Summary
Vi beskriver ett protokoll för att mäta transmigration av monocyter över mänskliga endothelial enskiktslager och deras efterföljande mognad i skumceller. Detta ger en mångsidig metod att bedöma de aterogena egenskaperna hos monocyter isolerade från personer med olika sjukdomstillstånd och utvärdera faktorer i blodet vilket kan öka denna benägenhet.
Abstract
Kranskärlssjukdom (CAD) är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Åderförkalkning, en ledande orsaken till CAD, initieras av transmigrationen av medfödd immun monocyter till inflammatoriska webbplatser av deponerade lipid kallas feta streck, som finns i kärlväggarna av medelstora till stora artärer. Lesioner i detta tidiga skede av åderförkalkning patogena utomhusmiljö är mognaden av monocyter som migrerar in artärerna att bilda skumceller eller lipid-lastad makrofager. Betydande bevis stöder hypotesen att ökad risk för åderförkalkning av kroniska inflammatoriska sjukdomar som åtföljer sjukdomar såsom reumatoid artrit och HIV, samt allmänna åldrande och att denna risk förutspås av monocyt aktivering. Medan musmodeller ger en bra plattform för att undersöka betydelsen av monocyter i aterogenes i vivo, de kräver genetisk ändring av naturliga kolesterol metabolism och drastisk ändring av normal mus Dieter, och har begränsad lämplighet för studien av aterogena influenser av mänskliga samtidiga sjukdomar. Detta motiverade oss att utveckla en mänsklig in vitro- modell för att mäta aterogena potential av monocyter isolerade från individer med definierade sjukdomstillstånd. För närvarande begränsar mänsklig in vitro- modeller i att de utvärderar monocyt själavandring och skum cellnybildningen i isolering. Här beskriver vi ett protokoll där monocyter isolerade från patientens blod transmigrate över mänskliga endothelial celler till en typ 1 kollagenmatrisen, och deras benägenhet att mogna till skumceller i närvaro eller frånvaro av exogena lipid mäts. Protokollet har validerats för användning av humana monocyter renats från individer med HIV-infektion och äldre HIV infekterade individer. Denna modell är mångsidig och tillåter monocyt själavandring och skum cellbildande utvärderas med hjälp av antingen mikroskopi eller flödescytometri samt gör att bedömningen av aterogena faktorer förekommer i serum eller plasma.
Introduction
Monocyt själavandring är ett viktigt steg i utvecklingen av aterosklerotiska plack som kan leda till Trombos, stroke och hjärtinfarkt. Aterosklerotiska plack utvecklas från feta ränder, allmänhet närvarande vid platser av låg oscillerande blodflödet i medium till stora artärer, där deponerade lipid bidrar till endotel aktivering och lokaliserad inflammation1. Monocyter rekryteras till endotelceller i feta streck via monocyt kemotaktisk proteiner (t.ex. CCL2) och transmigrate i den intima2. Efter själavandring, kan monocyter bilda aterogena, lipid-lastad makrofager kallas skumceller till följd av lipid upptag, lipid syntes, down-förordning av kolesterol efflux eller en kombination av ovanstående faktorer. Monocyter kan även ackumuleras lipider i cirkulationen och har en 'skummande' fenotyp, möjligen predisponerande celler för skum cell bildning3,4. Skummacellerna är definierande funktionen av feta ränder och tidigt stadium aterosklerotiska plack och prisbildningen påverkas av både lipid och inflammatoriska mediatorer5. Alternativt, monocyter har förmågan att vända transmigrate från artär i blodomloppet6, och tar därigenom bort lipid från intima och agerar för att bevara hälsan i artären.
Att bestämma propensityen av monocyter till transmigrate över arteriell endotel och bildar skumceller i intima eller att vända transmigrate och bära lipid av plack, är en viktig förutsättning för att förstå rollen av monocyt aktivering i ökande aterosklerotisk risk. Musmodeller av CADs såsom åderförkalkning är viktiga att belysa i realtid i vivo information om fatty streak/aterosklerotiska plack utveckling. Dessa modeller kräver dock en genetisk förändring av den naturliga kolesterol bearbetning förmågor av dessa djur oftast i kombination med drastiska förändringar i kost (såsom ApoE-/-Western-typ kost modell)7,8, därmed, förmå icke-fysiologiskt ackumulering av cirkulerande lipid nivåer som driva plack utvecklingen. Dessa modeller kan ha begränsad relevans för kroniska inflammatoriska mänskliga sjukdomar såsom HIV-infektion som inte är associerade med ökad cirkulerande kolesterol eller low-density lipoprotein (LDL) nivåer. Dessutom skillnader i monocyt biologi mellan människor och möss gör testning av immunologiska frågor angående relevansen av subpopulationer av monocyter (såsom mellanliggande monocyter (CD14++CD16+))9 svårt. Detta är viktigt när man studerar de mekanismer som driver hjärt-kärlsjukdom som mellanliggande monocyt räknas självständigt förutsäga kardiovaskulära händelser10,11. Även analyser finns för att mäta sekventiellt antingen monocyt själavandring eller skum cellnybildningen i isolering, har inga in vitro- test validerats för att kvantifiera båda aspekter av tidig aterogenes med samma celler från kliniska kohorter. Transwell modeller använder en modifierad Boyden tvåkammarsystem där celler läses in den övre kammaren och transmigrate över en porös plast barriär eller cell enskiktslager i en nedre kammare som normalt innehåller media med korrektiv12 , 13. samtidigt som ofta används för att analysera leukocyt själavandring, dessa modeller inte generellt införliva ett lager som representerar intima, vilket resulterar i livslopp cellerna migrerar till lösning, och Tillåt inte för mätning av skum cell bildning eller omvänd transmigration av samma celler. Modeller av skum-cellbildande däremot inte hänsyn till eventuella transmigratory-inducerad ändringar monocyter eller effekterna av endothelial aktivering som är kända för att bidra till att skum cell formation14. Dessutom dessa system inducera skum cell formation från makrofager följs cell kultur plattor av tillägg av mättar koncentrationer av exogena oxiderat LDL (oxLDL)15,16, en nyckel inducerare foam cell bildas. LDL som används i dessa modeller är ofta oxideras av icke-fysiologiskt-relevanta processer såsom CuSO4 behandling17, därför ifrågasätta den fysiologiska betydelsen av studier med hjälp av dessa modeller.
Här beskriver vi en analysmetod som kvantifierar monocyt själavandring och skum cell bildandet av samma celler som inte kräver tillsats av EXOGEN oxLDL, således bättre modellering rollen av monocyter i skum cell formation. Denna modell har ursprungligen utvecklats av Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18, och har varit förfinas ytterligare i vårt laboratorium att bedöma ex vivo atherogenicity av monocyter isolerade under icke-aktiverande villkor från individer med underliggande inflammatoriska tillstånd åtfölja sjukdomar såsom HIV infektion19 samt åldrande20, som är associerade med en ökad risk för åderförkalkning. Denna modell ger också en plattform för att besvara grundläggande biologiska frågor angående benägenheten för olika monocyt delmängder till formuläret skum celler20, påverkan av endothelial aktivering av cytokiner såsom TNF på skum-cellbildande14 , och flyttande egenskaperna av monocyter såsom djup och hastighet själavandring i geler19. Dessutom monocyt själavandring och skum cellbildande kan kvantifieras med standard mikroskopi, live cell imaging, flow flödescytometri och imaging flödescytometri, därför att ge en mångsidig metod för att utvärdera rollen av monocyter i aterogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: alla experiment med mänskliga biologiska prover utfördes med etik godkännande från Alfred Hospital mänskliga etikkommittén, Melbourne. Alla experimenten utfördes i klass II biosäkerhet skåp såvida inte anges. " Prewarmed " refererar till reagenserna värmas till 37 ° C i ett vattenbad.
1. beredning av typ I fibrösa kollagen geler: dag 1
- Förbered polymeriseras kollagen geler genom sekventiellt lägga till och blanda 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, 4.58 mM ättiksyra och 1.71 mg/mL typ I fibrösa kollagen i en 5 mL polystyren rör enligt tabell 1.
Anmärkning: Se till att kollagenet är väl blandat genom att försiktigt upp och ned 5 gånger för att stoppa bildandet av kollagen med ' fickor ' i gel blandningen. Förbered 4-6 geler per testvillkor för mikroskopi eller 15 geler per testvillkor för flödescytometri. - Väl en gång blandade, alikvotens 50 µL av kollagen gel blandning i varje brunn sterila flatbottnad 96 brunnar vävnadsodling platta. Använd inte utanför rader och kolumner, men Fyll dessa med 200 µL 1 x Dubecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att skydda gelerna från uttorkning. Inkubera plattorna vid 37 °C/5% CO 2 för 2 h att tillåta kollagen att polymerisera.
Obs: Placera plattorna direkt på ren metall rack i inkubatorn att säkerställa jämn värmefördelning. - Efter inkubation, overlay gelerna med 150 µL av 1 x kompletterade M199 (se Tabell av material) och inkubera i 5 dagar fram till användning.
2. Expansion av lagrade HUVEC: dag 1
- etikett och pälsen en 10 cm diameter petriskål med 1 mL av 50 µg/mL Fibronektin utspätt i 1 x PBS och odla i rumstemperatur i 10 min.
- Tina alikvoter av frysförvarade primära mänskliga umbilical ven endotelceller (HUVEC, 1,0 x 10 6 celler) i 10 mL M20.
Obs: HUVEC bör förberedas som tidigare beskrivits 21 och som används på en låg passage nummer (< passage 4). HUVEC kan ersättas med mänskliga kranskärl endotelceller här. - Omsuspendera HUVEC i 10 mL M20 och lägga Fibronektin belagda skålen, aspirera överskott Fibronektin före tillsats av celler och kultur till sammanflödet (cirka 5 dagar), ersätta media på dag 3.
3. Odling HUVEC enskiktslager på kollagen geler: dag 5
- på dag 5, lossa HUVEC genom aspirera kultur supernatant från petriskål och tvätta bort serum-innehållande media med 10 mL serumfritt M199.
- Lägga till 5 mL 0,05% trypsin/0,53 EDTA i M199 HUVEC och inkubera i 1-2 min i rumstemperatur, skaka försiktigt tills cellerna lossa.
- När fristående, snabbt skölja petriskål med 5 mL M20 och överföra media som innehåller celler till en 10 mL röret.
- Centrifug prover vid 300 x g under 5 minuter i rumstemperatur, sug ut supernatant Omsuspendera cellerna i 200 µL M20 och räkna celler som använder en hemocytometer.
- Omsuspendera cellerna till 2,0 x 10 5 celler/mL i M20, aspirera på M199 på gelerna från plattan med 96 brunnar (steg 1.3) och tillsätt 100 µL återsuspenderad HUVEC (2,0 x 10 4 celler) till varje kollagen gel beredd enligt ovan (steg 1.2). Kultur plattor i ytterligare 3 dagar på 37 °C/5% CO 2.
Obs: Den HUVEC enskiktslager integritet kan bekräftas efter 3 dagar av silvernitrat färgning 22 eller immunhistokemi för åtsittande föreningspunkt proteiner 23 i detta skede. Ytterligare geler måste förberedas för detta ändamål.
4. Aktivering av HUVEC enskiktslager och isolering/aktivering av monocyter för Transmigration: dag 8
- på dag 8, aktivera varje HUVEC enskiktslager före tillsats av monocyter genom att aspirera på M20 media överliggande gelerna och lägga till 100 µL 10 ng/ml humant TNFα i M20 per gel. Inkubera vid 37 °C/5% CO 2 för 4 h.
Obs: Icke-aktiverade HUVEC villkor kan också inkluderas om det behövs som kontroller. - Under the 4 h HUVEC aktiveringen steg, isolera monocyter från PBMC använder magnetiska bead tekniker negativt välja för celler enligt tillverkaren ' anvisningar. Minst 6,5 x 10 6 PBMC bör användas i detta steg för att på ett tillförlitligt sätt återställa 3.0 x 10 5 monocyter krävs för en villkora, som monocyter vanligtvis står för cirka 10-15% av PBMC.
Obs: För att utvärdera effekten av monocyt aktivering före monocyt själavandring och skum cellnybildningen, monocyter kan aktiveras i detta skede. Monocyter kan isoleras från tinade PBMC vid behov (dvs. lagrade patientprover). Monocyt delmängder isolerat av FACS sortering kan förberedas för tillägg till geler (figur 1).
5. Transmigration av primära humana monocyter: dag 8
- att mäta monocyt själavandring, ta bort TNFα-innehållande media och tvätta geler två gånger med 100 µL M199 genom att lägga till och ta bort media. Efter tvättning, lägga till 2.0 x 10 5 färska isolerade eller tinade och tvättas i fryst tillstånd PBMC eller 5,0 x 10 4 färska isolerade monocyter eller renat monocyt delmängder till HUVEC enskiktslager i 100 µL M20. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C och 5% CO 2 att den framåt transmigrationen av monocyter i gelen. Det är bäst att låta 6 brunnar för varje experimentella villkor undersökt.
Obs: För att utvärdera effekten av autologt serum på själavandring och skum-cellbildande, inkubera cellerna med M20 som innehåller önskad koncentration av Värmeinaktiverade givarens serum och jämför villkoren med en poolad humanserum kontroll. Leukocyter än monocyter kan läggas i detta skede. Om undersökt effekterna av specifika lipider/lipid arter (t.ex., HDL, oxHDL), utför alla följande steg med serumfritt medium som innehåller 20-50 µg/mL lipider. - Efter 1 h av framåt själavandring, samla in icke-livslopp cellerna genom att tvätta geler två gånger med 100 µL av förvärmd 1 mM EGTA i 1 x PBS, och en gång med 100 µL M199 (samma Centrifugera villkor), slå samman supernatanterna från varje brunn av samma experimentella villkor (vanligtvis 6 brunnar) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör på is. Centrifugera icke-livslopp cellerna vid 4 ° C, 300 x g i 5 min och återsuspendera i 30 µL 1 x PBS.
- Räkna cellerna samlas i supernatanten att bestämma antalet framåt livslopp celler.
- Andelen framåt livslopp celler bestäms enligt följande:
- täcka den tvättade geler som innehåller livslopp celler med 100 µL M20 och inkubera i en ytterligare 48 h.
- Efter 48 h, samla supernatanten och tvätta icke-livslopp celler två gånger med 100 µL föruppvärmd 1 mM EGTA/PBS, samla och samla supernatanten från varje villkor som i steg 5.2.
Obs: Fenotypen av omvänd livslopp celler kan provas med dessa celler ffter standard flödescytometri färgprotokoll. - Centrifugera celler vid 4 ° C, 300 x g i 5 min och resuspendera cellerna i 30 µL 1 x PBS. Räkna celler och avgöra lönsamhet via trypan blå färgning.
- Bestämma procentandelen av omvänd livslopp celler med hjälp av följande ekvation:
Obs: redovisning för det totala antalet framåt livslopp celler ger en mer exakt uppgift om omvänd själavandring eftersom det är osannolikt framåt själavandring blir 100%. - För analys av mikroskopi, fixa gelerna genom att tillsätta 100 µL 2% formaldehyd (slutlig koncentration) till varje brunn, täcka pläterar i aluminium folie och förvaras vid 4 ° C fram till analys. För flödescytometri, fixa inte cellerna i detta skede. Se protokollen nedan för mikroskopi (avsnitt 6) eller flödescytometri (avsnitt 7) Flödesanalys.
FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd är giftiga och frätande; Använd personlig skyddsutrustning (PPE). Försiktighet bör iakttas när du lägger till formaldehyd, detta steg behöver dock inte utföras i dragskåp på grund av den låga koncentrationen används.
6. Kvantitering av skum-celler och makrofager av mikroskopi (olja-röd O färga)
- ta bort formaldehyd och tvätta gelerna med 100 µL av 50% (v/v) metanol för 5 min och sedan 100 µL 78% (v/v) metanol för 15 min.
Obs: Färgning stegen kan utföras på en arbetsbänk och inte i ett klass II Biohazard skåp. - Fläcken för lipid droppar genom att lägga till 100 µL av nylagade 0,2% (w/v) olja-röd O (se Tabell av material för detaljer) för 1 h i rumstemperatur.
- Ta bort överflödigt fläcken genom att tvätta gelerna 4 gånger med 100 µL av 78% (v/v) metanol, aspirera och kasta bort supernatanten efter varje wash.
- Kontrollfärg för 15 min vid rumstemperatur med 100 µL av Giemsa, spätt 1:10 i destillerat vatten.
- Aspirera Giemsa fläcken och tvätta geler en gång med vatten.
- För att lossa gelerna från plattan, fälg brunnarna med en 21 G kanyl med den fasade kanten utåt, runt kanten på gelen.
- Att montera gelerna på ett objektglas, slå två hål (6,35 mm diameter) i en 2.54 cm x 1,5 cm remsa av dubbelhäftande tejp. Fixa bandet till en standard Mikroskop sida och ta bort den skyddande beläggningen uppifrån.
- Lägg till en droppe vatten i hålen i bandet med överföring pipett. Använda pincett, försiktigt att överföra geler till hålen i band och täcka med en storlek 1,5 täckglas. Tryck försiktigt på täckglaset att följa det tejpen.
- Granska med differentiell störningar kontrast ljusa fält mikroskopi med 40 X objektiv på ett inverterat Mikroskop.
- Bring den HUVEC enskiktslager i fokus på 40 X förstoring och rulla ' i ' i gel, räknar makrofager/skum celler i hela hela djupet av gelen. Upprepa för tre distinkta synfält ligger på liknande avstånd från kanten av gelen för att minimera möjliga kanteffekter. Detta kommer att säkerställa gel djup är konsekvent mellan räknar regioner.
Obs: Poäng celler i gel som antingen skumceller (definierat som celler som innehåller > 1/3 av cytoplasman som olja-röd O målat lipid droppar) eller makrofager inom 2 h fastsättning på diabilder ( figur 2). Skum-cellbildande uttrycks som en procentsats av skumceller i förhållande till det totala antalet migrerade celler och uttrycks som median räknas i 3 synfält undersöks för 6 geler per tillstånd, därför en median på 18 mätningar per tillstånd. Ett exempel av rå blodkroppar från en typisk experiment visas i tabell 2.
Obs: Klassificera en cell som en skum cell vs makrofag av mikroskopi är subjektiva och följaktligen kan utredaren-beroende. I kliniska studier, där experiment utförs över en längre tidsperiod, är det viktigt för alla inventering utföras förblindade av en enskild utredare. Exempel på skumceller och makrofager i geler anges i figur 2.
- Bring den HUVEC enskiktslager i fokus på 40 X förstoring och rulla ' i ' i gel, räknar makrofager/skum celler i hela hela djupet av gelen. Upprepa för tre distinkta synfält ligger på liknande avstånd från kanten av gelen för att minimera möjliga kanteffekter. Detta kommer att säkerställa gel djup är konsekvent mellan räknar regioner.
7. Analys av livslopp celler av Flow flödescytometri
- till fenotypiskt karakterisera skumceller och makrofager efter transendothelial migration, smälta gelerna genom att lägga till 100 µL av 37 ° C föruppvärmd 1 mg/mL kollagenas D utspätt i M199 till Vart väl och inkubera i 20 min på 37 °C/5% CO 2.
Obs: Placera 96 brunnar plattorna direkt på ren metall rack i inkubatorn att säkerställa jämn värmefördelning. - Efter inkubation, lös upp de geler som använder en 200 µL pipettspetsen och inkubera i ytterligare 20 minuter vid 37 °C/5% CO 2.
- En gång helt rötas, filter och pool smält replikera gelerna genom 35 µm nylon mesh utjämnade FACS rören placeras på isen, och tvätta en gång med FACS tvätta (se tabell material) vid 4 ° C, 300 x g. resuspendera cellerna i 100 µL av FACS Wash.
- Inkubera resulterande cellerna med fluorophore-konjugerade antikroppar specifika för CD45, live/dead cell markör och ytan/intracellulära fenotypiska eller funktionella markörer av intresse med standard flöde flödescytometri protokoll.
Obs: Förbereda kontroll rör för ersättning med hjälp av lämpliga fluorophores och Ig ersättning pärlor. Extraherade celler kan också samlas in på objektglas för immunofluorescens mikroskopi av cytospinning. Alternativt kan vi framgångsrikt har samlat celler använder det här protokollet för bedömning via imaging flödescytometri. - Förvärva celler med hjälp av en flödescytometer och utföra kompensation som krävs.
Obs: Eftersom skum celler/makrofager inte kan bilda enskilda populationer med hjälp av ljusspridning egenskaper och kan variera avsevärt i storlek och form, ange liberala framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) grindar för att fånga alla migrerade celler som visas i < stark klass = ”xfig” > figur 3A. - Efter förvärvet, utföra dataanalys med flöde flödescytometri programvara. För att identifiera migrerade celler, först markera celler som negativa för live/dead markören som visas i figur 3B. Nästa, utföra en encellig diskriminering genom att skapa en tight grind runt celler visas på en SSC-området vs SSC-höjd tomt.
- Välj CD45 + celler och utfärda utegångsförbud för den stora befolkningen av migrerade celler som finns i en FSC/SSC tomt eftersom dessa makrofager/skummacellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantifiera monocyt själavandring
Monocyter läggs till modellen som beskrivs i figur 1och sex geler är förberedda för varje villkor. Monocyter för 6 geler per givare (dvs5,0 x 104 monocyter per gel 6 geler = 3,0 x 105 monocyter per givare) är resuspended till en slutlig volym av 600 µL av M199 media som innehåller den nödvändiga serum/isolerade lipid. Celler (dvs, 100 µL per gel = 5,0 x 104 monocyter) är då aliquoted på geler och ruvade enligt ovan för 1 h att underlätta monocyt själavandring. Efter själavandring, icke-livslopp celler räknas som ovan. I det här exemplet återfanns 1,5 x 104 icke-livslopp celler. Procentandelen av framåt själavandring bestämdes med hjälp av formlerna som beskrivs i steg 5,4:
Efter 48 h för inkubation återfanns 3,6 x 104 omvänd livslopp celler som ovan. Procentandelen av omvänd själavandring bestämdes med hjälp av formeln i steg 5,8:
Framåt och bakåt själavandring kan jämföras mellan villkor med hjälp av lämpliga statistiska tester och monocyter beredd från flera oberoende givare för att avgöra huruvida monocyt själavandring förmåga ändras mellan experimentell villkor.
Utvärderande skum-cellbildande
Brightfield mikroskopi
Oxiderade lipoproteiner är kända för att främja monocyt-derived skum cell formation in vitro- i jämförelse med ooxiderade lipider15. Här bekräftar vi att behandling av monocyter med oxLDL, används vanligen för att framkalla skum cell bildas i konventionella skum induktion cellmodeller, förbättrar monocyt-derived skum cellnybildningen i denna modell av transendothelial migration och skum cellbildande jämfört med infödda LDL. Efter monocyt själavandring och skum cellnybildningen i geler inkuberas med M199 innehållande 50 µg/mL modersmål eller CuSO4-oxiderat LDL (se steg 5.1, figur 1), celler analyserades av mikroskopi. Exempel på skumceller och makrofager som observerats i representativa experiment visas i figur 2. Cellerna räknades i tre olika fält per gel, genom att fokusera på den HUVEC enskiktslager och successivt fokusera djupare in i gelen. Blodkroppar registreras för varje givare som visas i tabell 2 för en enda donator, att jämföra andelen skumceller bildas i svar att oxideras och infödda LDL. Aggregerade uppgifter från n = 12 oberoende räknas visas i figur 4 bekräfta att inkubation av monocyter med oxLDL i denna modell inducerar mer skum-cellbildande än villkor där monocyter inkuberas med infödda LDL eller M199 media ensam.
Flödescytometri
För att avgöra fenotypen av migrerade celler, celler extraheras från smält geler och märkt med en standard flöde flödescytometri panel. Cellerna var märkt med en live/dead cell markör och antikroppar specifika för CD45 och andra surface fenotyp markörer med standard flöde flödescytometri protokoll. Ersättning kontroller måste även förberedas för full ersättning enligt standard flöde flödescytometri tekniker. Migrerade celler är gated som visas i figur 3 i tomter representativa 10 oberoende experiment. Levande celler är gated med live/dead cell livskraft analyser (figur 3B) och midjekort jacka utesluts genom enstaka cell analys (figur 3 c). Celler är sedan gated som CD45+ för att utesluta HUVEC (som dessa celler är CD45-, figur 3D). Stora befolkningen är sedan gated av framåt scatter/side scatter diskriminering (figur 3E) och genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) av receptorer av intresse bestäms i jämförelse med antingen fluorescens minus en (FMO) eller isotypen styra) Figur 3F) att bestämma uttryck (ΔMFI) eller andelen positiva celler.
Figur 1 : En in vitro- modell av monocyt själavandring och skum cellnybildningen. (A) PBMC, (B) total monocyter eller (C) FACS-sorterade monocyt delmängder läggs till typ I fibrösa kollagen geler bildades 96 brunnar och överdrog med en enskiktslager av aktiverade primära mänskliga umbilical ven endotelceller (HUVEC), vars integritet kan bedömas av silver färgning ()D) och (E) transmigrate för 1 h i närvaro av serum eller lipid-innehållande media. Icke-livslopp celler räknas (F) och geler inkuberas för en ytterligare 48 h med den samma serum/lipid-innehållande media. Efter inkubation, (G) omvänd migrerade celler räknas och procentandelen av skummacellerna vs. makrofager i gel bestäms av (H) fas kontrast mikroskopi efter färgning med olja-röd O eller den fenotyp av migrerade celler bestäms av (jag) flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Exempel på skumceller och makrofager i en in vitro- modell av monocyt själavandring och skum cellnybildningen. RepresentatIve exempel på celler som skum celler (vita pilar) och makrofager (svarta pilar) efter Giemsa färgning för att visualisera cellerna och olja-röd O färgning att visualisera lipid droppar som bestäms av fas kontrast mikroskopi av extraherade geler med en inverterad Mikroskop med 40 X förstoring. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Gating strategi livslopp celler av flödescytometri. Livslopp celler är fenotypiskt kännetecknas av flödescytometri efter utvinning av celler från geler. Celler är inhängnad av (A) FSC/SSC, (B) levande celler, (C) enstaka celler, (D) CD45+, (E) FSC/SSC och (F) uttryck för receptorn jämfört isotypen eller fluorescens minus en (FMO) kontroll. Uttryck av receptorer av intresse definieras som medelvärdet fluorescensintensiteten (MFI) och uttryckt med avseende på nivåer av isotypen. ΔMFI = Stain (MFI) minus isotypen/FMO kontroll (MFI). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Effekt av exogent extra oxLDL och LDL på monocyt-derived skum cellnybildningen. Skum-cellbildande bestäms under förhållanden där monocyter från en enda donator inkuberas med media (M199) 50 µg/mL ooxiderade low-density lipoprotein (LDL) eller koppar (II) sulfat oxiderat LDL (oxLDL) tillsätts geler efter själavandring. Räkningarna för 12 distinkta platser visas. Skummacellerna är uttryckt i procent av totala migrerade celler. Median-och interquartile visas i stapeldiagram och jämförelser gjordes med icke-parametriska Mann-Whitney U test. p < 0,001, *** p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | [Lager] | [Slutlig] | Volym för 60 geler (µL) |
| NaOH | 100 mM | 35,7 mM | 1071 |
| M199 | 10 x | 0,71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4.58 mM | 687 |
| Kollagen | 5 mg/mL | 1.71 mg/mL | 1029 |
| Totala volymen | - | - | 3000 |
Tabell 1: Typ I fibrösa kollagen gel förberedelse
| LDL | oxLDL | |||||||
| Gel | Greve | Skum-celler1 | Migrerade celler1 | Skum celler (%)2 | Skum-celler1 | Migrerade celler1 | Skum celler (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11,4 | 26 | 55 | 47,3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18,5 | 10 | 23 | 43,5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21,2 | 19 | 39 | 48,7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14,7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58,2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13,5 | 19 | 37 | 51,4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53,8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21,2 | 11 | 31 | 35,5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18,4 | 28 | 53 | 52,8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20,5 | 14 | 33 | 42,4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21,2 | 22 | 47 | 46,8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36,7 | ||
| Median skumceller (%) | 20,8 | 47 | ||||||
| Genomsnittliga skumceller (%) | 19,8 | 45,5 | ||||||
Tabell 2: Raw blodkroppar från jämförelse av monocyt-derived skummacellerna efter LDL vs oxLDL behandlingar. 1 Blodkroppar per synfält i gel. 2 Procentandel av skummacellerna = skum cell räknas/total migrerade blodkroppar x 100. * Data är representativa för ett experiment med hjälp av monocyter från en enda donator
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här erbjuder en mångsidig och fysiologiskt relevanta metod för att bedöma atherogenicity av monocyter från mänskliga kliniska kohorter, genom att kombinera både monocyt själavandring och skum cellnybildningen. Denna modell erbjuder fördelar jämfört med alternativa metoder för skum-cellbildande eftersom det tar hänsyn till effekten av monocyt själavandring på skum cellnybildningen och tillåter mätning av omvänd själavandring6 utöver de inneboende benägenhet av monocyter att mogna till skumceller i närvaron eller frånvaron av yttre faktorer. Dessutom är rollen av endothelial aktiveringen också beaktas som vi har visat att endotelceller aktiveringen uppreglerar oxidation av lipid arter som associeras med skum cell formation14. Slutligen, fenotypen av monocyter som genomgår avstigning (en egenskap som är associerad med plack regression) kan kvantifieras och kännetecknas av mikroskopi och flöde flödescytometri.
Tredimensionella pågrund av transmigration in geler, identifiera och scoring transmigrated cellerna som skumceller eller makrofager kan vara svårt som celler transmigrate till olika nivåer i gel19. För att underlätta identifiering av skummacellerna, måste färsk olja-röd O fläck alltid användas. Det är också att notera att olika ex vivo sjukdomstillstånd eller in vitro- villkor ändra monocyt själavandring i gelen. Vi har använt levande cell imaging för att identifiera att monocyter från HIV-infekterade individer tenderar att transmigrate grundare punkterna i geler och olika hastigheter än de från icke-infekterade individer19. Dessutom skum cellnybildningen är associerad med mindre monocyt motilitet i gel så celler tenderar att gå i cirklar på ett visst z-avsnitt i jämförelse med celler från HIV-infekterade individer som tenderar att migrera i en relativt rak linje mot den botten av gelen. Dessa fynd höja möjligheten av ett liknande fenomen som förekommer i experiment med mänskliga patientprover från andra sjukdomstillstånd som är associerad med ökad monocyt atherogenicity.
När du utför flöde flödescytometri-baserade analyser är det vanligt att iaktta en betydande andel av döda celler i återvunna cell befolkningen vid bedömningen av lönsamheten med live/dead cell märkpennor (figur 4B). Dessa celler är huvudsakligen CD45– HUVEC som är skadade under kollagen nedbrytning/maceration steg krävs för att extrahera monocyt-derived celler från kollagen matris. Denna process är särskilt hård mot den HUVEC enskiktslager, men är inte skadligt för fenotypning transmigrated cellerna.
Denna modell skiljer sig från andra i att inget artificiellt oxiderat exogena lipid krävs i kultur media drive monocyt-derived skum cell bildas. I stället är skum cellnybildningen i denna analys influerad av serumet i kultur media, möjliggör diskret effekterna av lösliga faktorer från kliniska prover som ska utvärderas. Som sådan, har vi visat att inkubation av kontroll monocyter med serum från ung HIV-infekterade19 eller äldre HIV-infekterade20 individer främjar skum cell formation, vilket indikerar att lösliga faktorer självständigt kan främja skum cellnybildningen. Som analysen påverkas av lösliga komponenter, måste ett parti av poolade humant serum användas för experiment som syftar till att fastställa inneboende skillnaden av aterogena egenskaper hos monocyter som härrör från olika individer för att standardisera villkor för kontroll. Denna analys kan också användas för att utvärdera rollen av särskilda lipid arter från kliniska prover (figur 3). Exempelvis har vi hittat denna inkubation av monocyter med media som innehåller isolerade lipid arter såsom med hög densitet lipoproteiner från individer med känd lipid dysfunktion24 främjar också skum cellnybildningen. I det här fallet kan monocyter från en frisk individ eller grupp av individer användas i närvaro av serum eller serum faktorer härrör från försökspersoner. Därför kan denna modell för specifika frågor ställas avseende diskreta effekter av både lösliga och cellulära komponenter på skum cellnybildningen.
Denna analys använder HUVEC som en modell av kranskärl endotel på grund av de praktiska svårigheten att få stora antalet låg passage nummer primär koronar celler. Men vi har jämfört resultaten från analyser med både mänskliga kranskärl endotelceller eller HUVEC och observerade liten skillnad i monocyt själavandring eller skum cell bildandet (inga data anges), vilket tyder på att användning av HUVECs i detta system är en godtagbart substitut. Manuell räkning av skummacellerna är en begränsande faktor i denna modell eftersom det kan införa operatören bias. Därför måste alla prover monterad på diabilder förblindas till operatören för att undanröja risken för partiskhet. Vi har, dock jämfört med skum-cellbildande mätt genom manuell räkning och av imaging flödescytometri och fann att dessa metoder ger liknande resultat19. En viktig begränsning av denna modell är att monocyt adhesion och migration inträffar i frånvaro av skeva styrkor associerade med fysiologiska blod flöde i vivo. Vi hypotes att skeva flöde huvudsakligen kommer att påverka monocyt själavandring och inte efterföljande skum cell formation inom matrisen; Detta måste dock beaktas vid tolkningen av resultaten från denna analys. Denna analys också modell inte påverkan av glatta muskelceller i monocyt-derived skum cell formation som är en fysiologisk begränsning av systemet; Detta är dock konsekvent i alla förhållanden så att monocyter diskret aterogena potential att jämföras mellan olika sjukdomstillstånd.
Sammanfattningsvis ger denna modell en mångsidig och fysiologiskt relevanta metod för att kvantifiera monocyt själavandring och skum cell formation från mänskliga prover i olika sjukdomen staterna ex vivo. Denna modell har ytterligare program för utvärdering av monocyter benägenhet att bilda skumceller i förhållanden där monocyt atherogenicity är associerade med ökad risk för CAD såsom fetma25, diabetes26 och kronisk njursjukdom sjukdom27. Denna modell kan därför också vara optimerad för användning i sjukdomstillstånd än åderförkalkning där cellulära själavandring kan påverka sjukdomspatogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt Prof. William Muller och Dr. Clare Westhorpe arbete för deras nyckelroll i utvecklingen av tidigare iterationer av denna modell. Författarna vill även tacka AMREP Flow flödescytometri kärnan för sortering av monocyt underdelar och Alfred Hospital infektiös sjukdom enheten klinisk forskning sjuksköterskor för rekrytering av HIV + individer för vissa studier. Författarna erkänner tacksamt bidrag till detta arbete Victoria operativa infrastrukturen supportprogrammet fick av Burnet Institute. TAA stöds av en RMIT University rektors postdoktorsstipendium. Detta arbete stöds av NHMRC projektbidrag 1108792 tilldelas AJ och AH. TK stöds av NIH beviljar NIH K08AI08272, NIH/NCATS bidrag nr UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
- Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
- Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
- Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038 (2016).
- Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
- Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
- Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
- Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
- Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
- Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N.
- Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
- Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
- Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
- Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).
