Summary
Descreveremos um protocolo para medir transmigração por monócitos em monocamadas endoteliais humanas e sua maturação subsequente em células de espuma. Isso fornece um método versátil para avaliar as propriedades aterogênico de monócitos isoladas de pessoas com doenças diferentes condições e avaliar fatores no sangue que pode melhorar esta propensão.
Abstract
Doença arterial coronariana (DAC) é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Aterosclerose, dos principais causa de CAD, é iniciada pela transmigração de monócitos imunes inatas para sites inflamatórias de lipídio depositado chamado estrias gordurosas, que estão presentes nas paredes arteriais de médio para grandes artérias. A principal característica patogênica de lesões nesta fase inicial da aterosclerose é a maturação dos monócitos que migram em artérias para formar células de espuma ou macrófagos carregados de lipídios. Considerável evidência suporta a hipótese de que o risco de aterosclerose é aumentado por condições inflamatórias crônicas que acompanham doenças como artrite reumatoide e HIV, bem como o envelhecimento geral, e que esse risco é predito por monócitos ativação. Enquanto rato modelos fornecem uma boa plataforma para investigar o papel dos monócitos no atherogenesis na vivo, eles exigem alteração genética do metabolismo do colesterol natural e alteração drástica de dietas de rato normal e tem limitado a sua aptidão para o estudo das influências aterogênico doenças comórbidas humana. Isto motivou-na desenvolver um modelo humano em vitro para medir o potencial aterogênico de monócitos isoladas de indivíduos com doença definidos Estados. Atualmente, modelos humanos em vitro limitando em que avaliam a formação de células transmigração e espuma monócito em isolamento. Aqui descrevemos um protocolo em que monócitos isolados do paciente sangue transmigrar através de células endoteliais humanas em uma matriz de colágeno tipo 1, e sua propensão para amadurecer-se em células de espuma na presença ou ausência de lipídios exógenos é medido. O protocolo foi validado para o uso de monócitos humanos purificado de indivíduos com infecção pelo HIV e idosos indivíduos HIV infectado. Este modelo é versátil e permite monócito transmigração e espuma formação de célula a ser avaliada usando qualquer microscopia ou citometria de fluxo, bem como permitindo a avaliação de factores aterogênico presentes no soro ou plasma.
Introduction
Transmigração de monócito é um passo crucial no desenvolvimento da placa de ateroma que pode levar à trombose, derrame e infarto do miocárdio. Ateroma desenvolve de listras gordas, geralmente presentes em locais de fluxo sanguíneo oscilatório baixo em meio às grandes artérias, onde depositada lipídica contribui para ativação endotelial e localizadas inflamação1. Os monócitos são recrutados para células endoteliais em listras gordas através de proteínas Quimiotáticos de monócitos (tais como CCL2) e transmigrar para o íntima2. Após a transmigração, monócitos podem formar macrófagos aterogênico, lipid-laden chamados espuma de células em consequência da absorção de lipídios, síntese de lipídios, para baixo-regulamento de efluxo de colesterol ou uma combinação dos fatores acima. Os monócitos também podem acumular lipídeos na circulação e têm um fenótipo 'espumoso', possivelmente predisponentes células de espuma celular formação3,4. Células de espuma são a característica definidora de listras gordas e estágios iniciais de ateroma e sua formação é influenciada pela lipídico e mediadores inflamatórios5. Alternativamente, os monócitos têm a capacidade de reverter transmigrar da artéria para a corrente sanguínea6, eliminando lipídico da íntima e agindo para manter a saúde das artérias.
Determinar a propensão dos monócitos para transmigrar através de endotélio arterial e forma as células de espuma em íntima, ou reverter transmigrar e transportar lipídios fora a placa, é um requisito-chave para compreender o papel da ativação de monócitos no aumento risco de aterosclerose. Modelos de mouse de CADs como aterosclerose são importantes na elucidação de informações em tempo real na vivo no desenvolvimento de placa aterosclerótica/raia gordurosos. No entanto, estes modelos requerem uma alteração genética do colesterol natural processamento habilidades destes animais geralmente associada a alterações drásticas na dieta (por exemplo, o modelo de dieta/ApoE-Western-tipo)7,8, desse modo, induzindo a acumulação não-fisiológica de lipídios em circulação os níveis que desenvolvimento de placa de carro. Estes modelos podem ter limitada relevância para inflamatórias humanas condições crônicas tais como a infecção pelo HIV que não estão associados com aumento níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou colesterol de circulação. Além disso, as diferenças em biologia monócito entre humanos e ratos fazem os testes imunológicos perguntas sobre a relevância de subpopulações de monócitos (tais como intermediários monócitos (CD14 ++CD16+))9 é difícil. Isto é importante quando se estudar os mecanismos de condução doença cardiovascular como contagens de monócitos intermediário independente preveem eventos cardiovasculares10,11. Enquanto os ensaios existem para medir sequencialmente de qualquer formação monócito transmigração ou espuma de célula isoladamente, sem ensaio em vitro foi validado para quantificar os dois aspectos do atherogenesis início, usando as mesmas células de coortes clínicas. Transwell modelos utilizam um sistema de duas câmaras Boyden modificado pelo qual as células são carregados na câmara superior e transmigrar através de uma barreira de plástico porosa ou monocamada de células em uma câmara inferior que normalmente contém mídia com quimiotático12 , 13. enquanto amplamente utilizado para a análise de transmigração de leucócitos, estes modelos não incorpora geralmente uma camada representando a íntima, resultando em células transmigra migrando em solução e não permitem a medição de célula de espuma formação ou reversa transmigração das mesmas células. Por outro lado, modelos de formação de célula de espuma não representam qualquer alteração induzida por transmigratory monócitos ou efeitos de ativação endotelial, que é conhecido por contribuir para a formação de célula14de espuma. Além disso, estes sistemas induzem espuma formação de células de macrófagos aderiu às placas de cultura de células através da adição de saturar as concentrações de lipoproteína de baixa densidade oxidada exógenos (RJ)15,16, um indutor de chave de formação de célula de espuma. LDL usada nestes modelos é muitas vezes oxidado por processos não fisiologicamente-relevantes como CuSO4 tratamento17, portanto, questionando a importância fisiológica de estudos usando estes modelos.
Aqui descrevemos um ensaio que quantifica a transmigração de monócitos e formação de célula de espuma das mesmas células que não requer a adição de RJ exógeno, assim, melhor modelagem o papel dos monócitos na formação de células de espuma. Este modelo foi originalmente desenvolvido pelo Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18e foi ainda mais refinado em nosso laboratório para avaliar ex vivo a caracterizações de monócitos isolados sob não-ativação condições de indivíduos com condições inflamatórias subjacentes que acompanham doenças como HIV infecção19 bem como envelhecimento20, que estão associados com um risco aumentado de aterosclerose. Este modelo também fornece uma plataforma para responder questões biológicas básicas sobre a propensão de subconjuntos diferentes monócito forma espuma células20, a influência da ativação endotelial por citocinas como TNF na formação de célula de espuma14 e as propriedades migratórias de monócitos, tais como a profundidade e a velocidade de transmigração em géis19. Além disso, formação de células de transmigração e espuma de monócito pode ser quantificada usando microscopia padrão, vive a imagem latente da pilha, citometria de fluxo imagem e citometria de fluxo, portanto, fornecendo um método versátil para avaliar o papel de monócitos em atherogenesis.
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Protocol
Nota: todos os experimentos utilizando amostras biológicas humanas foram realizados com aprovação ética do Alfred Hospital humano Comitê de ética, Melbourne. Todos os experimentos foram realizados em classe II biossegurança armários a menos que especificado. " Prewarmed " refere-se aos reagentes aquecidos a 37 ° C em banho-maria.
1. preparação do tipo I fibroso colágeno géis: dia 1
- preparar polimerizado gel de colágeno sequencialmente adicionando e misturando 35,7 mM NaOH, 0.71 x M199, 4,58 mM de ácido acético e 1,71 mg/mL colagénio tipo I fibroso em um poliestireno 5ml tubo, conforme tabela 1.
Nota: Certifique-se que o colágeno é bem misturado, pipetando suavemente e descer 5 vezes para evitar a formação de colágeno ' bolsos ' a mistura de gel. Preparar o gel de 4-6 por condição de teste para microscopia ou 15 géis por condição de teste para citometria de fluxo. - Uma vez bem misturadas, alíquota de 50 μL de mistura de gel de colágeno em cada poço de uma placa estéril cultura de tecidos de 96 poços fundo chato. Não use o exterior de linhas e colunas, mas preenchê-las com 200 µ l de 1 x Dubecco ' tampão s fosfato salino (PBS) para proteger os géis de dessecação. Incubar as placas a 37 °C/5% CO 2 por 2 h permitir que o colágeno polimerizar.
Nota: Coloque as placas diretamente nas prateleiras de metal limpa na incubadora para garantir a distribuição de calor mesmo. - Após a incubação, sobrepor os géis com 150 µ l de 1 x M199 completados (ver Tabela de materiais) e incube por 5 dias até o uso.
2. Expansão de armazenados HUVEC: 1 dia
- rótulo e casaco um diâmetro de 10 cm de Petri com 1 mL de 50 µ g/mL de fibronectina diluído em 1X PBS e incubam à temperatura ambiente durante 10 min.
- Thaw alíquotas de umbilical humana primária criopreservado veia células endoteliais (HUVEC, 1,0 x 10 6 células) em 10 mL M20.
Nota: HUVEC deve ser preparado como descrito anteriormente a 21 e usado em um número de passagem baixa (< passagem 4). HUVEC pode ser substituído por células endoteliais coronarianas humana aqui. - Resuspenda HUVEC M20 de 10 ml e adicionar ao prato revestido de fibronectina, por aspiração de fibronectina em excesso antes da adição de células e a cultura de confluência (cerca de 5 dias), substituindo os meios de comunicação no dia 3.
3. Cultivo HUVEC monocamada em gel de colágeno: dia 5
- no dia 5, desanexar HUVEC aspirar o sobrenadante do prato de Petri de cultura e lavando afastado mídia contendo soro com 10 mL de soro livre M199.
- Adicionar 5 mL 0,05% tripsina/0,53 EDTA in M199 HUVEC e incubar durante 1-2 min à temperatura ambiente, agitando suavemente até que as células desanexar.
- Uma vez separada, rapidamente lave o tubo de ensaio com 5 mL M20 e transferir a mídia contendo células para um tubo de 10 mL.
- Amostras de centrifugação a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante, Ressuspender as células em 200 µ l de M20 e contar células usando um hemocytometer.
- Ressuspender as células para 2,0 x 10 5 células/mL em M20, aspirar o M199 sobre o gel da placa de 96 poços (etapa 1.3) e adicionar 100 µ l de ressuspensão HUVEC (2,0 x 10 4 células) para cada gel de colágeno preparado acima (etapa 1.2). Placas de cultura por mais 3 dias a 37 °C/5% CO 2.
Nota: A integridade da monocamada HUVEC pode ser confirmada depois de 3 dias por nitrato de prata coloração 22 ou imuno-histoquímica para junção apertada proteínas 23 nesta fase. Géis adicionais devem estar preparados para essa finalidade.
4. Ativação de HUVEC monocamada e isolamento/ativação de monócitos para transmigração: dia 8
- no dia 8, ativar cada monocamada HUVEC antes da adição de monócitos aspirando o M20 mídia sobrepondo os géis e adicionar 100 µ l de 10 ng/mL TNFa humana em M20 por gel. Incubar a 37 °C/5% de CO 2 para 4 h.
Nota: As condições não está ativado HUVEC podem também ser incluídas se necessário como controles.
Técnicas para selecionar negativamente para as células de acordo com o fabricante de esferas de monócitos - durante o 4 h HUVEC etapa da ativação, isolada de PBMC usando magnético ' instruções s. Um mínimo de 6,5 x 10 6 PBMCs deve ser usado nesta etapa para recuperar confiantemente 3.0 x 10 5 monócitos, necessários para uma condição, como os monócitos normalmente representam aproximadamente 10-15% de PBMC.
Nota: Para avaliar o efeito da ativação de monócitos, antes da formação de células de transmigração e espuma de monócitos, monócitos podem ser ativados nesta fase. Os monócitos podem ser isolados de PBMC descongelado se necessário (ou seja, as amostras de pacientes armazenadas). Subconjuntos de monócitos isolados por FACS classificação podem ser preparados por adição de géis (Figura 1).
5. Transmigração de monócitos humanos primários: dia 8
- para medir a transmigração de monócitos, remover mídia contendo TNFa e lave o gel duas vezes com 100 µ l M199 adicionando e removendo mídia. Lavagem, a seguir adicionar 2,0 x 10 5 recém isoladas ou descongelado e lavado criopreservado PBMCs ou 5.0 x 10 4 recentemente isolados de monócitos ou purificado subconjuntos de monócitos de monocamadas HUVEC em 100 µ l M20. Incube durante 1 h a 37 ° C e 5% CO 2 para permitir a transmigração para a frente de monócitos no gel. É melhor permitir que 6 poços para cada condição experimental examinados.
Nota: Para avaliar o efeito do soro autólogo na formação de células de transmigração e espuma, incubar as células com M20 contendo a concentração desejada de soro inativado por calor e comparar com as condições com um controle em pool de soro humano. Leucócitos, além de monócitos podem ser adicionados nesta fase. Se investigar o impacto da espécie de lípidos/lipídios específicos (por exemplo, HDL, oxHDL), executar todas as etapas seguintes com mídia livre de soro contendo lipídios de 20-50 µ g/mL. - Após 1 h de transmigração para diante, coletar as células não-transmigra lavando gel duas vezes com 100 µ l de 1mm escaldada EGTA em PBS 1x e uma vez com 100 µ l M199 (mesma Centrifugue condições), reunindo os sobrenadantes de cada poço do mesmo condição experimental (geralmente 6 poços) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL no gelo. Centrifugar as células não transmigra a 4 ° C, 300 x g durante 5 min e Resuspenda em 30 µ l 1X PBS.
- Contar as células coletadas no sobrenadante para determinar o número de células transmigra para diante.
- a percentagem de células transmigra para a frente é determinado como segue:
- cobrir o lavado géis contendo células transmigra com 100 µ l M20 e incube por um mais h. 48
- Após 48 h, recolher o sobrenadante e células não-transmigra de lavar duas vezes com 100 µ l pré-aquecido 1mm EGTA/PBS, recolha e partilha o sobrenadante de cada condição como na etapa 5.2.
Nota: O fenótipo das células transmigra reversos pode ser ensaiado com estas células fcitometria de fluxo padrão seguindo protocolos de coloração. - Centrífuga células a 4 ° C, 300 x g durante 5 min e ressuspender as células em 30 µ l 1X PBS. Contar as células e determinar a viabilidade através de coloração azul trypan.
- Determinar a percentagem de células transmigra inversa usando a seguinte equação:
Nota: contabilidade para o número total de células transmigra para frente dá uma indicação mais precisa de transmigração reversa como é improvável transmigração direta será 100%. - Para análise por microscopia, corrigir os géis adicionando formol de 2% 100 µ l (concentração final) para cada poço, cobrir as placas em alumínio da folha e armazenar a 4 ° C até análise. Por citometria de fluxo, não corrigi as células nesta fase. Consulte os protocolos abaixo para microscopia (secção 6) ou análise de fluxo cytometry (secção 7).
Atenção: O formaldeído é tóxico e corrosivo; Use equipamentos de proteção individual (EPI). Tenha cuidado ao adicionar formol, no entanto, esta etapa não precisa ser executada em uma coifa devido a baixa concentração utilizada.
6. Quantificação de células de espuma e macrófagos pela microscopia (óleo-vermelho O Stain)
- remover o formaldeído e lavar os géis com 100 µ l de metanol a 50% (v/v) por 5 min e depois 100 µ l 78% (v/v) metanol durante 15 min.
Nota: As coloração etapas podem ser executadas na bancada do laboratório e não em um gabinete de classe II Biohazard. - Mancha para gotículas lipídicas por adicionar 100 µ l de acabadas 0,2% (p/v) O óleo-vermelho (consulte a Tabela de materiais para obter detalhes) por 1h à temperatura ambiente.
- Remover a mancha excesso lavando os géis 4 vezes com 100 µ l de metanol de 78% (v/v), aspiração e descartar o sobrenadante após cada lavagem.
- Counterstain para 15 min à temperatura ambiente com 100 µ l de Giemsa, diluído 01:10 em água destilada.
- Aspire a mancha de Giemsa e lave o gel uma vez com água.
- Para desanexar os geles da placa, a borda dos poços, usando uma agulha 21G, com o bisel voltado para fora, ao redor da borda do gel.
- Para montar o gel em uma corrediça do microscópio, fazem dois furos (6,35 mm de diâmetro) em uma tira de 2,54 cm x 1,5 cm de fita dupla-face. Fixe a fita para um lado do microscópio padrão e remover a camada protetora da parte superior.
- Adicionar uma gota de água para os orifícios na fita usando uma pipeta de transferência. Usando uma pinça, gentilmente transferi géis para os orifícios na fita e cobrir com uma lamela de vidro 1,5 de tamanho. Pressione suavemente a lamela para aderem à fita.
- Examine com microscopia de campo claro contraste interferência diferencial usando 40 objectivo de X em um microscópio invertido.
- Trazer a monocamada HUVEC em foco em 40 X ampliação e rolagem ' em ' o gel, contagem de células de macrófagos/espuma ao longo de toda a profundidade do gel. Repita por três distintas campos de vista localizada a uma distância similar da borda do gel para minimizar possíveis efeitos de borda. Isso garantirá que gel de profundidade é consistente entre as regiões de contagem.
Nota: Marcar células no gel como células de espuma (definidas como células contendo > 1/3 de seu citoplasma, como O óleo-vermelho manchado gotículas lipídicas) ou macrófagos até 2 horas de montagem em lâminas ( Figura 2). Formação de célula de espuma é expresso como a porcentagem de células de espuma em relação ao número total de células migradas e é expresso como as contagens de mediana em 3 campos de visão examinaram para 6 géis por condição, portanto, uma mediana de 18 medições por condição. Um exemplo da contagem de células cru de um experimento típico é mostrado na tabela 2.
Nota: Classificando uma célula como um macrófago de vs de célula de espuma por microscopia é subjetivo e, consequentemente, pode ser dependente do investigador. Em estudos clínicos, onde são realizados experimentos durante um período prolongado de tempo, é importante para a contagem de todos ser executada cegado por um único investigador. Exemplos de células de espuma e macrófagos em géis são fornecidos na Figura 2.
- Trazer a monocamada HUVEC em foco em 40 X ampliação e rolagem ' em ' o gel, contagem de células de macrófagos/espuma ao longo de toda a profundidade do gel. Repita por três distintas campos de vista localizada a uma distância similar da borda do gel para minimizar possíveis efeitos de borda. Isso garantirá que gel de profundidade é consistente entre as regiões de contagem.
7. Análise de células transmigra por citometria de fluxo
- para fenotipicamente caracterizar células de espuma e após transendothelial migração de macrófagos, digerem os géis adicionando-se 100 µ l de 1 mg/mL de 37 ° C pré-aquecido colagenase D diluído em M199 para cada um bem e incubar durante 20 min a 37 °C/5% CO 2.
Nota: Coloque as placas de 96 poços diretamente nas prateleiras de metal limpa na incubadora para garantir a distribuição de calor mesmo. - Após a incubação, macerar os géis usando uma ponta de pipeta de 200 µ l e incubar por um adicional de 20 min a 37 °C/5% CO 2.
- Uma vez totalmente digerido, filtro e piscina os digerido géis replicar através de 35 µm de nylon malha tampados tubos de FACS colocados no gelo e lave uma vez com FACS lavar (veja a tabela dos materiais) a 4 ° C, 300 g de x. Ressuspender as células em 100 µ l de FACS Wash.
- Incubar as células resultantes com fluoróforo conjugado anticorpos específicos para CD45, um marcador de célula viva/morta e superfície/intracelular marcadores fenotípicos ou funcionais de interesse usando protocolos de citometria de fluxo padrão.
Nota: Preparar controle tubos para compensação usando o apropriado fluorophores e contas de compensação do Ig. Extraído de células também podem ser recolhidas em lâminas de vidro para microscopia de imunofluorescência por cytospinning. Alternativamente, nós recolhemos com sucesso células usando esse protocolo para avaliação através de citometria de fluxo de imagem. - Adquirir células usando um citômetro de fluxo e realizar a compensação conforme necessário.
Nota: Como células de espuma/macrófagos não podem formar populações individuais usando as propriedades de dispersão de luz e podem diferir consideravelmente em tamanho e forma, definir scatter frente liberal (FSC) e portões de dispersão (CCD) de lado a fim de capturar todas as células migradas, conforme mostrado no < classe forte = "xfig" > figura 3A. - Após aquisição, realizar a análise de dados utilizando o software de citometria de fluxo. Para identificar células migradas, primeiro selecione as células como negativa para o marcador de mortos/viver como mostrado na Figura 3B. Em seguida, executar uma discriminação de célula única, criando um portão apertado ao redor das células mostrado uma trama vs CCD-altura do SSC-área.
- Selecione CD45 + células e portão grande população de células migradas presentes em uma trama FSC/SSC como estas são as células de macrófagos/espuma.
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Representative Results
Quantificar a transmigração de monócito
Os monócitos são adicionados ao modelo conforme descrito na Figura 1, e seis géis preparam-se para cada condição. Monócitos para 6 géis por doador (ou seja, 5,0 x 104 monócitos por gel gel 6 = 3,0 x 105 monócitos por doador) são resuspended para um volume final de 600 µ l de M199 mídia contendo os lipídios necessário soro/isolado. Células (ou seja, 100 µ l por gel = 5,0 x 104 monócitos) são então aliquotadas para géis e incubadas como acima por 1h facilitar a transmigração de monócitos. Após a transmigração, células não transmigra são contadas como acima. Neste exemplo, 1,5 x 104 não transmigra células foram recuperados. A porcentagem de transmigração direta foi determinada utilizando as fórmulas descritas no passo 5.4:
Após 48 h de incubação, 3.6 x 104 inversa transmigra células foram recuperados como acima. A porcentagem de transmigração reversa foi determinada utilizando a fórmula na etapa 5.8:
Transmigração de frente e verso pode ser comparada entre condições usando os testes estatísticos adequados e monócitos preparados a partir de vários doadores independentes para determinar se a capacidade de transmigração de monócitos é alterada entre experimental condições.
Avaliar a formação de células de espuma
Microscopia de brightfield
Lipoproteínas oxidadas são conhecidas por promover derivados de monócitos espuma celular formação em vitro em comparação com lipídios não oxidadas15. Aqui podemos confirmar que o tratamento de monócitos com RJ, comumente usado para induzir a formação de célula de espuma em modelos de indução de células espuma convencional, aumenta a formação de célula de espuma derivados de monócitos neste modelo de formação de células de migração e espuma de transendothelial em comparação com LDL nativa. Após formação de célula transmigração e espuma monócito em géis incubados com M199 contendo 50 µ g/mL nativo ou CuSO4-oxidado o LDL (consulte a etapa 5.1, Figura 1), as células foram analisadas por microscopia. Exemplos de células de espuma e macrófagos observados em experimentos representativos são mostrados na Figura 2. As células foram contadas em três campos diferentes por gel, concentrando-se na monocamada HUVEC e progressivamente concentrando-se mais profundo no gel. A contagem de células é registradas para cada doador, conforme mostrado na tabela 2 para um único doador, para comparar a percentagem de células de espuma formada em resposta a oxidado e LDL nativa. Agregar dados de n = 12 contagens independentes são mostradas na Figura 4 para confirmar que a incubação de monócitos com RJ neste modelo induz formação de célula de espuma mais do que condições onde os monócitos são incubados com mídia de LDL ou M199 nativa sozinha.
Citometria de fluxo
Para determinar o fenótipo das células migradas, as células são extraídas de géis digeridos e rotuladas utilizando um painel de citometria de fluxo padrão. As células foram rotuladas com um marcador de célula viva/morta e anticorpos específicas para CD45 e outros marcadores de superfície fenótipo usando protocolos de citometria de fluxo padrão. Controles de compensação devem ser também preparadas para compensação integral conforme técnicas de citometria de fluxo padrão. Células migradas são bloqueadas como mostrado na Figura 3 , em parcelas representativas de 10 experimentos independentes. Células vivas são bloqueadas usando ensaios de viabilidade celular vivo/morto (Figura 3B) e parelhas são excluídas pela análise única célula (Figura 3). As células são então fechadas como CD45+ a fim de excluir HUVEC (como estas células são CD45-, Figura 3D). A grande população é então fechada por discriminação de dispersão de dispersão para a frente/lateral (Figura 3E) e a intensidade de fluorescência média (IFM) dos receptores de interesse são determinadas em comparação com qualquer fluorescência menos um (FMO) ou isotipo controle ( Figura 3F) para determinar a expressão (ΔMFI) ou a porcentagem de células positivas.
Figura 1 : Um em vitro modelo de formação de células de transmigração e espuma de monócito. PBMC (A), (B) monócitos totais ou subconjuntos de monócitos FACS-classificados (C) são adicionados ao fibroso colágeno tipo I géis formados em placas de 96 poços e revestida com uma monocamada de umbilical humano primário ativado veia de células endoteliais (HUVEC), cuja integridade pode ser avaliada por prata coloração (D) e permitiu a (E) transmigrar para 1h na presença de soro ou lipídios que contém a mídia. Contam-se as células não-transmigra (F) e géis são incubados por um mais 48 h com o mesmo soro/lipídios que contém a mídia. Após a incubação, (G) células migradas reversos são contadas e a percentagem de células de espuma vs macrófagos no gel é determinada pelo (H) microscópio de contraste de fase após coloração com O óleo-vermelho ou o fenótipo de células migradas é determinado pelo (eu) citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Exemplos de células de espuma e macrófagos em um em vitro modelo de formação de células de transmigração e espuma de monócito. RepresentatIve exemplos de células contabilizadas como espuma de células (setas brancas) e macrófagos (setas pretas) após a coloração para visualizar as células e O óleo-vermelho coloração de Giemsa Visualizar gotículas lipídicas, conforme determinado pelo microscópio de contraste de fase de géis extraídos usando um invertido microscópio ampliação de 40 X. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Gating estratégia de transmigra de células por citometria de fluxo. Células transmigra são fenotipicamente caracterizadas por citometria de fluxo após a extração de células de géis. As células são bloqueadas pelo (A) FSC/SSC, células vivas (B), (C) células únicas, CD45 (D)+, (E) FSC/SSC e (F) a expressão do receptor em relação ao isotipo ou fluorescência menos um controle (FMO). Expressão dos receptores de interesse são definidas como a intensidade de fluorescência média (IFM) e expresso em relação a níveis de isotipo. ΔMFI = mancha (IFM) menos controle isotipo/FMO (IFM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Efeito de forma exógena adicionado RJ e LDL na formação de célula de espuma derivados de monócitos. Formação de célula de espuma é determinada sob condições onde monócitos de um único doador são incubados com mídia (M199) ou 50 µ g/mL sua lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou sulfato de cobre (II) oxidada LDL (RJ), adicionado ao post-transmigração de géis. Contagens de 12 locais distintos são mostradas. Células de espuma são expressos como a percentagem de células migradas totais. Intervalos de medianos e percentis são mostrados na barra de gráficos e comparações foram feitas através de testes não-paramétricos Mann-Whitney U. p < 0.001, * * * p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | [Estoque] | [Final] | Volume para 60 geles (µ l) |
| NaOH | 100 mM | 35,7 mM | 1071 |
| M199 | 10 x | x 0,71 | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4,58 mM | 687 |
| Colagénio | 5 mg/mL | 1,71 mg/mL | 1029 |
| Volume total | - | - | 3000 |
Tabela 1: Tipo I preparação do gel de colágeno fibroso
| LDL | RJ | |||||||
| Gel de | Contagem | Espuma de células1 | Células migradas1 | Espuma de células (%)2 | Espuma de células1 | Células migradas1 | Espuma de células (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47,3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18.5 | 10 | 23 | 43,5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21.2 | 19 | 39 | 48,7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14,7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58,2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13.5 | 19 | 37 | 51,4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53.8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 11 | 31 | 35,5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18,4 | 28 | 53 | 52,8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20.5 | 14 | 33 | 42,4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 22 | 47 | 46,8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36,7 | ||
| Células de espuma mediana (%) | 20,8 | 47 | ||||||
| Células de espuma média (%) | 19,8 | 45.5 | ||||||
Tabela 2: célula Raw conta de comparação das células de espuma derivados de monócitos após tratamentos de RJ vs LDL. 1 Contagens por campo de visão em gel de células. 2 Percentagem de células de espuma = espuma de célula contagens/total migrado outra conta x 100. * Dados são representativos de um experimento usando monócitos de um único doador
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Discussion
O protocolo descrito aqui oferece um método versátil e fisiologicamente relevante para avaliar as caracterizações de monócitos de coortes clínicos humanos, combinando ambos transmigração de monócitos e formação de célula de espuma. Este modelo oferece vantagens sobre métodos alternativos de formação de célula de espuma, pois leva em consideração o efeito da transmigração de monócitos na formação de célula de espuma e permite a medição da transmigração reversa6 além da inerente propensão de monócitos para amadurecer-se em células de espuma na presença ou ausência de fatores exógenos. Além disso, o papel de ativação endotelial também é levado em conta como mostramos essa oxidação de upregulates ativação endotelial das espécies de lipídios que está associados com espuma celular formação14. Finalmente, o fenótipo de monócitos que passam por saída (uma propriedade associada a regressão da placa) pode ser quantificado e caracterizado por citometria de fluxo e microscopia.
Devido à natureza tridimensional da transmigração em géis, identificando e marcando as células transmigrated como células de espuma ou macrófagos podem ser difícil como células transmigrar aos diferentes níveis em gel de19. Para auxiliar a identificação das células de espuma, mancha de óleo-vermelho O fresca deve ser sempre. É também digno de nota que diferentes ex vivo Estados de doença ou em vitro condições podem alterar a transmigração de monócitos no gel. Nós usamos célula viva de imagem para identificar que os monócitos de indivíduos infectados pelo HIV tendem a transmigrar para pontos mais rasos em géis e velocidades diferentes do que os de indivíduos não infectados19. Além disso, a formação de célula de espuma está associada com menos motilidade de monócitos no gel por células tendem a se mover em círculos em uma determinada seção de z em comparação com as células de indivíduos infectados por HIV que tendem a migrar em uma linha relativamente reta em direção a fundo do gel. Esses achados levantem a possibilidade de um fenômeno semelhante, ocorrendo em experimentos usando amostras de pacientes humanas de outros Estados de doença associados com caracterizações de aumento de monócitos.
Ao realizar as análises baseadas em citometria de fluxo é comum observar uma proporção significativa de células mortas na população celular recuperado ao avaliar a viabilidade usando marcadores de célula viva/morta (Figura 4B). Estas células são predominantemente CD45– HUVEC que são danificados durante a etapa de digestão/maceração de colagénio necessário para extrair células monocito-derivada da matriz de colágeno. Este processo é particularmente duro com a monocamada HUVEC, mas não é prejudicial para fenotipagem das células transmigrated.
Este modelo difere de outros em que não lipídios exógenos artificialmente oxidado é necessário os meios de cultura para a formação de células de espuma monócito-derivado de carro. Em vez disso, a formação de célula de espuma neste ensaio é influenciada pelo soro presente em meios de cultura, permitindo os efeitos discretos de fatores solúveis de amostras clínicas para ser avaliada. Como tal, temos mostrado que a incubação de monócitos controle com soro de jovens infectados pelo HIV19 ou idosos, indivíduos HIV-infectados20 promove formação de célula de espuma, indicando que fatores solúveis independentemente podem promover a espuma formação de células. Como o ensaio é influenciado por componentes solúveis, um único lote de soro humano em pool deve ser usado para experiências destinadas a determinar a diferença inerente de aterogênico Propriedades de monócitos derivados de indivíduos diferentes a fim de padronizar condições de controle. Este ensaio também pode ser usado para avaliar o papel das espécies de lipídios específicos de amostras clínicas (Figura 3). Por exemplo, encontramos a incubação de monócitos com mídia contendo espécies isoladas de lipídios, tais como lipoproteínas de alta densidade de indivíduos com disfunção de lipídios conhecidos24 também promove a formação de células de espuma. Neste caso, os monócitos a partir de um único indivíduo saudável ou grupo de indivíduos podem ser usados na presença de soro ou fatores de soro derivados de cobaias. Portanto, este modelo permite específicas perguntas a serem feitas a respeito dos efeitos discretos de componentes solúveis e celulares na formação de células de espuma.
Este ensaio utiliza HUVEC como um modelo do endotélio arterial coronariana devido à dificuldade prática na obtenção de um grande número de células de revascularização primária números passagem baixa. No entanto, temos comparado os resultados de ensaios, usando ambas as células endoteliais coronarianas humana ou HUVEC e observada pequena diferença na monócito transmigração ou espuma de célula formação (dados não mostrados), indicando que o uso de HX neste sistema é um substituto aceitável. Manual de contagem de células de espuma é um fator limitante neste modelo como ele pode introduzir o viés de operador. Portanto, todas as amostras, montadas em lâminas devem ficar cego para o operador a fim de remover o potencial de viés. Nós, no entanto, em comparação a formação de célula de espuma, medida pela contagem manual e por citometria de fluxo da imagem latente e encontramos que estes métodos dar semelhantes resultados19. Uma limitação fundamental deste modelo é que a transmigração e adesão de monócitos ocorrem na ausência de forças de cisalhamento associado com sangue fisiológico fluxo na vivo. Nós hypothesize que fluxo de cisalhamento predominantemente afetará transmigração de monócitos e formação de célula de espuma não subsequentes dentro da matriz; no entanto, esta deve ser considerada ao interpretar os resultados do presente ensaio. Este ensaio também não modelo a influência de células musculares lisas na formação de células de monócitos-derivado da espuma que é uma limitação fisiológica do sistema; no entanto, este é consistente em todas as condições, permitindo que o potencial aterogênico discreto de monócitos a comparação entre diferentes doenças.
Em resumo, este modelo oferece um método versátil e fisiologicamente relevante para quantificar a transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de amostras humanas na doença diferentes Estados ex vivo. Este modelo tem ainda mais aplicações para avaliar a propensão dos monócitos para formar células de espuma em condições onde caracterizações de monócitos é associada com um risco aumentado de CAD como obesidade25, diabetes26 e renal crônica doença27. Portanto, este modelo também pode ser otimizado para uso em Estados da doença, além de aterosclerose, onde transmigração celular pode influenciar a patogênese da doença.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores, com gratidão, reconhecer o trabalho do Prof William Muller e Dr. Clare Westhorpe para seu papel-chave no desenvolvimento de iterações anteriores deste modelo. Os autores também gostaria de agradecer o núcleo de citometria de fluxo AMREP para a classificação de monócitos subconjuntos e Alfred Hospital infecciosa doença unidade clínica enfermeiras para o recrutamento de indivíduos HIV + para alguns estudos de investigação. Os autores reconhecem com gratidão a contribuição para este trabalho o programa de apoio, Victoria, de operacional infra-estrutura recebido pelo Instituto de Burnet. TAA é suportado por um RMIT University Vice-Chanceler do Postdoctoral Fellowship. Este trabalho foi apoiado pela concessão de projeto NHMRC 1108792 atribuído a AJ e AH. TK é suportado pelo NIH concede NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
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