results
Abbiamo utilizzato la procedura descritta sopra per identificare siti tardi replicanti in lievito. Questo approccio utilizzando una regione conosciuta di replicante tardiva su un cromosoma artificiale di test hanno dimostrato che la tecnica per essere precisi e affidabili. I nostri risultati hanno dimostrato anche l'importanza biologica di tempestivo completamento della replica mostrando che una tardiva replicante regione sul cromosoma 7, che abbiamo identificato come fine la replica in base ai nostri risultati di G2-seq, è stato persa circa tre volte più frequentemente di un simile controllo regione11.
Un esempio specifico di risultati con G2-seq è illustrato nella Figura 2. Noi avevamo supposto che ci regioni del genoma che replicato particolarmente tardi in cellule mancherebbe una proteina deacetilasi chiamata Sir2. La Figura 2A Mostra la progressione dell'analisi dei dati per wild type (blu) e sir2 (rosso). I dati grezzi (file superiori) contengono picchi di grandi dimensioni, la maggior parte dei quali sono dovuta alla presenza di elementi di Ty. Questi picchi sono stati rimossi da tappatura profondità lettura a 2,5 x la mediana leggere profondità per ogni campione (middle righe). I dati despiked sono poi lisciati con una finestra scorrevole di 20 kb (riga inferiore). Infine, i dati sono normalizzati e tracciati come rapporti ai livelli in G1. Una regione tipica tardo-replicante che appare nel mutante sir2 è evidenziata in Figura 2.
Figura 1. Flusso cytometry profilo indicando le frazioni di ciclo cellulare utilizzate; i limiti di tutti i cancelli contrassegnato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. (A-B) Progressione del trattamento dei dati da dati grezzi (prime righe), despiked dati (righe centrali) e lisciato dati (righe inferiore) per wild type (A) e sir2 (B). (C) rapporti di S fase-, primi G2 e G2 tardo-G1 leggere profondità. Wild type in sir2 in rosso e blu. L'area evidenziata in alto a destra è illustrata un'area replicante fine specifico di sir2 mutante. Scala indica la frazione di replica completa (2N); una cellula completamente non replicata apparirebbe a 0.5, una cellula completamente replicata a 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mentre questa tecnica è robusta e relativamente dritto in avanti, particolare attenzione deve essere rivolta al seguente:
(1) si consiglia che culture crescono per almeno 12 ore prima che raggiungano la fase di log, poiché le differenze si manifestano nel ciclo cellulare distribuzioni se culture vengono vendemmiate, dopo aver raggiunto la densità desiderata solo 4 h dopo l'inoculazione. La nostra ipotesi sono che una distribuzione del ciclo cellulare che ha raggiunto un equilibrio relativamente stabile rappresenta meglio una distribuzione di fase di log "reale" di una distribuzione che è ancora in evoluzione, quando una cultura satura è stata trasferita più di recente a mezzo fresco.
(2) invece di rotazione verso il basso le cellule prima del fissaggio, cellule possono essere anche risolto aggiungendo direttamente etanolo al 100% alla cultura lievito in modo che la concentrazione finale di etanolo è 70%. Le cellule possono essere coltivate nel mezzo o sintetico o ricco (YEPD).
(3) fasi del ciclo cellulare da sono visualizzati per l'ordinamento dal tracciato numero di cellule in funzione della zona di emissione 530 nm. Abbiamo trovato che i punti di flesso tra G1 e S e tra S e G2 servono come punti di riferimento affidabili per la delineazione di fase S, e usiamo il massimo G2 come limite per separare G2 precoce e tardiva. Usiamo i termini "primi G2" e "fine G2" chiarezza e brevità, forse a scapito della precisione nel senso che le cellule sono tecnicamente in fase S fino a quando non hanno completato la replica del DNA. Anche se l'obiettivo di G2-seq è per identificare i siti molto tardi-replicante, che dovrebbero essere rivelata nella frazione fine G2, raccogliamo fase S e cellule in G2 anticipo a seguire la replica attraverso tutte le fasi del ciclo cellulare.
(4) è estremamente importante che le cellule essere filato giù prontamente dopo l'ordinamento. Le cellule non lasciate riposare una notte prima di filatura li giù. Abbiamo avuto problemi recupero cellule mediante centrifugazione, se essi sono stati conservati a 4 ° C, suggerendo che diventano fragili su ordinamento e lyse con tempo.
(5) come pochi come letture 5 milioni è sufficiente, ma trame diventano meno liscia con i numeri più bassi di letture. Insiemi di dati con letture ancor meno può essere in grado di essere ospitati lisciando con windows superiori a 20 kb, ma non abbiamo provato questo.
(6) qualsiasi software di allineamento ampiamente utilizzato (ad es., Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15o Gsnap12) funzionerà.
(7) dati di sequenziamento ad alta velocità di trasmissione da lievito mostrano picchi occasionali nelle profondità di lettura, che spesso riflettono elementi Ty. Eliminiamo questi sostituendo 2.5 x mediano campione leggere profondità per profondità di lettura fuori regioni conosciute per contenere tratti ripetitivi (ad esempio, il rDNA) che sono superiori ai 2,5 mediana di x. Il rDNA e l'estremità dei cromosomi è esclusi perché sono conosciuti per contenere elementi ripetitivi. Un esempio di questo "despiking" utilizzando il linguaggio di R è il seguente:
# Crea un frame di dati chiamato "letture" contenente i dati:
Chr <-rep ('chrI', 10)
POS <-seq (1, 10)
Rd <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
legge <-data.frame ("cromosoma" = chr,
'position' = pos,
'read_depth' = rd)
# "despike" la profondità di lettura:
letture [, 'despiked'] <-ifelse (letture [, 3] > (2,5 * median(reads[,3])),
(2,5 * median(reads[,3])),
Reads[,3])
"Capping" o "despiking" può essere ottenuta anche da escludendo letture che eseguono il mapping a più posizioni, ma questo eliminerà letture che eseguono il mapping a, per esempio, solo due posizioni. Istanze di letture che associano al più di una posizione, ma ancora forniscono informazioni preziose, non sono rare quando si lavora con S. cerevisiae, cui genoma è derivato da un ancestrale duplicazione16.
(8) abbiamo ottenuto risultati comparabili con la funzione di "rollmedian" nel pacchetto R "zoo" (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) e la funzione di "runmean" nel pacchetto R "caTools" (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) abbiamo sperimentato con numerosi metodi per normalizzare la profondità di lettura, che ha dato risultati comparabili. Il nostro approccio preferito si basa sul presupposto che, almeno in alcune regioni del genoma sono completamente replicate nel nostro campione di fase S. Abbiamo determinato la profondità di lettura che rappresentato la replica completa come la mediana letto profondità nel nostro insieme di dati presso siti corrispondenti ai 12 primi sparando alta fiducia (Punteggio di "confidenza" > = 7) origini in un set di dati pubblicamente disponibile. (tavolo & http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies = Raghu2001_ori & ext_format = & formato = scheda). Per la maggior parte delle applicazioni, l'approccio adottato per la normalizzazione non è critico e ci sono molte opzioni ragionevoli, più semplicemente normalizzante per leggere totali totali. Tuttavia, vale la pena notare che, se ci sono grandi differenze nei numeri di sequenze ripetute tra i campioni, normalizzazione di leggere totali totali può essere fuorviante. Ad esempio, quando si confrontano due ceppi cui matrici di rDNA differiscono da parecchie volte, normalizzante per totale leggere conteggi può fare determinate regioni del genoma del ceppo con la più ampia gamma di rDNA artefactually sembrano replicare entro il ceppo con il più piccolo matrice.
In sintesi, G2-seq rappresenta un'estensione logica delle tecniche esistenti per la profilatura di replica. Come altre tecniche di sequenziamento e basati su microarray, G2-seq ha vantaggi rispetto 2D gel analisi di un'ampia copertura del genoma e la mancanza del requisito di conoscenza della posizione delle origini di replicazione. Quest'ultimo è particolarmente rilevante in cellule di mammiferi dove, a differenza di in lievito, origini di replicazione non sono limitati a specifiche sequenze. D'altra parte, gel 2D forniscono un livello di risoluzione di mediatori molecolari nella replicazione del DNA completamente irraggiungibile da G2-segg. allungabile G2-seq ad altri organismi le cui cellule possono essere ordinate in base al contenuto di DNA dovrebbe essere relativamente semplice, Tuttavia, la natura altamente ripetitiva dei genomi di eucarioti superiori rende l'allineamento delle sequenze di lettura breve molto più impegnativo. Nuove tecnologie di sequenziamento che forniscono significativamente più leggere lunghezza può risultare utile a questo proposito, soprattutto perché G2-seq dovrebbe essere relativamente robusto per i più alti tassi di errore che possono essere associati più letture17. Nella nostra esperienza, il problema tecnico che è più probabile che causare problemi è lasciare cellule sedersi dopo che essi sono stati ordinati e prima di isolamento del DNA. Queste cellule sembrano essere particolarmente fragili ed lisare con il tempo, e DNA dovrebbe essere isolato entro al massimo un'ora o due di ordinamento. Promettenti direzioni future per questa tecnica includono dividendo fasi sia S e G2 in un numero crescente di frazioni per ottenere una risoluzione più elevata la dinamica di replicazione del genoma, da inizio precoce al fine completamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da grant GM117446 NIH di A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
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