Summary
אנו מתארים פרוטוקול למדוד גלגול מאת ומונוציטים מעבר monolayers אנדותל אנושית ועם בגרות עוקבות שלהם לתאי קצף. זה מספק שיטה תכליתי כדי להעריך את מאפייני atherogenic ומונוציטים מבודד מאנשים עם מחלות שונות תנאים וכדי להעריך גורמים בדם אשר עשוי לשפר את הנטייה הזאת.
Abstract
לב כלילית (CAD) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. טרשת עורקים, מוביל לגרום של CAD, הוא שיזם גלגול של מולדת ומונוציטים המערכת החיסונית לאתרים דלקתיות של הפקיד השומנים הנקרא פסי שומן, אשר נמצאים בתוך דפנות העורקים של מדיום כדי עורקים גדולים. תכונת פתוגניים המפתח של נגעים בשלב כזה מוקדם של טרשת עורקים היא ההבשלה של monocytes אשר נודדים אל העורקים כדי ליצור תאי קצף או עמוסי השומנים מקרופאגים. ראיות רבות תומך את ההשערה כי הסיכון של טרשת עורקים מוגברת על ידי התנאים דלקתית כרונית המלווה מחלות כגון דלקת מפרקים שגרונית, HIV, כמו גם הזדקנות כללית, וכי הסיכון הזה הוא ניבא על ידי מונוציט הפעלה. בעוד העכבר מודלים מספקים פלטפורמה טובה לחקור את התפקיד של monocytes atherogenesis ויוו, הן דורשות שינוי גנטי של כולסטרול טבעי מטבוליזם ושינוי דרסטי של העכבר הרגיל דיאטות, מוגבלת התאמה חקר השפעות atherogenic של מחלות comorbid אנושי. זה הניע אותנו לפתח מודל אנושי במבחנה כדי למדוד את הפוטנציאל atherogenic של monocytes מבודד מאנשים עם מצבי מחלה מוגדרת. כיום, אנושיים במבחנה מודלים המגבילים בכך שהם מוערכים מונוציט גלגול קצף תא היווצרות בבידוד. כאן נתאר פרוטוקול שבו ומונוציטים מבודד דם החולה transmigrate על פני תאי אנדותל אדם לתוך מטריצה קולגן מסוג 1, ואת הנטייה שלהם להבשיל לתאי קצף ב נוכחות או היעדרות של השומנים אקסוגני נמדד. הפרוטוקול אומתה על השימוש האנושי ומונוציטים מטוהרים אנשים עם הידבקות ב- HIV ויחידים HIV uninfected קשישים. מודל זה הוא תכליתי ומאפשר מונוציט גלגול קצף תא היווצרות להעריך באמצעות מיקרוסקופ או או cytometry זרימה, כמו גם מאפשר את ההערכה של גורמים atherogenic, המצויים בסרום או פלסמה.
Introduction
מונוציט גלגול היא צעד מכריע בהתפתחות טרשת עורקים פלאק שעלולות להוביל פקקת, שבץ מוחי, אוטם שריר הלב. שלטי טרשת עורקים להתפתח פסי שומן, בדרך כלל נוכח באתרים של זרימת הדם מתנדנדות נמוך בינוני עורקים גדולים, שבו הופקדו השומנים תורמת הפעלה אנדותל, מקומי דלקת1. ומונוציטים מגויסים כדי תאי אנדותל פסי שומן באמצעות מונוציט chemotactic חלבונים (כגון CCL2), transmigrate לתוך אינטימה2. בעקבות גלגול, ומונוציטים עלולה להיווצר מקרופאגים atherogenic, עמוסי השומנים הנקרא תאי קצף בשל ספיגת השומנים, בסינתזה השומנים, למטה-ויסות כולסטרול בזרימת או שילוב של הגורמים לעיל. ומונוציטים עשויים לצבור שומנים במחזור ויש גם הפנוטיפ 'רכה', יכול להיות נטייה תאי קצף תא היווצרות3,4. תאי קצף התכונות המגדירות של פסי שומן ושלטים טרשת עורקים בשלב מוקדם, שלהם גיבוש מושפעת השומנים וגם מתווכים דלקתיים5. לחלופין, ומונוציטים יש את היכולת להפוך transmigrate של העורק לתוך מחזור הדם6, ובכך להסיר את השומנים מן אינטימה להתנהג כדי לשמור על הבריאות של העורק.
קביעת של הנטייה של monocytes כדי transmigrate על פני אנדותל העורקים ואת תאי קצף טופס של אינטימה, או להיפוך transmigrate ולסחוב השומנים מחוץ הפלקיו, היא דרישה מפתח להבנת התפקיד של הפעלת מונוציט בהגדלת הסיכון טרשת עורקים. דגמי העכבר CADs כגון טרשת עורקים חשובים שחקרתי בזמן אמת אין ויוו מידע על התפתחות רובד שומני פס/טרשת עורקים. עם זאת, מודלים אלה מחייבים שינוי גנטי של רמת הכולסטרול טבעית עיבוד היכולות של חיות אלו בדרך כלל בשילוב עם שינויים דרסטיים דיאטה (כגון דגם דיאטה ספקיות-/-מערבי-type)7,8, ובכך, גרימת הצטברות-פיזיולוגיים של מחזורי השומנים רמות שהתפתחות לוח הכונן. מודלים אלה תהיה מוגבלת רלוונטיות התנאים דלקתית כרונית אנושיים כגון הידבקות ב- HIV אשר אינם משויכים מוגבר במחזור כולסטרול או רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL). יתר על כן, הבדלים בביולוגיה מונוציט בין בני אדם ועכברים לבצע בדיקה של אימונולוגי שאלות הנוגעות הרלוונטיות של subpopulations של ומונוציטים (כגון ומונוציטים ביניים (CD14++CD16+))9 קשה. זה חשוב כאשר לומדים את מנגנוני נהיגה למחלות לב וכלי דם כמו ספירת ביניים מונוציט באופן עצמאי לחזות אירועי לב וכלי דם10,11. בזמן מבחני קיימים למדוד באופן רציף או מונוציט גלגול או קצף כדוריות בבידוד, אין assay במבחנה אומתה לכימות תנועת שני היבטים של atherogenesis מוקדם באמצעות אותם התאים של גדודים קליניים. Transwell מודלים לנצל ששונה בוידן דו תאיים מערכת לפיה תאים מוטענים לתוך התא העליון, transmigrate דרך מחסום פלסטיק נקבובי או טפט תא לתא התחתון המכיל בדרך כלל מדיה עם chemoattractant12 , 13. תוך שימוש נרחב לניתוח ליקוציט גלגול, מודלים אלה בדרך כלל לא לשלב שכבה המייצג של אינטימה, וכתוצאה מכך שמדמו תאים נודדים לתוך פתרון, ולא מאפשרים לשקילת קצף תא היווצרות או גלגול לאחור של אותם התאים. לעומת זאת, מודלים של היווצרות תאי קצף לא בחשבון שינויים transmigratory-induced ומונוציטים או אפקטים של הפעלת אנדותל אשר ידוע לתרום קצף היווצרות התא14. יתר על כן, מערכות אלו זירוז קצף כדוריות של מקרופאגים דבקה צלחות התרבות התא על ידי הוספת קולח ריכוזי אקסוגני מחמצנים ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (oxLDL)15,16משרן מפתח להק תא קצף. LDL בשימוש במודלים אלה היא לעתים קרובות תחמוצת על-ידי תהליכים שאינם פיזיולוגית-רלוונטיות כגון טיפול4 CuSO17, לכן, לחקור את חשיבות פיזיולוגית של מחקרים באמצעות מודלים אלה.
כאן נתאר וזמינותו של זה מכמת מונוציט גלגול, היווצרות תאי קצף לאותם התאים אשר אינה דורשת התוספת של oxLDL אקסוגני, לכן כדאי דגמי את התפקיד של monocytes במבנה התא קצף. מודל זה פותחה במקור על ידי פרופסור ויליאם מולר (אוניברסיטת נורת'ווסטרן, שיקגו)18, יש נוספת מעודן במעבדה שלנו להעריך שמחוץ atherogenicity של monocytes מבודד תחת שאינו מפעיל מאנשים עם מצבים דלקתיים כבסיס המלווה מחלות כמו איידס זיהום19 , כמו גם הזדקנות20, כי התנאים קשורה לסיכון מוגבר של טרשת עורקים. מודל זה מספק גם פלטפורמה עבור מענה לשאלות ביולוגי בסיסי לגבי נטיה של קבוצות משנה מונוציט שונים לטופס קצף תאים20, ההשפעה של הפעלת אנדותל על ידי ציטוקינים כגון TNF-קצף כדוריות14 , ואת המאפיינים הנדידה של monocytes כגון עומק ומהירות מהאוכלוסיות ג'לים19. יתר על כן, גלגול מונוציט תא היווצרות קצף ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ רגיל, לחיות תא הדמיה, flow cytometry והדמיה cytometry זרימה, לכן, לספק שיטה רב תכליתי כדי להעריך את התפקיד של monocytes ב- atherogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניסויים באמצעות דגימות ביולוגיות האדם בוצעו באישור אתיקה אלפרד חולים אנושיים ועדת האתיקה, מלבורן. כל הניסויים בוצעו ב- Class II אבטחה ארונות, אלא אם כן צוין. " Prewarmed " מתייחס ריאגנטים התחמם עד 37 מעלות צלזיוס waterbath.
1. הכנה של סוג I סיבי קולגן ג'לים: יום 1
- הכנת polymerized קולגן ג'לים על-ידי הוספת ולערבב 35.7 מ"מ NaOH ברצף, 0.71 x M199, חומצה אצטית 4.58 מ מ ו- 1.71 מ"ג/מ"ל מקליד אני סיבי קולגן פוליסטירן מ ל צינור לפי טבלה 1-
הערה: ודא כי הקולגן הוא מעורבב היטב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים על מנת לעצור את הייצור של קולגן ' כיסים ' בתערובת ג'ל. להכין 4-6 ג'לים לכל תנאי בדיקה מיקרוסקופית או ג'ל 15 לכל תנאי הבדיקה עבור cytometry זרימה. - טוב פעם מעורבים, aliquot µL 50 של קולגן ג'ל תערובת לתוך כל טוב של צלחת סטרילי שהונעו 96-ובכן תרביות רקמה. אל תשתמש בשורות ובעמודות מבחוץ, אבל למלא אותם עם 200 µL 1 x Dubecco ' s פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) כדי להגן על ג'לים מהתייבשות. דגירה צלחות-37 °C/5% CO 2 על 2 h לאפשר הקולגן פולימריזציה.
הערה: הנח את הצלחות ישירות על מדפי מתכת נקייה בחממה כדי להבטיח אפילו חום הפצה. - בעקבות דגירה, כיסוי של ג'לים עם 150 µL 1 x שהושלם M199 (ראה טבלה של חומרים) דגירה במשך 5 ימים עד שימוש.
2. הרחבת מאוחסנות HUVEC: 1 יום
- תווית והמעיל 10 ס מ קוטר צלחת פטרי עם 1 מ"ל של 50 µg/mL fibronectin מדולל ב- 1 x PBS, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות Aliquots
- הפשרה של cryopreserved חבל הטבור אנושי ראשוני הווריד תאי אנדותל (HUVEC, 1.0 x 10 6 תאים) 10 מ"ל M20.
הערה: HUVEC צריך להיות מוכן כפי שתואר קודם לכן 21 ומשמש במספר נמוך המעבר (< מעבר 4). HUVEC עשוי להיות מוחלף עם תאי אנדותל עורקים האנושי כאן. - Resuspend HUVEC ב- 10 מ"ל M20 ולהוסיף מאכל מצופה fibronectin, כ רפה בעברית fibronectin עודף לפני תוספת של תאים, תרבות של הנהרות (כ 5 ימים), החלפת בתקשורת על יום 3-
3. Culturing HUVEC טפט על קולגן ג'לים: יום 5
- ביום 5, ניתוק HUVEC על ידי כ רפה בעברית תרבות supernatant מ הפטרי ועקצה סרום המכיל מדיה עם 10 מ"ל של ללא סרום M199.
- מוסיפים טריפסין 0.05% מ ל/0.53 EDTA M199 כדי HUVEC, תקופת דגירה של 1-2 דקות בטמפרטורת החדר, מנענע בעדינות עד לנתק התאים.
- ברגע מנותק, לשטוף צלחת פטרי עם 5 מ"ל M20 ובמהירות העברת שהמדיה המכילה תאים לרכבת התחתית 10 מ ל-
- דגימות צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, תשאף תגובת שיקוע, resuspend תאים µL 200 של M20 ו לספור תאים באמצעות hemocytometer.
- Resuspend לתאים 2.0 x 10 5 תאים/מ ל M20, וארוקן את M199 על ג'לים מהצלחת 96-ובכן (שלב 1.3), להוסיף 100 µL של resuspended HUVEC (2.0 x 10 4 תאים) כל ג'ל קולגן המוכן מעל (שלב 1.2). תרבות צלחות 3 ימים נוספים-37 °C/5% CO 2.
הערה: על טפט HUVEC השלמות עשוי לאשר לאחר 3 ימים כסף חנקתי מכתים 22 או אימונוהיסטוכימיה עבור צומת חזק חלבונים 23 בשלב זה. ג'לים נוספים חייבים להיות מוכנים למטרה זו.
4. הפעלה של טפט HUVEC, בידוד/הפעלה של Monocytes עבור גלגול: ביום 8
- על יום 8, להפעיל כל טפט HUVEC לפני התוספת של monocytes על-ידי כ רפה בעברית M20 של מדיה בשכבת-על ג'לים והוספת µL 100 של 10 ng/mL TNFα האנושי ב- M20 לכל ג'ל. דגירה-37 °C/5% CO 2 עבור 4 h.
הערה: תנאים שלא הופעל HUVEC עשויות להיכלל גם אם נדרש כפקדים. - במהלך 4 h HUVEC ההפעלה צעד, ולבודד ומונוציטים מ- PBMCs באמצעות מגנטי חרוז טכניקות כדי לבחור באופן שלילי עבור תאים לפי היצרן ' s הוראות. מינימום של 6.5 x 10 6 PBMCs אמור לשמש בשלב זה כדי לשחזר בצורה אמינה 3.0 x 10 ומונוציטים 5 הדרושים עבור תנאי אחד, כפי ומונוציטים בחשבון בדרך כלל כ- 10-15% PBMCs.
הערה: כדי להעריך את ההשפעה של הפעלת מונוציט לפני היווצרות גלגול מונוציט תא קצף, ומונוציטים יכול להיות מופעל בשלב זה. ומונוציטים יכול להיות מבודד PBMCs המופשרים במידת הצורך (כלומר, מאוחסנות הדגימות החולה). מונוציט קבוצות משנה בודד על-ידי מיון FACS ניתן להכין עבור תוספת ג'ל (איור 1).
5. גלגול של ראשי ומונוציטים אנושי: ביום 8
- כדי למדוד מונוציט גלגול, להסיר המכילות TNFα מדיה ותרחץ ג'לים פעמיים עם 100 µL M199 על-ידי הוספה והסרה של מדיה. אחרי הכביסה, להוסיף 2.0 x 10 5 טרי מבודד או הקרת, שטף cryopreserved PBMCs או 5.0 x 10 ומונוציטים 4 טריים מבודד או מטוהרים מונוציט קבוצות משנה כדי HUVEC monolayers ב 100 µL M20. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 כדי לאפשר גלגול קדימה של monocytes לתוך הג'ל. מומלץ לאפשר בארות 6 עבור כל תנאי הניסוי בדק.
הערה: כדי להעריך את השפעת סרום עצמיים על היווצרות התא גלגול וקצף, דגירה תאים עם M20 המכיל את הריכוז הרצויה של התורם לא פעיל חום סרום ולהשוות תנאים עם פקד במאגר בנסיוב אדם. לויקוציטים חוץ ומונוציטים ניתן להוסיף בשלב זה. אם חוקר את השפעת מינים ספציפיים ליפידים/שומנים בדם (למשל, HDL, oxHDL), בצע את השלבים הבאים כל עם מדיה ללא סרום המכיל שומנים µg/mL 20-50- - לאחר 1 h של גלגול לפנים, לאסוף את התאים הלא-שמדמו ע י שטיפת ג'לים פעמיים עם µL 100 מ מ 1 prewarmed EGTA ב- 1 x PBS, ופעם אחת עם 100 µL M199 (אותו דבר צנטריפוגה תנאים), צירוף של supernatants מכל קידוח של אותו ניסיוני תנאי (בדרך כלל 6 בארות) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL על קרח. Centrifuge התאים הלא-שמדמו-4 ° C, g x 300 עבור 5 דקות ו- resuspend ב- 30 PBS 1 x µL.
- לספור את התאים שליקט את תגובת שיקוע כדי לקבוע את מספר התאים הקדמיים שמדמו.
- אחוז תאים שמדמו קדמי נקבע כדלקמן:
- לכסות נסחפה ג'ל המכיל תאים שמדמו עם 100 µL M20 דגירה עבור ה 48 נוספים
- לאחר 48 שעות, לאסוף את תגובת שיקוע של תאים שאינם שמדמו לשטוף פעמיים עם 100 µL prewarmed 1 מ"מ EGTA/PBS, איסוף וריכוז את תגובת שיקוע של כל תנאי כמו שלב 5.2.
הערה: פנוטיפ של תאים שמדמו הפוכה עשוי להיבדק על f תאים אלהcytometry זרימה רגילה מכתים פרוטוקולים. - צנטריפוגה תאים ב 4 ° C, g x 300 עבור 5 דקות, resuspend תאים ב- PBS 1 x µL 30. לספור תאים ולקבוע את הכדאיות באמצעות צביעת trypan blue.
- לקבוע את אחוזי תאים שמדמו הפוכה באמצעות המשוואה הבאה:
הערה: הנהלת חשבונות עבור המספר הכולל של תאים שמדמו קדימה נותן אינדיקציה מדויקת יותר של גלגול לאחור כפי שהוא גלגול קדימה לא סביר יהיה 100%- - עבור ניתוח על ידי מיקרוסקופ, לתקן את ג'ל על-ידי הוספת µL 100 2% פורמלדהיד (ריכוז סופי) כל טוב, לכסות את הצלחות אלומיניום לסכל ולאחסן ב 4 ° C עד הניתוח. עבור cytometry זרימה, אל תתקן את התאים בשלב זה. לראות את הפרוטוקולים מתחת מיקרוסקופ (סעיף 6) או ניתוח תזרים cytometry (סעיף 7).
התראה: פורמלדהיד הוא רעיל, מאכל; השתמש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי). כדאי לשים לב בעת הוספת פורמלדהיד, עם זאת, שלב זה אינו צריך להתבצע בשכונה fume בשל הריכוז נמוך בשימוש.
6. כימות של קצף תאים מקרופאגים על ידי מיקרוסקופ (שמן-אדום O כתם)
- להסיר את הפורמלדהיד ולשטוף את ג'ל עם 100 µL של 50% (v/v) מתנול עבור 5 דקות, 100 ואז 78% (v/v) µL מתנול עבור 15 דקות
הערה: השלבים מכתימים ניתן לבצע על הספסל מעבדה ולא ארון Class II הביולוגי. - הכתם השומנים טיפות על-ידי הוספת 100 µL של טריות 0.2% (w/v) שמן-אדום O (לפרטים, ראה טבלה של חומרים) לשעה בטמפרטורת החדר.
- הסרת כתם עודף בשטיפה של ג'לים 4 פעמים עם 100 µL של 78% (v/v) מתנול, כ רפה בעברית ומחיקת את תגובת שיקוע לאחר כל לשטיפה
- Counterstain במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם 100 µL של Giemsa, 1:10 מדולל במים מזוקקים.
- וארוקן את צביעת גימזה ולשטוף ג'לים פעם אחת עם מים-
- כדי לנתק את ג'לים מהצלחת, שפת הבארות באמצעות מחט 21 G, עם שפוע גוחנת, סביב הקצוות של הג'ל.
- כדי לטעון את ג'לים בשקופית מיקרוסקופ, אגרוף שני חורים (6.35 מ מ קוטר) רצועה 2.54 ס מ x 1.5 ס מ של סרט הדבקה דו-צדדי. לתקן את הקלטת לצד מיקרוסקופ רגיל ולהסיר ציפוי המגן מלמעלה.
- הוסף טיפה של מים החורים את הקלטת באמצעות פיפטה של העברה. באמצעות פינצטה, להעביר בעדינות ג'לים החורים הקלטת ואת כיסוי עם coverslip 1.5 זכוכית גודל. לחץ בעדינות על coverslip לדבוק זה הקלטת.
- לבחון עם התערבות דיפרנציאלית ניגודיות מיקרוסקופיית בהיר-שדה באמצעות המטרה X 40 על מיקרוסקופ הפוך.
- הביאו טפט HUVEC להתמקד בגיל 40 X ההגדלה ואת הגלילה ' לתוך ' הג'ל, ספירת תאים מקרופאגים/קצף ברחבי העומק כולו של הג'ל. חזור על שלושה ייחודי שדות מבט ממוקם במרחקים דומה מהקצה של הג'ל על מנת לצמצם תופעות אפשריות קצה. פעולה זו תבטיח את עומק ג'ל אינו עקבי בין ספירת אזורים.
הערה: ציון תאים הג'ל כצבעי תאי קצף (כהגדרתו תאים המכילים > 1/3 ציטופלזמה שלהם כמו שמן-אדום O צבעונית השומנים טיפות) או מקרופאגים בתוך שעתיים של הרכבה בשקופיות ( איור 2). קצף כדוריות מבוטא כאחוז מתוך תאי קצף ביחס למספר תאים שהועברו ומבוטא לפי הסעיפים החציוני ב- 3 שדות ראייה בדק עבור ג'לים 6 לכל תנאי, ולכן החציוני של מדידות 18 לכל תנאי. דוגמה של ספירת raw של ניסוי טיפוסי מוצג בטבלה מס ' 2-
הערה: סיווג תא כמו macrophage לעומת תאי קצף על ידי מיקרוסקופ הוא סובייקטיבי, וכתוצאה מכך יכול להיות תלויי-חוקר. במחקרים קליניים, שבו מתבצעים ניסויים על פני תקופה ארוכה של זמן, חשוב עבור כל ספירה להתבצע עד חוקר יחיד. דוגמאות של קצף תאים מקרופאגים, ג'לים מסופקים באיור 2.
- הביאו טפט HUVEC להתמקד בגיל 40 X ההגדלה ואת הגלילה ' לתוך ' הג'ל, ספירת תאים מקרופאגים/קצף ברחבי העומק כולו של הג'ל. חזור על שלושה ייחודי שדות מבט ממוקם במרחקים דומה מהקצה של הג'ל על מנת לצמצם תופעות אפשריות קצה. פעולה זו תבטיח את עומק ג'ל אינו עקבי בין ספירת אזורים.
7. ניתוח של תאים שמדמו מאת Flow Cytometry
- phenotypically לאפיין תאי קצף ו מקרופאגים בעקבות הגירה transendothelial, לעכל את ג'ל על-ידי הוספת µL 100 של 37 ° C prewarmed 1 מ"ג/מ"ל collagenase D מעורבבת עם M199 כדי כל טוב, תקופת דגירה של 20 דקות-37 °C/5% CO 2.
הערה: הנח את הצלחות 96-ובכן ישירות על מדפי מתכת נקייה בחממה כדי להבטיח אפילו חום הפצה. - בעקבות דגירה, macerate של ג'לים באמצעות טיפ פיפטה 200 µL, דגירה כעשרים דקות נוספות-37 °C/5% CO 2.
- פעם מלא מתעכל, מסנן ובריכה ג'לים שכפל מתעכל דרך 35 מיקרומטר ניילון mesh רצ'ט צינורות FACS המוטלות על קרח, לשטוף פעם עם FACS לשטוף (ראה טבלה של חומרים) ב 4 ° C, x 300 ג' Resuspend תאי µL 100 של FACS ווש
- תקופת דגירה התאים שנוצר עם fluorophore מצומדת נוגדנים ספציפיים של CD45, סמן תא חי/מת וסמנים משטח/תאיים פנוטיפי או פונקציונליים עניין באמצעות פרוטוקולי cytometry זרימה רגילה.
הערה: להכין שליטה צינורות לפיצוי באמצעות fluorophores המתאים Ig פיצוי חרוזים. תאים שחולצו עשוי גם להיות שנאספו על גבי זכוכית שקופיות מיקרוסקופ immunofluorescence על ידי cytospinning. לחלופין, בהצלחה שאספנו תאים באמצעות פרוטוקול זה להערכה באמצעות הדמיה cytometry זרימה. - לרכוש תאים באמצעות cytometer של זרימה, ולבצע פיצויים כנדרש.
הערה: כמו קצף תאים/macrophages עלול לא בצורת אוכלוסיות נפרדות באמצעות מאפייני פיזור אור, עשויים להיות שונים במידה ניכרת בגודלם, להגדיר פיזור הבא הליברלית (FSC) ושערים פיזור (האס) בצד כדי ללכוד את כל התאים שהועברו כפי שמוצג < מחלקה חזקה = "xfig" > 3A איור. - בעקבות הרכישה, לבצע את ניתוח נתונים באמצעות תוכנה cytometry זרימה. כדי לזהות תאים שהועברו, בחר תחילה את התאים כמו שלילית דה מרקר חי/מת, כפי שמוצג באיור 3B. לאחר מכן, לבצע אפליה של תא בודד על-ידי יצירת שער חזק מסביב לתאים שמוצג על מגרש לעומת גובה האס האס-אזור.
- בחר CD45 + תאים, שער האוכלוסייה הגדולים של תאים שהועברו נוכח מגרש FSC/האס כמו אלה הם תאים מקרופאגים/קצף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לכימות מונוציט גלגול
ומונוציטים נוספים למודל כמתואר באיור1, ג'לים שישה מוכנים עבור כל תנאי. ומונוציטים עבור ג'לים 6 לכל תורם (קרי, 5.0 x 10 ומונוציטים4 לכל ג'ל ג'ל 6 = 3.0 x 10 ומונוציטים5 לכל התורם) הם resuspended לאמצעי הסופי של 600 µL של המדיה M199 המכילה את השומנים בסרום/מבודדים נדרש. תאים (כלומר, µL 100 לכל ג'ל = 5.0 x 104 ומונוציטים) הינם ואז aliquoted על גבי ג'לים מודגרות לעיל עבור h 1 להקל על מונוציט גלגול. בעקבות גלגול, תאים שאינם שמדמו נספרים כמפורט לעיל. בדוגמה זו, נמצאו 1.5 x 10 תאים שאינם שמדמו4 . האחוז של גלגול קדימה נקבע באמצעות הנוסחאות שמתואר בשלב 5.4:
לאחר 48 שעות של דגירה, 3.6 x 104 הפוכה שמדמו תאים נמצאו לעיל. האחוז של גלגול לאחור נקבע באמצעות הנוסחה שלב 5.8:
גלגול ואחורה ניתן להשוות בין התנאים באמצעות בדיקות סטטיסטיות המתאים ומונוציטים מוכן מתורמים עצמאיים מרובים כדי לקבוע אם היכולת גלגול מונוציט היא שונה בין ניסיוני תנאים.
הערכת קצף כדוריות
מיקרוסקופ Brightfield
Lipoproteins מחמצנים ידועים כדי לקדם את קצף נגזר מונוציט תא היווצרות במבחנה לעומת שומנים unoxidized15. כאן אנחנו לאשר כי הטיפול של monocytes עם oxLDL, נפוץ כדי לעודד היווצרות התא קצף קצף קונבנציונאלי התא אינדוקציה דגמים, משפר את קצף נגזר מונוציט כדוריות במודל זה של היווצרות ההעברה transendothelial תא קצף בהשוואה LDL מקורית. בעקבות מונוציט גלגול וקצף תא-צורה ג'לים מודגרות עם M199 המכיל 50 µg/mL מקורי או CuSO4-LDL מחומצן (ראה שלב 5.1, איור 1), תאים נותחו על ידי מיקרוסקופ. דוגמאות של קצף תאים מקרופאגים נצפתה בניסויים נציג מוצגים באיור2. תאים נספרו בתחומים שונים שלוש לכל ג'ל, על ידי התמקדות בבית טפט HUVEC בהדרגה תוך התמקדות עמוק יותר לתוך הג'ל. ספירת נרשמים עבור כל תורם, כפי שמוצג בטבלה 2 עבור תורם יחיד, כדי להשוות את אחוז תאי קצף שהוקמה בתגובה מחומצן ו- LDL מקורית. לצבור נתונים מ- n = 12 נחשב עצמאי מוצגים באיור 4 לאשר כי דגירה של monocytes עם oxLDL במודל זה גורם היווצרות תא קצף יותר מאשר תנאי שבו ומונוציטים מודגרת עם יליד LDL M199 מדיה או לבד.
Cytometry זרימה
כדי לקבוע את פנוטיפ של תאים שהועברו, התאים מופק ג'לים מעוכל, שכותרתו באמצעות פאנל cytometry זרימה רגילה. תאים עם תווית עם סמן חיים/מתים התאים, נוגדנים ספציפיים עבור CD45 וסמנים אחרים פנוטיפ השטח באמצעות פרוטוקולי cytometry זרימה רגילה פקדים פיצוי חייב להיות מוכן גם לפיצוי מלא לפי טכניקות cytometry זרימה רגילה. תאים שהועברו הן פיקוח כפי שמוצג באיור 3 מגרשים נציג של 10 ניסויים עצמאית. תאים חיים הן פיקוח באמצעות מבחני הכדאיות תא חי/מת (איור 3B), doublets יוצאו על ידי ניתוח תא בודד (איור 3C). תאים ואז הן פיקוח כמו CD45+ כדי לא לכלול HUVEC (כמו תאים אלה הם CD45-, דמות תלת-ממד). האוכלוסייה הגדולים ואז יש פיקוח על ידי פיזור/צד קדמי פיזור אפליה (איור 3E) ואת עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) של קולטני עניין נקבעות בהשוואה זריחה או מינוס אחד (FMO) או isotype לשלוט ( איור 3F) כדי לקבוע את הביטוי (ΔMFI) או אחוז תאים חיוביים.
איור 1 : במבחנה דגם להק תא גלגול וקצף מונוציט. (א) PBMC, ומונוציטים הכולל (B) או (ג) ממוין FACS מונוציט קבוצות משנה נוספים להקליד אני סיבי קולגן ג ' לים שהוקמה בשנת 96-ובכן צלחות וצפות עם טפט של הטבור האנושי ראשי מופעל הווריד תאי אנדותל (HUVEC), אשר שלמות עשויים להידרש בכסף מכתים (D), מותר (E) transmigrate עבור 1 h בנוכחות סרום או השומנים המכילים מדיה. תאים שמדמו-שאינם נכללים בספירה (F), ג'לים מודגרת עבור 48 שעות נוספות עם הנסיוב/השומנים באותו המכיל מדיה. בעקבות דגירה, (G) תאים שהועברו הפוכה נספרים, האחוז של תאי קצף לעומת מקרופאגים הג'ל נקבעת על-ידי (H) שלב ניגודיות מיקרוסקופ בעקבות מכתים עם שמן-אדום O או פנוטיפ של תאים שהועברו נקבע על-ידי (אני) cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : דוגמאות של קצף תאים מקרופאגים ב במבחנה דגם להק תא גלגול וקצף מונוציט. Representatאייב דוגמאות של תאים הבקיע כמו קצף תאים (החצים הלבנים) ו מקרופאגים (חיצים שחורים) לאחר Giemsa מכתים להמחיש תאים, שמן-אדום O צביעת להמחיש טיפות השומנים כפי שנקבע על ידי שלב במיקרוסקופ ניגוד של ג'ל חילוץ באמצעות הפוך בעזרת מיקרוסקופ בהגדלה X 40 סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Gating אסטרטגיה של תאים שמדמו על ידי cytometry זרימה. תאים שמדמו phenotypically מאופיינת cytometry זרימה בעקבות הפקת תאים מן ג'לים. תאים הן פיקוח על ידי (A) FSC/האס, תאים חיים (B), תאים בודדים (ג), (ד) CD45+, (E) FSC/האס והביטוי (F) של קולטן בהשוואה isotype או קרינה פלואורסצנטית מינוס אחד שליטה (FMO). הביטוי של קולטני עניין כהגדרתו עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI), בא לידי ביטוי ביחס רמות של isotype. ΔMFI = כתם (MFI) פחות שליטה isotype/FMO (MFI). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : השפעת oxLDL exogenously נוסף ו- LDL על קצף נגזר מונוציט כדוריות. קצף כדוריות נקבע בתנאים שבו ומונוציטים מתורם יחיד מודגרת עם מדיה (M199) או µg 50/mL unoxidized ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) או נחושת סולפט (II) מחומצן LDL (oxLDL) נוספו גלגול שלאחר ג'לים. סעיפים 12 אתרים נפרדים מוצגים. תאי קצף מבוטא כאחוז של תאים שהועברו הכולל. רכסי החציוני ו בין רבעוני מוצגים בתרשימים בר, השוואות נעשו באמצעות בדיקות U מאן-ויטני-פרמטרית. p < 0.001, * * * p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מגיב | [מניות] | [הסופי] | נפח עבור ג'לים 60 (µL) |
| NaOH | 100 מ מ | 35.7 מ"מ | 1071 |
| M199 | 30: | 0.71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 מ מ | 4.58 מ מ | 687 |
| קולגן | 5 מ"ג/מ"ל | 1.71 מ"ג/מ"ל | 1029 |
| הנפח הכולל | - | - | 3000 |
טבלה 1: סוג סיבי קולגן ג'ל הכנה
| LDL | oxLDL | |||||||
| ג'ל | ספירה | קצף תאים1 | תאים שהועברו1 | קצף תאים (%)2 | קצף תאים1 | תאים שהועברו1 | קצף תאים (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47.3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18.5 | 10 | 23 | 43.5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21.2 | 19 | 39 | 48.7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14.7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58.2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13.5 | 19 | 37 | 51.4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53.8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 11 | 31 | 35.5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18.4 | 28 | 53 | 52.8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20.5 | 14 | 33 | 42.4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 22 | 47 | 46.8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36.7 | ||
| תאי קצף החציוני (%) | 20.8 | 47 | ||||||
| תאי קצף הממוצע (%) | 19.8 | 45.5 | ||||||
בטבלה 2: תא Raw נחשב מההשוואה תאי קצף נגזר מונוציט בעקבות טיפולים oxLDL לעומת ה-LDL- 1 תא ספירות לכל שדה ראייה של ג'ל. 2 אחוז תאי קצף קצף = תא ספירות/סה כ תא שהועברו נחשב x 100. * הנתונים הם נציג של אחד הניסוי באמצעות ומונוציטים מתורם יחיד
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מציע שיטה רב-תכליתי פיזיולוגית רלוונטי להערכת את atherogenicity של ומונוציטים מן האנושי גדודים קליניים, על ידי שילוב של גלגול מונוציט והן קצף כדוריות. מודל זה מציע יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות להק תא קצף הוא לוקח בחשבון את השפעת מונוציט גלגול על היווצרות תאי קצף ומאפשר את המדידה של גלגול לאחור6 בנוסף הגלום הנטייה של monocytes להבשיל לתאי קצף ב נוכחות או היעדרות של גורמים אקסוגניים. יתר על כן, תפקידה של הפעלת אנדותל גם בחשבון כפי שהראתי את חמצון upregulates ההפעלה אנדותל של מינים השומנים המשויך קצף תא היווצרות14. לבסוף פנוטיפ של monocytes עוברים היציאה (מאפיין המשויך פלאק רגרסיה) יכול להיות לכמת, המאופיינת cytometry מיקרוסקופ וזרימה.
בשל אופיו תלת מימדי של גלגול לתוך ג'לים, זיהוי וניקוד התאים transmigrated תאי קצף או מקרופאגים יכול להיות קשה כמו תאים transmigrate הרמות השונות ג'ל19. כדי לסייע הזיהוי של תאי קצף, כתם שמן-אדום O טריים יש להשתמש כל הזמן. זה גם לשים לב כי מצבי מחלה שונים שמחוץ או במבחנה תנאים עשוי לשנות מונוציט גלגול הג'ל. השתמשנו תא חי הדמיה לזהות כי ומונוציטים מאנשים נגוע ב- HIV נוטים transmigrate לנקודות רדודים ג'לים, במהירויות שונות מאשר אלה של יחידים נגוע19. יתר על כן, קצף כדוריות קשורה עם פחות תנועתיות מונוציט הג'ל כך התאים נוטים לנוע במעגלים-z-מקטע מסוים לעומת תאים מאנשים HIV-uninfected אשר נוטים להעביר קו ישר יחסית לכיוון התחתון של הג'ל. ממצאים אלה מעלים את האפשרות של תופעה דומה המתרחשים ניסויים באמצעות דגימות החולה האנושי של מצבי מחלה אחרים הקשורים מונוציט מוגברת atherogenicity.
בעת ביצוע ניתוחים מבוססי cytometry זרימה מקובל לבחון חלק ניכר של תאים מתים באוכלוסייה תא התאושש בעת הערכת הכדאיות באמצעות סמנים תא חי/מת (איור 4B). תאים אלה הם בעיקר CD45– HUVEC פגומות במהלך השלב עיכול/השרייה, שאורכה קולגן הנדרש כדי לחלץ תאים מונוציט, נגזר מתוך מטריצת קולגן. תהליך זה היא קשה במיוחד על טפט HUVEC, אך אינה פוגעת phenotyping תאי transmigrated.
מודל זה שונה מאחרים בכך לא באופן מלאכותי חמצון השומנים אקסוגני נדרש בתקשורת תרבות נסיעה קצף נגזר מונוציט תא היווצרות. במקום זאת, קצף תא-צורה זו assay מושפעת הסרום נוכח בתקשורת תרבות, המאפשר השפעת גורמים מסיסים מדגימות קליניים דיסקרטית להערכה. ככזה, הראינו כי דגירה של שליטה ומונוציטים עם סרום נגוע ב- HIV צעיר19 או קשישים HIV-uninfected20 אנשים מקדמת את היווצרות תאי קצף, המציין כי גורמים מסיסים באופן עצמאי יכול לקדם קצף כדוריות. כפי וזמינותו מושפע על ידי מרכיבים מסיסים, אצווה בודדת של נסיוב אדם במאגר יש להשתמש עבור ניסויים שמטרתם לקבוע את ההבדל הפנימי atherogenic מאפיינים של monocytes נגזר מאנשים שונים כדי לתקנן לקבוע תנאים. Assay הזה עשוי לשמש גם כדי להעריך את התפקיד של מינים ספציפיים השומנים מדגימות קליניים (איור 3). לדוגמה, מצאנו כי דגירה של monocytes עם המדיה המכילה מינים השומנים מבודדים כגון ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה מאנשים עם תפקוד לקוי של השומנים ידוע24 גם מקדם קצף כדוריות. במקרה זה, ומונוציטים בודדים בריא או קבוצה של אנשים יכול לשמש הנוכחות של סרום או סרום גורמים נגזר מן הנבדקים. לכן, מודל זה מאפשר לשאלות ספציפיות להישאל לגבי השפעת מרכיבים מסיסים והן הסלולר דיסקרטית על היווצרות תאי קצף.
זה וזמינותו מנצל HUVEC כמודל של עורקים אנדותל בשל הקושי המעשי בקבלת מספר גדול של תאים העורק הראשי מספר מעבר נמוך. עם זאת, יש להשוות את התוצאות של מבחני באמצעות שני תאי אנדותל האנושי עורקים או HUVEC ואנו ציין הבדל קטן במערך מונוציט גלגול או קצף התא (נתונים לא מוצג), המציין השימוש HUVECs במערכת זו הוא תחליף מקובל. ספירה ידנית של תאי קצף הוא גורם מגביל במודל זה כמו זה ייתכן להטיה אופרטור. לכן, כל דוגמאות רכוב על שקופיות חייב להיות עיוור למפעיל כדי להסיר את הפוטנציאל של דעה קדומה. יש, עם זאת, בהשוואה קצף כדוריות כפי שנמדד על ידי ספירה ידנית על ידי הדמיה cytometry זרימה ואנו מצא כי השיטות נותן תוצאות דומות19. מגבלה מפתח של מודל זה הוא כי אדהזיה מונוציט, גלגול להתרחש בהיעדר כוחות גזירה הקשורים עם דם פיזיולוגיים זרימה ויוו. אנו משערים כי הזרימה הטיה ישפיעו בעיקר מונוציט גלגול ויצירת תאי קצף לא עוקבות בתוך המטריצה; עם זאת, זה יש לקחת בחשבון בעת פירוש תוצאות זה וזמינותו. Assay הזה גם לא מודל ההשפעה של תאי שריר חלק במבנה התא קצף נגזר מונוציט שהיא מגבלה פיזיולוגיות של המערכת; עם זאת, זה עקבי בכל תנאי המאפשר את הפוטנציאל atherogenic בדידה של monocytes לצורך השוואה בין מצבי מחלה שונים.
לסיכום, מודל זה מספק שיטה רב-תכליתי ורלוונטי פיזיולוגית לכימות תנועת גלגול מונוציט ויצירת תא קצף מדגימות האנושי של המחלה שונה הברית ex-vivo. מודל זה יש נוספת יישומים להערכת של הנטייה של monocytes כדי ליצור תאי קצף בתנאים שבו מונוציט atherogenicity קשורה לסיכון מוגבר של CAD כגון השמנת יתר25, סוכרת26 כליות כרונית מחלת27. לכן, מודל זה עשוי גם להיות ממוטב לשימוש במדינות המחלה מלבד טרשת עורקים איפה גלגול הסלולר עשויים להשפיע בפתוגנזה של המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים בתודה להכיר את עבודתו של פרופסור ויליאם מולר, ד ר קלייר Westhorpe שלהם תפקיד מפתח בפיתוח של חזרות קודמות של מודל זה. המחברים גם רוצה להודות AMREP Flow Cytometry הליבה עבור המיון של מונוציט קבוצות משנה ויחידת אלפרד חולים זיהומיות מחלות קליני מחקר אחיות לגיוס של HIV + בודדים על מחקרים. המחברים בתודה בתרומתן לעבודה זו של ויקטוריה תפעוליים תשתיות תמיכה התוכנית התקבל על ידי המכון ברנט. TAA נתמכת RMIT אוניברסיטת סגן-הנשיא של הבתר-דוקטורים. עבודה זו נתמכה על ידי גרנט פרוייקט NHMRC 1108792 על פועלם לקידום AJ AH. TK נתמך על-ידי NIH מעניקה NIH K08AI08272, גרנט NIH/NCATS # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
- Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
- Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
- Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038 (2016).
- Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
- Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
- Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
- Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
- Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
- Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N.
- Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
- Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
- Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
- Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).
