Summary
Vi beskriver en teknik för att kombinera flödescytometri och hög genomströmning sekvensering att identifiera sena replikerande regioner i genomet.
Abstract
Många tekniker har utvecklats för att följa utvecklingen av DNA-replikation genom den S fasen i cellcykeln. De flesta av dessa tekniker har varit riktad mot förtydligandet av platsen och tidpunkten för inledandet av genomet dubbelarbete i stället för dess slutförande. Det är dock viktigt att vi förstår regioner i genomet som är sist att slutföra replikeringen, eftersom dessa regioner drabbas av förhöjda nivåer av kromosomala brott och mutation, och de har förknippats med både sjukdom och åldrande. Här beskriver vi hur vi har förlängt en teknik som har använts för att övervaka replikering initiering för att istället identifiera de regionerna i genomet senast för fullständig replikering. Denna strategi är baserad på en kombination av flödescytometri och hög genomströmning sekvensering. Även om detta betänkande fokuserar på tillämpningen av denna teknik på jäst, kan metoden användas med celler som kan sorteras i en flödescytometer enligt DNA-innehåll.
Introduction
Eukaryota genomet replikering initieras på flera diskreta platser, kallas beskärningarna av replikering, från vilka replikering gafflar fortsätter i båda riktningarna (ses i Fragkos et al., 2015-1). Ursprung varierar i både deras timing och effektivitet av bränning, och flera tekniker har utvecklats för att övervaka replikering ursprung aktivitet och klarlägga orsakerna till denna variation. Aktiviteten av enskilda ursprung kan härledas från nivåer av enkelsträngat DNA2, som utgör runt aktiva ursprung, eller genom att använda 2D gelelektrofores för att övervaka specifika replikering intermediärer3, vilka båda kan upptäckas med radioaktiva sonder. Båda dessa tekniker tillämpas lättare i S. cerevisiae än i däggdjursceller, eftersom ursprung är begränsade till specifika kända sekvenser i fd. Med tillkomsten av microarrays blev det möjligt att bedöma ursprung bränning globalt. Detta gjordes först av märkning DNA med tunga isotoper, släppa celler från en G1-blocket i medium innehållande lätta isotoper och sedan övervaka bildandet av tunga-lätta hybrid DNA över genomet4. Införandet av hög genomströmning sekvensering tillät liknande genome-wide kontroll av ursprung aktivitet utan krav på dyra isotopiska märkning. Cellerna var sorterade i en flödescytometer enligt DNA-innehåll och deras DNA som utsätts för djupsekvensering. Eftersom sekvensen täckning intäkter från 1 x till 2 x under loppet av S fas, kan relativa replikering timing bedömas genom att jämföra Läs djupet av celler i S-fas till dem i G1 eller G25,6. Dessa tekniker, särskilt tillämpas på jäst, ledde till en djupare förståelse för hur DNA-sekvens, kromatinstruktur och DNA-replikering proteiner reglerar ursprung timing och effektivitet.
Trogen överföring av genetisk information under cellulär proliferation kräver inte bara framgångsrika inledandet av DNA-replikation, som äger rum på ursprung, men också framgångsrikt slutförande av replikering, vilket inträffar där replikering gafflar möts. Som inledande replikering varierar tidpunkten för slutförande av replikering i genomet med vissa regioner återstående unreplicated även sent i cellcykeln. Sådana områden kan vara särskilt långt från aktiv replikering ursprung eller kan innehålla sekvenser eller kromatin strukturer som hämmar DNA-polymerases. Sent replikera regioner kan manifestera sig som sårbara platser, som är associerade med kromosomala brott och högre mutation priser, och har varit inblandade i cancer och åldrande7,8,9. Men trots vikten av korrekt slutförande av DNA-replikation i underhåll av genomet stabilitet, har vår förståelse av var och hur detta sker halkat långt efter replikering insättande. Och medan enskilda gener vars slutet replikering har associerats med sjukdomen har studerats med, till exempel qPCR10, globala studier inriktas på att klarlägga platserna och bakomliggande orsaker sen replikering har saknats. Här beskriver vi en teknik som vi refererar till som ”G2 seq” där vi kombinerar flödescytometri med hög genomströmning sekvensering att belysa slutförandet av genomet replikering i jäst11. Med smärre förändringar, kan detta protokoll anpassas till alla celler som kan vara flöde-sorterad enligt DNA-innehåll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av celler för Flow flödescytometri sortering
- Inokulera 15 mL provrör innehållande 8 mL varje YEPD buljong sådana att kulturerna nå en densitet på 5 x 106 till 1,5 x 107 celler per mL efter övernattning tillväxt (se diskussion not 1).
- Snurra ner jästceller (1 400 x g, vid rumstemperatur eller 4 ° C) i ett 15 mL skruvlock centrifugrör för 5 min, Omsuspendera cellerna i 1,5 mL 70% etanol och överföring till ett 1,6 mL mikrofugrör, låta detta sit för 1 h i rumstemperatur eller minst 3 h på is ( kan sparas på obestämd tid vid 4 ° C) (se diskussion punkt 2).
- Snurra ner jästceller i microfuge (14 000 x g, 4 ° C) för 1 min, Återsuspendera i 1 mL 50 mM natriumcitrat, pH 7,2, varva ner (14 000 x g, 4 ° C) för 1 min, Aspirera supernatanten, Återsuspendera i 1 mL 50 mM natriumcitrat, pH 7,2 , som innehåller 0,25 mg/mL RNAse lösning för 1 h vid 50 ° C eller över natten vid 37 ° C i värme eller vattenbad.
- Tillsätt 50 µL proteinas K lösning (20 mg/mL resuspended i 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% vikt till volym glycerol) och inkubera i 1 h vid 50 ° C.
- Snurra ner celler (14 000 x g, 4 ° C), Omsuspendera cellerna i 1 mL 50 mM natriumcitrat, pH 7,2, snurra ner (14 000 x g, 4 ° C), Aspirera supernatanten med vakuum, Återsuspendera i 1 mL 1 µM grön nukleinsyra stam resuspended i 50 mM natriumcitrat , pH 7,2 och inkubera i mörkret för 1 h i rumstemperatur, Sonikera 2 x för 2 s varje (uteffekt 2 watt).
2. cellen sortering
- Använda en cell-sorterare, sortera celler enligt DNA-innehåll i faser G1, S, ”tidig G2” och ”sen G2”, samla minst 1,6 miljoner haploida celler från varje cellcykeln fas enligt figur 1 (se diskussion punkt 3).
- Överföra celler till microfuge rör och snurra ner cellerna i 20 min vid 14 000 x g vid 4 ° C i microfuge och Aspirera supernatanten med vakuum (pelleten kan förvaras fryst vid-20 ° C på obestämd tid, se diskussion punkt 4).
3. DNA-extraktion och beredning av sekvensering bibliotek
Obs: Följande är baserade på ”protokoll jag” i jäst genomiskt DNA utvinning Kit (se Tabell för material).
- Tillsätt 120 µL av ”matsmältningen buffert”, en egen buffert som gör att jästen lytisk enzym att smälta cellväggen och 5 µL av jäst lytisk enzym, Omsuspendera av vortexa och inkubera vid 37 ° C i 40-60 min.
- Tillsätt 120 µL ”lyseringsbuffert”, en egen buffert som innehåller rengöringsmedel och vortex svårt för 10-20 s.
- Lägg till 250 µL kloroform - blanda för 1 min.
- Snurra på högsta hastighet i en microfuge i 2 min.
- Ladda supernatanten på DNA bindande kolumn och centrifugera vid maximal hastighet i en microfuge under 1 min.
- Tillsätt 300 µL av ”DNA tvätt buffert”, en egen buffert som innehåller etanol och Centrifugera i 1 min på högsta hastighet i en microfuge. Kassera flödet genom, tillsätt 300 µL tvättlösning DNA och upprepa processen tvätta.
- Överföra den spin kolumnen till en färsk mikrofugrör, tillsätt 60 µL av vatten (inte TE) - vänta 1-3 min och sedan Centrifugera i 10 s till eluera DNA.
- Mäta koncentrationen genom att lägga 5 µL av DNA till 195 µL dsDNA hög känslighet reagens som har utspädd 1: 200 i dsDNA hög känslighet buffert och sedan mäta fluorescens i en fluorometer, med 10 µL av medföljande standarder för kalibrering; förvänta dig mellan 10 och 50 ng DNA totala avkastning.
- Sonikera (Peak Incident makt 450, Duty faktor 30%, cykler per brast 200, behandling tid 60 s, vattennivå 6) att bryta upp DNA i 250-350 bp fragment.
- Förbereda ett bibliotek med DNA prov förberedelse kit och sekvensera det (minst 10 miljoner 50 bp single-end läsningar) på instrumentet DNA sekvensering i snabb läge (se diskussion Obs (5)).
4. analys av sekvensering Data och generering av replikering profiler
- Justera sekvenser Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genomet använder Gsnap12 (se diskussion Obs (6)).
- Bestämma per-baspar Läs djup med Bedtools' ”genomeCoverageBed” programvara13.
- Ta bort tingsliga spikar i Läs djup, om aktuella (se diskussion Obs (7)).
- Slät Läs djup med kromosomen med medianer i en 20 kb skjutbara fönster med ”runMean” funktion i R paketet ”caTools” (se diskussion Obs (8)).
- Tomten läser djup i fas, tidig G2 och sen G2 som en procentandel av fullständigt replikerade Läs djup (se diskussion Obs (9)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har använt proceduren ovan för att identifiera sena replikerande platser i spirande jäst. Testa detta synsätt med en känd sen replikerande region på en konstgjord kromosom visade tekniken att vara riktig och tillförlitlig. Våra resultat har även visat den biologiska betydelsen av tid slutförandet av replikering av visar att en sena replikerande region på kromosom 7, som vi identifierat som sena replikera på grundval av våra G2-seq resultat, var förlorat cirka trefaldigt oftare än en jämförbar kontroll regionen11.
Ett specifikt exempel på resultat med G2-seq visas i figur 2. Vi hade en hypotes om att det skulle regioner i genomet som replikerats särskilt sent i celler saknas ett protein histondeacetylas kallas Sir2. Figur 2A visar utvecklingen av dataanalys för vildtyp (blå) och sir2 (röd). Raw-data (övre raderna) innehåller stora spikar, varav de flesta är på grund av förekomsten av Ty element. Dessa spikar avlägsnas genom tak Läs djupet på 2,5 x median Läs djup för varje prov (mellersta rader). Despiked data jämnas sedan med en 20 kb skjutfönstret (nedersta raden). Slutligen, data är normaliserade och ritade som nyckeltal att nivåerna i G1. En typisk sent-replikera region som visas i sir2 mutant är markerat i figur 2 c.
Figur 1. Flow flödescytometri profil som visar cellcykeln fraktioner används; yttre gränserna för alla grindar markerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. (A-B) Progression av databehandling från rådata (översta rader), despiked data (mellersta rader) och jämnas data (nedre rader) för vildtyp (A) och sir2 (B). (C) nyckeltal S fas - tidig G2-och sen G2-till G1 Läs djup. Vildtyp i blått och sir2 i rött. Det markerade området i det övre högra hörnet visar en sena replikerande regionen specifika till sir2 mutant. Skalan ger bråkdel av komplett (2N) replikering. en helt unreplicated cell skulle visas på 0,5, en fullständigt replikerade cell på 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan den här tekniken är robust och relativt rakt framåt, särskild uppmärksamhet bör ägnas följande:
(1) Vi rekommenderar att kulturer växa för minst 12 h innan de når log fas, eftersom skillnader manifesteras i cellcykeln distributioner om kulturer skördas efter att ha uppnått önskad täthet bara 4 h efter inympningen. Vårt antagande är att en cellcykeln-distribution som har nått en relativt stabil equilibrium bättre representerar en ”riktig” log fas fördelning än en distribution som är fortfarande i flux när en mättad kultur har överförts mer nyligen till färska medium.
(2) i stället för spinning ner cellerna innan fastställande, kan celler också fastställas genom att direkt lägga 100% etanol till jäst kulturen så att den slutliga koncentrationen av etanol är 70%. Celler kan odlas i antingen syntetiska eller rika (YEPD) medium.
(3) cellcykelns faser visualiseras för sortering av plottning mobilnummer som en funktion av 530 nm utsläpp område. Vi har funnit att de böjningsformer Poäng mellan G1 och S och mellan S och G2 fungera som robust sevärdheter för avgränsar S fas, och vi använder den G2 maximalt som gräns till separata tidiga och sena G2. Vi använder termerna ”tidig G2” och ”sen G2” för klarhet och korthetens, kanske på bekostnad av noggrannhet i den meningen att cellerna är tekniskt i S-fas tills de har avslutat DNA-replikation. Även om målet med G2-seq är att identifiera mycket sent-replikera webbplatser, som är förväntad att uppenbaras i den sena G2-fraktionen, samlar vi S fas och tidig G2 celler att följa replikering genom alla faser av cellcykeln.
(4) det är kritiskt viktigt att cellerna vara spunnen ner omgående efter sortering. Låt inte celler sitta över natten innan spinning dem ned. Vi har haft problem att återställa celler genom centrifugering om de har förvarats vid 4 ° C, vilket tyder på att de blir sköra vid sortering och lyse med tiden.
(5) så få som 5 miljoner läsningar är tillräcklig, men tomter blir mindre smidig med lägre antal läsningar. Datauppsättningar med ännu färre läser kanske kunna tillgodoses genom utjämning med windows större än 20 kb, men vi har inte provat detta.
(6) utbredda justering programvara (t.ex., Bowtie14, Novalign (http://www.novocraft.com), BWA15eller Gsnap12) kommer att fungera.
(7) hög genomströmning sekvensering data från jäst visar enstaka spikar i Läs djup, som speglar ofta Ty element. Vi eliminera dessa genom att ersätta 2,5 x median prov Läs djup för Läs djup utanför regioner som innehåller repetitiva sträckor (t.ex., rDNA) som är större än 2,5 x median. Eftersom de är kända för att innehålla repetitiva delar utesluts rDNA och ändarna av kromosomer. Ett exempel på denna ”despiking” med R-språket är följande:
# skapa en data ram kallas ”läser” som innehåller data:
Chr <-rep ('chrI', 10)
POS <-seq (1, 10)
RD <-c (3, 4, 6, 5, 88, 2, 9, 10, 900, 1)
läser <-data.frame ('kromosom' = chr,
'position' = pos,
'read_depth' = rd)
# ”despike” Läs djup:
läser [, 'despiked'] <-ifelse (läser [, 3] > (2,5 * median(reads[,3])),
(2,5 * median(reads[,3])),
Reads[,3])
”Tak” eller ”despiking” kan också uppnås genom exklusive läsningar som mappas till mer än en plats, men detta kommer att eliminera läsningar som mappas till, till exempel bara två platser. Instanser av läsningar som mappas till mer än en plats, men fortfarande ger värdefull information, är inte ovanliga när du arbetar med S. cerevisiae, vars arvsmassa resulterade från en fäderneärvda dubbelarbete16.
(8) vi har fått jämförbara resultat med både ”rollmedian” funktionen i R-paketet ”zoo” (https://cran.r-project.org/web/packages/zoo/index.html) och funktionen ”runmean” i R-paketet ”caTools” (https://cran.r-project.org/web/packages/caTools/index.html).
(9) vi har experimenterat med många metoder att normalisera Läs djup, vilket gav jämförbara resultat. Våra gynnade strategi är baserad på antagandet att åtminstone vissa regioner i genomet replikeras fullt i vår prov för S-fas. Vi fast beslutna Läs djupet som representerade fullständig replikering som medianen Läs djup i vår datauppsättning på platser som motsvarar 12 tidigaste skjuter högt förtroende (”förtroende” poäng > = 7) ursprung i en offentligt tillgänglig data. (http://cerevisiae.oridb.org/data_output.php?main=sc_ori_studies & tabell = Raghu2001_ori & ext_format = & format = flik). För de flesta tillämpningar, tillvägagångssätt för normalisering är inte kritisk och det finns många rimliga alternativ, mest bara normalisera för att läsa greve summor. Det är dock värt att notera att om det finns stora skillnader i antalet repetitiva sekvenser mellan prover, normalisering att läsa greve summor kan vara vilseledande. Till exempel, när man jämför två stammar vars rDNA matriser skiljer sig åt med flera gånger, kan normalisera totala Läs räknas göra vissa regioner i genomet hos stammen med större rDNA matrisen artefactually visas att replikera senare än stammen med mindre matris.
Sammanfattningsvis representerar G2-seq en logisk förlängning av befintliga tekniker för replikering profilering. Liksom andra sekvensering och microarray-baserade tekniker har G2-seq fördelar jämfört med 2D gel analys av genome bred täckning och avsaknaden av kravet på kunskap om platsen för replikering ursprung. Det sistnämnda är särskilt relevant i däggdjursceller där, till skillnad från i spirande jäst, replikering ursprung inte är begränsade till specifika sekvenser. Däremot, ger 2D gel en upplösning av molekylär intermediärer i DNA-replikationen helt ouppnåelig av G2-följande punkter utöka G2-seq till andra organismer vars celler kan sorteras enligt DNA-innehåll bör vara relativt rakt framåt, dock gör den mycket repetitiva karaktären av genomen hos högre Eukaryoter uppriktningen av korta Läs sekvenser mycket mer utmanande. Ny sekvensering teknik som ger betydligt längre Läs längd kan vara användbar i detta avseende, särskilt eftersom G2-seq bör vara relativt robust att de högre felfrekvenser som kan förknippas med längre läser17. Vår erfarenhet är det tekniska problem som är mest sannolikt att orsaka problem att låta celler sitta när de har sorterats och före isolering av DNA. Dessa celler visas att vara särskilt ömtåliga och lyse med tiden, och DNA bör isoleras inom högst en timme eller två av sortering. Lovande framtida inriktningar för denna teknik inkluderar att dela både S och G2 faser i ökande antal fraktioner att erhålla högre upplösning av dynamiken i genomet replikering, från tidig initiering till sena fullbordan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av grant NIH GM117446 till A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
