Summary
Мы описываем протокол измерения трансмиграции, моноциты через человека эндотелиальной монослои и их последующее созревания в пены клетки. Это предоставляет универсальный метод для оценки свойства атерогенные моноцитов, изолирован от людей с различными заболеваниями и для оценки факторов в крови, которые могут усилить эту склонность.
Abstract
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Атеросклероз, ведущей причиной CAD, инициируется трансмиграции врожденной иммунной моноциты воспалительных сайты хранение липидов, называемые жирные полосы, которые присутствуют в артериальной стен средних до крупных артерий. Ключевой особенностью патогенных поражений на этой ранней стадии атеросклероза является созревания моноцитов, которые мигрируют в артерии образуют пены клетки или липидов Ладена макрофагов. Значительные доказательства подтверждают гипотезу о том, что риск атеросклероза увеличивается на хронических воспалительных заболеваний, сопутствующих заболеваний, таких как ревматоидный артрит и ВИЧ, а также общего старения, и что этот риск предсказано Моноцит активации. В то время как мыши модели обеспечивают хорошую платформу для изучения роли моноцитов в атерогенеза в естественных условиях, они требуют генетического изменения метаболизма природных холестерина и радикальные изменения диеты нормальные мыши и имеют ограниченную пригодность для изучение атерогенные влияния человека коморбидных заболеваний. Это побудило нас разработать модель человека в пробирке для измерения атерогенный потенциал моноцитов, изолирован от людей с определенными заболеваниями. В настоящее время человека в vitro модели ограничения в том, что они оценивают Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования в изоляции. Здесь мы описываем протокол, в котором моноцитов, изолированных от крови пациента высыпками через эндотелиальные клетки человека в матрицу коллаген типа 1, и их склонность к перерастет пены клетки в наличие или отсутствие экзогенных липидов измеряется. Протокол был утвержден для использования человеческого моноцитов, очищенного от лиц с ВИЧ-инфекцией и пожилых ВИЧ неинфицированных лиц. Эта модель универсальна и позволяет Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования должны оцениваться с помощью либо микроскопии или проточной цитометрии, а также позволяет Оценка атерогенных факторов в сыворотке или плазме.
Introduction
Моноцит переселение представляет собой решающий шаг в развитии атеросклеротических бляшек, что может привести к тромбоз, инсульта и инфаркта миокарда. Атеросклеротические бляшки развиваются из жирных разводов, обычно присутствующих на участках низкой колебательной кровотока в среде крупных артерий, где осаждаются липидов способствует активации эндотелиальной и локализованные воспаление1. Моноциты набираются на эндотелиальных клеток в жирных полосы через Моноцит эозинофилов белков (например, CCL2) и высыпками интимы2. После переселения Моноциты образуют атерогенные, липидов Ладена макрофагов, называемые пены клетки вследствие поглощения липидов, синтез липидов, вниз регулирование измеряем холестерина или сочетание вышеуказанных факторов. Моноциты может также накапливают липиды в циркуляции и имеют «пенистый» фенотип, возможно предрасполагающие клетки для пены клетки формирования3,4. Пена клетки являются характерной чертой жирных разводов и ранней стадии атеросклеротических бляшек и их формирования находится под влиянием липидов и воспалительных медиаторов5. Кроме того, моноциты имеют возможность обратить вспять высыпками из артерии в кровоток6, тем самым удаляя липидов из интима и Исполняющий обязанности для поддержания здоровья артерии.
Определение склонности моноцитов к высыпками через артериальной эндотелия и формы пены клеток интимы, или вспять высыпками и нести липидов из доски, является ключевым требованием для понимания роли Моноцит активации в повышении атеросклеротические риска. В выяснения реального времени в естественных условиях информацию о жирных полоска/атеросклеротической бляшки развития важны мыши модели САПР как атеросклероз. Однако эти модели требуют генетического изменения природных холестерина, обработки способности этих животных, обычно в сочетании с радикальные изменения в диете (например, модель диета ароЕ / Западной типа)7,8, тем самым, склонение-физиологические накопления оборотных липидов уровней развития зубного налета диск. Эти модели могут быть лишь ограниченные отношение к хронической человека воспалительных например ВИЧ-инфекции, не связанные с увеличение циркулирующих холестерина и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) уровнях. Кроме того, различия в биологии Моноцит людей и мышей сделать тестирование иммунологического вопросы относительно актуальности субпопуляций моноцитов (таких как промежуточные моноцитов (CD14++окрашенных CD16 ++))9 трудно. Это имеет важное значение при изучении механизмов вождения сердечно-сосудистых заболеваний, как промежуточные Моноцит рассчитывает самостоятельно прогнозировать сердечно-сосудистых событий10,11. Хотя анализов существуют последовательно измерить либо формирование клеток Моноцит переселения или пены в изоляции, не в vitro пробирного протестирована для количественной оценки обоих аспектов раннего атерогенеза, используя те же клетки от клинических когорты. Transwell модели используют модифицированную систему двухпалатного Бойден которой клетки загружаются в верхней камере и высыпками через пористые Пластиковый барьер или монослоя клеток в нижней палате, которая обычно содержит носитель с хемотаксического12 , 13. Хотя широко используется для анализа лейкоцита трансмиграции, эти модели обычно не включают слой, представляющий интима, что приводит к переселенных клетки мигрируют в раствор и не позволяют для измерения ячейки пены формирование или обратного переселения тех же ячейках. И наоборот модели формирования клеток пены не учитывают transmigratory индуцированных изменений моноциты или эффекты эндотелиальной активации, который известен вносить пены клетки формирования14. Кроме того, эти системы вызывают пены формирования клеток от макрофагов придерживаться пластины культуры клеток путем добавления насыщения концентраций экзогенного окисленного липопротеинов низкой плотности (oxLDL)15,16, ключевых индуктор формирования клеток пены. ЛПНП, используемые в этих моделях часто окисляется, не физиологически соответствующих процессов, таких как CuSO4 лечения17, таким образом, допрос Физиологическая важность исследований с использованием этих моделей.
Здесь мы описываем assay который измеряет Моноцит трансмиграции и образование пены клетки же клеток, которая не требуют добавления внешних oxLDL, таким образом лучше моделирования роли моноцитов в формировании клеток пены. Эта модель была первоначально разработана профессор Уильям Muller (Северо-Западный университет, Чикаго)18и уточнены в нашей лаборатории для оценки ex vivo атерогенности моноцитов, изолированные под не Активация условия от лица с базовой воспалительных заболеваний, сопутствующих заболеваний, таких как ВИЧ инфекции19 , а также старения20, которые связаны с повышенным риском развития атеросклероза. Эта модель также предоставляет платформу для ответа на основные биологические вопросы относительно склонность различных Моноцит подмножеств формы пены клетки20, влияние эндотелиальной активации цитокинов, таких как ФНО на образование пены клетки14 и мигрирующих свойств моноцитов, такие как глубина и скорость переселения в гели19. Кроме того Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования могут быть количественно с помощью стандартных микроскопии, живут клеток, поток цитометрии и изображений проточной цитометрии, таким образом, предоставляя универсальный метод для оценки роли моноцитов в атерогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: все эксперименты с использованием человеческого биологические образцы были выполнены с одобрения этики от человека Комитет этики Альфред больницы, Мельбурн. Все эксперименты были проведены в шкафы биологической безопасности II класса, если не указано. " Prewarmed " относится к реагентов, разогретую до 37 ° C в капилляре.
1. Подготовка типа I волокнистый коллаген гели: 1 день
- подготовить полимеризуется коллагеновые гели, последовательно добавляя и смешивания 35,7 мм NaOH, 0,71 x M199, 4.58 мм уксусной кислоты и 1.71 мг/мл тип I волокнистый коллаген в 5 мл полистирола трубка согласно таблице 1.
Примечание: Убедитесь, что коллаген перемешанных, нежно закупорить вверх и вниз 5 раз для того чтобы остановить формирование коллагена ' карманы ' в смеси геля. Подготовка 4-6 гели на условие теста для микроскопии или 15 гели на условие теста для проточной цитометрии. - Раз хорошо смешанных, аликвота 50 мкл смесь гель коллагена в каждой скважине стерильные плоскодонной культуры ткани 96-луночных плиты. Не используйте вне строк и столбцов, но заполнить их с 200 мкл 1 x Dubecco ' s фосфат буфер солевой раствор (PBS) для защиты Гели от высыхания. Инкубировать пластины на 37 °C/5% CO 2 2 h разрешить коллагена для полимеризации.
Примечание: Поместите пластины прямо на чистые металлические стеллажи в инкубаторе обеспечить равномерное распределение тепла. - После инкубации, наложение гели с 150 мкл 1 x дополнениями M199 (см. Таблицу материалы) и инкубировать в течение 5 дней до использования и.
2. Расширение хранимые HUVEC: 1 день
- метку и пальто диаметром 10 см Петри с 1 мл 50 мкг/мл фибронектин разводят в 1 x PBS и инкубации при комнатной температуре на 10 мин
- Оттепель аликвоты криоконсервированных первичного человека пупочной вены эндотелиальных клеток (1,0 x 10 6 клеток HUVEC) в 10 мл M20.
Примечание: HUVEC должны подготавливаться как описано ранее 21 и используется ряд низкий проход (< проход 4). HUVEC могут быть заменены эндотелиальных клеток человека коронарной артерии здесь. - Ресуспензируйте HUVEC в 10 мл M20 и добавить фибронектин покрытием блюдо, аспирационных избыток фибронектина до того клетки, и культуры до слияния (примерно 5 дней), заменив СМИ на день 3.
3. Культивирование HUVEC монослоя на коллагеновые гели: день 5
- на 5 день, отсоединить HUVEC аспирационных культуры супернатанта от Петри и вымывание сыворотки содержащих СМИ с 10 мл сыворотки бесплатно M199.
- Добавить 5 мл 0,05% трипсина/0.53 ЭДТА в M199 HUVEC и инкубировать для 1-2 мин при комнатной температуре, пожимая мягко, пока клетки и.
- После отсоединения, быстро промойте Петри с 5 мл M20 и передачи средств массовой информации, содержащие клетки тюбик 10 мл.
- Образцы центрифуги на 300 g x 5 мин при комнатной температуре, аспирационная супернатанта, Ресуспензируйте клетки в 200 мкл M20 и подсчитать ячейки с помощью Горяева.
- Ресуспензируйте клетки 2.0 x 10 5 клеток/мл в M20, аспирационная M199 на гелях от 96-луночных пластины (шаг 1.3) и 100 мкл ресуспензированы HUVEC (2,0 х 10 4 клетки) для каждого гель коллагена, подготовленный выше (шаг 1.2). Культура пластины еще 3 дней на 37 °C/5% CO 2.
Примечание: Целостность HUVEC монослоя может быть подтвержден после 3 дней нитрата серебра, окрашивание 22 или иммуногистохимия для жесткой перехода белки 23 на данном этапе. Дополнительные гели должны быть готовы для этой цели.
4. Активация HUVEC монослоя и изоляции/активации моноцитов для переселения: день 8
- на 8 день, активировать каждый HUVEC монослоя перед добавлением моноцитов, аспирационных M20 СМИ наложение гели и добавлением 100 мкл 10 нг/мл человека TNFα в M20 в гель. Инкубируйте на 37 °C/5% CO 2 для 4 х.
Примечание: Неактивированные HUVEC условия также могут быть включены при необходимости как элементы управления.
Моноциты - в течение 4 ч HUVEC активации шаг, изолировать от получения с помощью магнитных бисерные техники негативно выбрать для ячеек в соответствии с производителем ' s инструкции. Минимум 6,5 x 10 6 получения должны быть использованы на этот шаг для того, чтобы надежно восстановить 3.0 x 10 5 моноцитов, необходимых для одного состояния, как моноциты обычно приходится примерно 10-15% репликацию.
Примечание: Для оценки эффекта Моноцит активации до формирования Моноцит трансмиграции и пены клетки, моноциты может активироваться на данном этапе. Моноциты могут быть изолированы от талой репликацию при необходимости (например, хранимой пациентов образцов). Моноцит подмножеств изолируются СУИМ сортировки может быть подготовлен для того, чтобы гели (рис. 1).
5. Переселение первичных человеческих моноциты: день 8
- для измерения Моноцит трансмиграции, удалить СМИ TNFα-содержащих и мыть гели дважды с 100 мкл M199 путем добавления и удаления средства массовой информации. После стирки, добавить 2.0 x 10 5 свежезаваренным изолированных или разморозить и промывают криоконсервированных репликацию или 5.0 x 10 моноциты 4 свежезаваренным изолированных или очищенного Моноцит подмножества для HUVEC монослои в 100 мкл M20. Инкубируйте 1 час при 37 ° C и 5% CO 2 разрешить вперед трансмиграции моноцитов в гель. Лучше всего позволить 6 скважин для каждого экспериментальные условия изучены.
Примечание: Оценить эффект аутологичной сыворотки на формирование клеток трансмиграции и пены, инкубации клеток с M20, содержащих желаемой концентрации тепла инактивированная доноров сыворотки и сравнить условия с элементом управления человеческой сыворотки. На этой стадии могут быть добавлены лейкоциты помимо моноцитов. Если исследования воздействия конкретных липидов/липидов видов (например, ЛПВП, oxHDL), выполнять все следующие шаги с сыворотка свободных СМИ, содержащие 20-50 мкг/мл липиды. - После 1 h вперед переселения, собрать-переселено клетки путем промывания гели дважды с 100 мкл подогретую 1 мм EGTA в однократном ПБС и один раз с 100 мкл M199 (же центрифуга условия), объединение supernatants от каждой скважины одного и того же экспериментальный состояние (обычно 6 скважин) в 1,5 мл microcentrifuge трубку на льду. Центрифуга-переселено клетки на 4 ° C, 300 x g 5 мин и Ресуспензируйте в 30 мкл ПБС.
- Количество клеток, собранных в надосадке определить количество вперед переселенных клеток.
- Процент вперед переселенных ячеек определяется следующим:
- покрытия мытый Гели, содержащие переселенных клетки с 100 мкл M20 и инкубировать еще 48 ч.
- После 48 ч, собирать супернатант и мыть-переселено клетки дважды с 100 мкл подогретую 1 мм EGTA/PBS, сбор и объединение супернатант от каждого состояния как шаг 5.2.
Примечание: Фенотип обратный переселенных клеток может быть проверена на эти клетки following Стандартный проточной цитометрии пятная протоколы. - Центрифуга клетки на 4 ° C, 300 x g 5 мин и Ресуспензируйте клетки в 30 мкл ПБС. Подсчитать ячейки и определить жизнеспособность через Трипановый синий пятнать.
- Определить процент обратный переселенных клеток, используя следующее уравнение:
Примечание: учет общее количество переселенных вперед клеток дает более точным показателем обратного переселения, как это вряд ли вперед трансмиграции будет 100%. - Для анализа в микроскопии, исправить гели, добавив 100 мкл 2% формальдегида (конечная концентрация) для каждой скважины, накладки в алюминиевой фольги и хранить при 4 ° C до анализа. Для проточной цитометрии не исправить клетки на данном этапе. Смотреть ниже протоколы для микроскопии (раздел 6) или анализа потока цитометрии (раздел 7).
Предупреждение: Формальдегид, токсичные и коррозионные; использование средств индивидуальной защиты (СИЗ). Следует соблюдать осторожность при добавлении формальдегида, однако, этот шаг не должны выполняться в вытяжной шкаф из-за низкой концентрации.
6. Количественный пены клетки и макрофаги по микроскопии (масло-красный O пятно)
- Удалить формальдегида и мыть гели с 100 мкл 50% (v/v) метанола на 5 мин и затем 100 мкл 78% (v/v) метанола на 15 мин
Примечание: Окрашивание шаги могут быть выполнены на лабораторном столе, а не в шкаф класса II Biohazard. - Пятно для липидного капель путем добавления 100 мкл свежеприготовленные 0,2% (w/v) масло-красный O (см. Таблицу материалов для деталей) за 1 ч при комнатной температуре.
- Удалить излишки пятно, стиральные гели 4 раза с 100 мкл 78% (v/v) метанола, аспирационных и отменяя надосадке после каждого Вашингтон
- Изображение за 15 мин при комнатной температуре с 100 мкл Гимзы, разбавляют в дистиллированной воде 1:10.
- Аспирационная Гимзе и мыть гели раз с водой.
- Для отсоединения Гели от плиты, ОПРАВА скважин с помощью иглой 21 G с скоса наружу, по краям геля.
- Для монтирования гели на микроскопа, удар два отверстия (диаметр 6,35 мм) в полосе 2,54 см x 1,5 см двухсторонний скотч. Исправьте ленты в сторону стандартной микроскопа и удалить защитное покрытие из верхней.
- Добавить каплю воды в отверстия в ленты с помощью пипетки передачи. С помощью пинцета, нежно передачи гели с отверстиями в ленте и крышка с coverslip 1.5 стекла размер. Слегка нажмите на coverslip придерживаться ленты.
- Изучать с дифференциальной помехи контраст ярких поля микроскопии с использованием 40 X цель на инвертированным микроскопом.
- Принесите HUVEC монослоя в фокус на 40 X увеличение и прокрутки ' в ' гель, подсчет клеток макрофагами пены на протяжении всей глубины геля. Повторите для трех различных полей зрения расположен на аналогичные расстояния от края геля для того, чтобы свести к минимуму возможные эффекты краев. Это обеспечит гель глубина согласуется между подсчета регионов.
Примечание: Оценка клетки в геле как пена клетки (определяется как клетки, содержащие > 1/3 из их цитоплазме как нефть-красный O окрашенных липидного капель) или макрофаги в течение 2 ч монтажа на слайдах ( рис. 2). Образование пены клетки выражается как процент клеток пены относительно общего числа перенесенных клеток и выражается как отсчеты средний 3 поля зрения рассмотрены для 6 гели в состоянии, поэтому средний 18 измерений в состоянии. В таблице 2 приведен пример из сырья клеток от типичного эксперимент.
Примечание: Классификации ячейки как макрофагов против клеток пены при микроскопии субъективна и следовательно могут зависеть от следователя. В клинических исследованиях, где эксперименты выполняются в течение длительного времени, важно для подсчета всех выполняемых ослепленный одного следователя. На рисунке 2 приводятся примеры пены клетки и макрофаги в гелях.
- Принесите HUVEC монослоя в фокус на 40 X увеличение и прокрутки ' в ' гель, подсчет клеток макрофагами пены на протяжении всей глубины геля. Повторите для трех различных полей зрения расположен на аналогичные расстояния от края геля для того, чтобы свести к минимуму возможные эффекты краев. Это обеспечит гель глубина согласуется между подсчета регионов.
7. Анализ переселено клеток, поток цитометрии
- фенотипически характеризуют пены клетки и макрофаги, после трансэндотелиальной миграции, дайджест гели, добавив 100 мкл 37 ° C подогретую 1 мг/мл коллагеназы D разводят в M199 для Каждый хорошо и проинкубируйте втечение 20 мин на 37 °C/5% CO 2.
Примечание: Поместите пластины для 96-луночных прямо на чистые металлические стеллажи в инкубаторе обеспечить равномерное распределение тепла. - После инкубации, Размачиваем гели, с помощью кончика пипетки 200 мкл и инкубировать еще 20 минут, 37 °C/5% CO 2.
- Один раз полностью усваивается организмом, фильтр и бассейн переваривается реплицировать гели через 35 мкм нейлон сетки ограничен СУИМ трубки помещены на льду и мыть раз с СУИМ мыть (см. таблицу материалов) при 4 ° C, 300 x g. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл СУИМ Вашингтон
- Результате клетки с Флюорофор конъюгированных антител специфических Инкубируйте CD45, маркер жить/мертвых клеток и поверхности/внутриклеточных маркеров фенотипические или функциональных интерес, используя стандартный поток цитометрии протоколы.
Примечание: Подготовьте управления трубы для компенсации, используя соответствующие флуорофоров и Ig компенсации бусины. Извлеченные клетки также могут быть собраны на стеклянных вставках для микроскопии иммунофлуоресценции, cytospinning. Кроме того, мы успешно собрали клетки, используя этот протокол для оценки через изображений проточной цитометрии. - Приобрести клетки с помощью проточный цитометр и выполнять компенсации необходимости.
Примечание: Как пена клетки/макрофаги могут не образуют отдельных групп населения, с помощью свойства рассеяние света и могут значительно отличаться по размеру и форме, установите либеральной вперед точечной (FSC) и стороны точечной (SSC) ворота для того, чтобы захватить все перенесенные клетки, как показано в < сильный класс = «xfig» > рисунок 3A. - После приобретения, выполнять анализ данных, с помощью потока цитометрии программного обеспечения. Чтобы идентифицировать перенесенные клетки, сначала выделите ячейки как негативные для маркера жить/мертвые, как показано на рисунке 3B. Далее, выполняют одну ячейку дискриминации путем создания жесткой ворота вокруг клетки, показано на участке против SSC-высота SSC-площадь.
- Выберите CD45 + клеток и ворота основных населения перенесенных клетки присутствуют в участке FSC/SSC, как эти являются клетки, макрофаги пены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Количественная оценка трансмиграции Моноцит
Моноциты добавляются к модели, как описано на рисунке 1, и шесть гели составляются для каждого условия. Моноциты 6 гели на доноров (т.е., 5.0 x 10 моноциты4 за гелей гель 6 = 3,0 x 105 моноцитов в доноров) высокомобильна окончательный объем 600 мкл M199 носителя, содержащего необходимые сыворотка/изолированные липидов. Клетки (т.е., 100 мкл на гель = 5,0 x 10 моноциты4 ), затем aliquoted на гели и инкубируют как указано выше за 1 ч до облегчения Моноцит трансмиграции. После переселения не переселено ячейки учитываются как указано выше. В этом примере 1,5 х 104 -переселено клетки были восстановлены. Процент вперед переселения был определен с помощью формул, описанных в шаге 5.4:
После 48 ч инкубации 3.6 x 104 обратный переселенных клетки были восстановлены как указано выше. Процент обратного переселения был определен по формуле в шаге 5.8:
Вперед и обратного переселения могут сравниваться между условиями, с использованием надлежащих статистических тестов и моноцитов, приготовленный из нескольких независимых доноров определить, изменяется ли способность трансмиграции Моноцит между экспериментальной условий.
Оценка образование клеток пены
Brightfield микроскопии
Окисленные липопротеины известны содействовать моноцитарных пены клетки формирования в vitro по сравнению с15unoxidized липиды. Здесь мы подтверждаем, что лечение моноциты с oxLDL, широко используется, чтобы вызвать образование пены клетки в обычных пены клетки индукции модели, повышает моноцитарных клеток пенообразованием в этой модели формирования трансэндотелиальной миграции и пены клетки по сравнению с родной ЛПНП. После Моноцит трансмиграции и пены клетки формирования в гелях инкубировали с M199 содержащие 50 мкг/мл родной или CuSO4-окисленных ЛПНП (см. шаг 5.1, рис. 1), клетки были проанализированы микроскопии. На рисунке 2приведены примеры пены клетки и макрофаги, наблюдается в представительных экспериментов. Клетки были подсчитаны в трех различных областях в гель, путем сосредоточения внимания на HUVEC монослоя и постепенно упором глубже в гель. Клеток записываются для каждого донора, как показано в таблице 2 для одного донора, чтобы сравнить процент клеток пены, сформированные в ответ на окисляется и родной ЛПНП. Совокупные данные из n = 12 независимых графов показано на рисунке 4 , для подтверждения, что инкубации моноциты с oxLDL в этой модели вызывает больше образование пены клетки чем условия, где моноциты инкубируют с родной LDL или M199 СМИ только.
Проточная цитометрия
Для определения фенотипа миграции клеток, клеток извлекаются из переваренной гели и помечены с помощью стандартного потока цитометрии панели. Клетки были помечены маркер жить/мертвых клеток и антител конкретных CD45 и другие поверхности фенотип маркеры с помощью стандартного потока цитометрии протоколов. Компенсации элементы управления должны быть также готовы к полной компенсации согласно стандартного потока цитометрии методы. Перенесенные клетки являются воротами, как показано на рисунке 3 участки представитель 10 независимых экспериментов. Живые клетки являются воротами с использованием жить/мертвые клетки жизнеспособность анализов (рис. 3B) и Дуплеты исключаются путем анализа одну ячейку (рис. 3 c). Клетки затем условного как CD45+ для того чтобы исключить HUVEC (как эти клетки являются CD45-, рис. 3D). Основные демографические затем условного вперед разброс/сторона разброс дискриминации (Рисунок 3E) и интенсивность средняя флуоресцирования (MFI) рецепторов интерес определяются по сравнению с либо флуоресценции минус один (FMO) или изотипа управления) Рисунок 3F) чтобы определить выражение (ΔMFI) или процент положительных клеток.
Рисунок 1 : в пробирке модель формирования Моноцит трансмиграции и пены клетки. (A) КСДОР, всего моноцитов (B) или (C) Сортировка СУИМ Моноцит подмножества добавляются к типу я волокнистый коллаген гели сформирована в 96-луночных пластины и покрыт монослоя активированного первичной человеческой пуповинной вен эндотелиальных клеток (HUVEC), целостность которого может оцениваться Серебряный пятнать (D) и (E) высыпками 1 h присутствии сыворотки или липидов, содержащие средства массовой информации. Non переселено ячейки учитываются (F) и гели инкубируют для дальнейшего 48 ч с же сыворотка/липидов, содержащий средства массовой информации. После инкубации, (G) обратной миграции клеток, учитываются и определяется процент клеток пены против макрофагов в геле (H) фазово-контрастной микроскопии после окрашивания с маслом-красный O или фенотип миграции клеток определяется (я) проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Примеры пены клетки и макрофаги в в пробирке модель формирования Моноцит трансмиграции и пены клетки. СааремааIve примеры забил как пена клетки (белые стрелки) клеток и макрофагов (черные стрелки) после Гимза пятнать визуализировать клетки и O нефти-красного окрашивания для визуализации липидного капель определяется Фазово-контрастная микроскопия извлеченные гелей с использованием Перевернутый Микроскоп с увеличением 40 X. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Стробирования стратегия переселенных клеток подачей cytometry. Переселенные клетки характеризуются фенотипически проточной цитометрии после извлечения клеток из гелей. Клетки являются воротами на (A) FSC/SSC, живые клетки (B), (C) отдельные ячейки, CD45 (D)+, (F) и (E) FSC/SSC выражение рецептора, по сравнению с изотипа или флуоресценции минус один (FMO) элемента управления. Экспрессии рецепторов интерес определяются как среднее флуоресценции интенсивности (MFI) и выразили в отношении уровней изотипа. ΔMFI = пятно (MFI) минус изотипа/ФМО управления (МРИ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Влияние на клетки моноцитарных пенообразованием экзогенно добавлен oxLDL и ЛПНП. Образование клеток пены определяется в условиях, когда моноциты от одного донора инкубируют со средствами массовой информации (M199) или 50 мкг/мл Неокисленная липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) или сульфата меди (II) окисленных ЛПНП (oxLDL) добавляется Гели после переселения. Счетчики для 12 различных сайтов показываются. Пена клетки выражаются в процентах от общего числа перенесенных клеток. Средний и межквартильный диапазон указаны в бар графики и сравнения были сделаны с использованием непараметрических тестов U Манна-Уитни. p < 0,001, *** p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Реагент | [Фондовых] | [Последний] | Объем для 60 гели (мкл) |
| NaOH | 100 мм | 35,7 мм | 1071 |
| M199 | 10 x | 0.71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 мм | 4.58 мм | 687 |
| Коллаген | 5 мг/мл | 1.71 мг/мл | 1029 |
| Общий объем | - | - | 3000 |
Таблица 1: Тип I Подготовка геля волокнистый коллаген
| ЛПНП | oxLDL | |||||||
| Гель | Количество | Пена клетки1 | Перенесенные клетки1 | Пена клетки2 (%) | Пена клетки1 | Перенесенные клетки1 | Пена клетки2 (%) | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47,3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18,5 | 10 | 23 | 43,5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21.2 | 19 | 39 | 48,7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14.7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58.2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13.5 | 19 | 37 | 51,4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53,8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 11 | 31 | 35,5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18.4 | 28 | 53 | 52,8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20,5 | 14 | 33 | 42,4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 22 | 47 | 46,8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36,7 | ||
| Средний пены клетки (%) | 20,8 | 47 | ||||||
| Средняя пены клетки (%) | 19,8 | 45,5 | ||||||
Таблица 2: Raw клетки подсчитывает от сравнения моноцитарных пены клетки после лечения oxLDL против ЛПНП. 1 Клетки подсчитывает в поле зрения в гель. 2 Процент клеток пены = пены графов/всего миграции клеток графов x 100. * Данные являются представитель одного эксперимента с использованием моноциты от одного донора
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанные здесь предлагает универсальный и физиологически соответствующие метод оценки атерогенности моноциты из человеческих клинических когорт, объединив Моноцит трансмиграции и образование пены клетки. Эта модель предлагает преимущества над альтернативные методы формирования клеток пены, как он принимает во внимание эффект Моноцит переселения на образование пены клетки и позволяет измерения обратного переселения6 помимо присущих склонность моноциты перерастет пены клетки в наличие или отсутствие внешних факторов. Кроме того роль эндотелия активации также принимается во внимание, как мы показали что эндотелиальной активации upregulates окисление липидов видов, который связан с пены клетки формирования14. Наконец можно количественно и характеризуется микроскопии и потока цитометрии фенотип моноцитов, которые проходят выход (свойство, связанное с налета регрессии).
Благодаря трехмерную природу переселения в гели выявление и забил переселенных клетки как пена клетки или макрофаги может быть трудно как клетки высыпками на различных уровнях в гель19. Для облегчения идентификации клеток пены, свежее пятно нефти-красный O должен использоваться всегда. Это также следует отметить, что различные ex vivo болезни государств или в vitro условий могут изменить Моноцит переселения в геле. Мы использовали живой клетки изображений для определения, что, как правило, моноциты из ВИЧ инфицированных лиц высыпками резкости очков в гели и на разных скоростях, чем те от неинфицированных лиц19. Кроме того, образование пены клетки связано с менее Моноцит подвижности в геле, поэтому клетки, как правило, двигаться в кругах в частности z Секция по сравнению с клетки от ВИЧ неинфицированных лиц, которые, как правило, мигрируют в относительно прямой линии к нижней части геля. Эти результаты поднимают возможность аналогичного явления, происходящие в экспериментах с использованием человека пациентов образцов из других государств болезни, связанные с повышенной Моноцит атерогенности.
При выполнении анализа на основе цитометрия потоков это часто наблюдать значительную долю мертвых клеток в популяции восстановления клеток при оценке жизнеспособности, используя маркеры жить/мертвых клеток (рис. 4В). Эти клетки являются преимущественно CD45– HUVEC, повреждены во время шага пищеварения/мацерации коллагена, требуемого для извлечения моноцитарных клеток из коллагеновой матрицы. Этот процесс особенно суровой на HUVEC монослоя, но не вредно для фенотипирование переселенных клетки.
Эта модель отличается от других в том, что в культуре СМИ диска моноцитарных клеток пенообразованием требуется не искусственно окисленное экзогенных липидов. Вместо этого образование пены клетки в этот assay под влиянием сыворотки в культуре средств массовой информации, позволяя для дискретного эффекты растворимых факторов из клинических образцов для оценки. Таким образом мы показали что инкубации управления моноциты с сывороткой от молодых ВИЧ инфицированных19 или пожилых ВИЧ неинфицированных20 особей способствует формированию клеток пены, указав, что растворимых факторов могут самостоятельно содействовать пены формирование клеток. Как assay влиянием растворимых компонентов, единого пакета человеческой сыворотки должен использоваться для экспериментов, направленных на присущие разности атерогенные свойства моноцитов, полученных от разных лиц с целью стандартизации контроль условий. Этот assay может также использоваться для оценки роли липидов конкретных видов из клинических образцов (рис. 3). Например мы нашли что инкубации моноциты с СМИ, содержащих изолированным липидной видов, таких как липопротеинов высокой от физических лиц с известными липидов дисфункции24 также способствует формированию ячейки пены. В этом случае моноциты от одного здорового лица или группы лиц может использоваться в присутствии сыворотки или факторы сыворотки, производный от испытуемых. Таким образом эта модель позволяет конкретные вопросы относительно дискретных эффекты растворимых и клеточных компонентов на образование клеток пены.
Этот assay использует модель эндотелия коронарных артерии из-за практических трудностей в получении большого количества низкий проход число первичных коронарной артерии клеток HUVEC. Однако, мы по сравнению результаты анализов с использованием эндотелиальных клеток человека коронарной артерии или HUVEC и наблюдается небольшое различие в Моноцит переселения или пена клетки формирования (данные не показаны), указывая, что HUVECs в этой системе используется приемлемые альтернативы. Ручной подсчет клеток пены является ограничивающим фактором в этой модели, как это может ввести оператор предвзятости. Таким образом все образцы, установленный на слайды необходимо ослепил оператору для того, чтобы удалить потенциал предвзятости. Мы, однако, по сравнению образование пены клетки как измеряется путем ручной подсчет и визуализации проточной цитометрии и обнаружили, что эти методы дают аналогичные результаты19. Основным ограничением этой модели является, что Моноцит адгезии и трансмиграции происходят в отсутствие сдвига, связанные с физиологической крови поток в естественных условиях. Мы предполагаем, что наклон потока преимущественно влияет на Моноцит трансмиграции и не последующие пенообразованием ячейку в матрице; Однако это необходимо учитывать при интерпретации результатов от этот assay. Этот assay также не моделирует влияние гладких мышечных клеток в формировании клеток моноцитарных пены, которая является ограничением физиологические системы; Однако это согласуется в любых условиях, позволяя дискретных атерогенный потенциал моноцитов в сравнении между государствами различных заболеваний.
В целом эта модель обеспечивает универсальный и физиологически соответствующие метод количественной оценки Моноцит трансмиграции и образование пены клетки от человеческих образцов в различных заболеваний государств ex vivo. Эта модель имеет дополнительные приложения для оценки склонность Моноциты образуют пены клетки в условиях, где Моноцит атерогенности ассоциируется с повышенным риском CAD25ожирение, диабет26 и хронической почечной болезни27. Таким образом эта модель также может быть оптимизирован для использования в болезни государствами помимо атеросклероза где сотовая трансмиграции могут влиять патогенеза болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью отметить работу профессор Уильям Мюллер и д-р Клэр Westhorpe за их ключевую роль в развитии более ранних итераций этой модели. Авторы также хотел бы поблагодарить AMREP потока цитометрии ядро для сортировки Моноцит подмножеств и Альфред больницы инфекционные заболевания группы клинических исследований медсестер для найма ВИЧ + людей для некоторых исследований. Авторы с благодарностью признать вклад в эту работу Виктория оперативной инфраструктуры программы поддержки полученных институтом Burnet. TAA поддерживается КМТИ университета вице-канцлера докторантура стипендий. Эта работа была поддержана NHMRC Грант проекта 1108792 присуждена AJ и AH. TK поддерживается NIH предоставляет низ K08AI08272, гранта NIH/NCATS # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
- Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
- Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
- Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038 (2016).
- Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
- Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
- Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
- Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
- Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
- Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
- Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
- Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
- Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
- Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).
