Vi beskriver ett protokoll för att mäta transmigration av monocyter över mänskliga endothelial enskiktslager och deras efterföljande mognad i skumceller. Detta ger en mångsidig metod att bedöma de aterogena egenskaperna hos monocyter isolerade från personer med olika sjukdomstillstånd och utvärdera faktorer i blodet vilket kan öka denna benägenhet.
Kranskärlssjukdom (CAD) är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Åderförkalkning, en ledande orsaken till CAD, initieras av transmigrationen av medfödd immun monocyter till inflammatoriska webbplatser av deponerade lipid kallas feta streck, som finns i kärlväggarna av medelstora till stora artärer. Lesioner i detta tidiga skede av åderförkalkning patogena utomhusmiljö är mognaden av monocyter som migrerar in artärerna att bilda skumceller eller lipid-lastad makrofager. Betydande bevis stöder hypotesen att ökad risk för åderförkalkning av kroniska inflammatoriska sjukdomar som åtföljer sjukdomar såsom reumatoid artrit och HIV, samt allmänna åldrande och att denna risk förutspås av monocyt aktivering. Medan musmodeller ger en bra plattform för att undersöka betydelsen av monocyter i aterogenes i vivo, de kräver genetisk ändring av naturliga kolesterol metabolism och drastisk ändring av normal mus Dieter, och har begränsad lämplighet för studien av aterogena influenser av mänskliga samtidiga sjukdomar. Detta motiverade oss att utveckla en mänsklig in vitro- modell för att mäta aterogena potential av monocyter isolerade från individer med definierade sjukdomstillstånd. För närvarande begränsar mänsklig in vitro- modeller i att de utvärderar monocyt själavandring och skum cellnybildningen i isolering. Här beskriver vi ett protokoll där monocyter isolerade från patientens blod transmigrate över mänskliga endothelial celler till en typ 1 kollagenmatrisen, och deras benägenhet att mogna till skumceller i närvaro eller frånvaro av exogena lipid mäts. Protokollet har validerats för användning av humana monocyter renats från individer med HIV-infektion och äldre HIV infekterade individer. Denna modell är mångsidig och tillåter monocyt själavandring och skum cellbildande utvärderas med hjälp av antingen mikroskopi eller flödescytometri samt gör att bedömningen av aterogena faktorer förekommer i serum eller plasma.
Monocyt själavandring är ett viktigt steg i utvecklingen av aterosklerotiska plack som kan leda till Trombos, stroke och hjärtinfarkt. Aterosklerotiska plack utvecklas från feta ränder, allmänhet närvarande vid platser av låg oscillerande blodflödet i medium till stora artärer, där deponerade lipid bidrar till endotel aktivering och lokaliserad inflammation1. Monocyter rekryteras till endotelceller i feta streck via monocyt kemotaktisk proteiner (t.ex. CCL2) och transmigrate i den intima2. Efter själavandring, kan monocyter bilda aterogena, lipid-lastad makrofager kallas skumceller till följd av lipid upptag, lipid syntes, down-förordning av kolesterol efflux eller en kombination av ovanstående faktorer. Monocyter kan även ackumuleras lipider i cirkulationen och har en ‘skummande’ fenotyp, möjligen predisponerande celler för skum cell bildning3,4. Skummacellerna är definierande funktionen av feta ränder och tidigt stadium aterosklerotiska plack och prisbildningen påverkas av både lipid och inflammatoriska mediatorer5. Alternativt, monocyter har förmågan att vända transmigrate från artär i blodomloppet6, och tar därigenom bort lipid från intima och agerar för att bevara hälsan i artären.
Att bestämma propensityen av monocyter till transmigrate över arteriell endotel och bildar skumceller i intima eller att vända transmigrate och bära lipid av plack, är en viktig förutsättning för att förstå rollen av monocyt aktivering i ökande aterosklerotisk risk. Musmodeller av CADs såsom åderförkalkning är viktiga att belysa i realtid i vivo information om fatty streak/aterosklerotiska plack utveckling. Dessa modeller kräver dock en genetisk förändring av den naturliga kolesterol bearbetning förmågor av dessa djur oftast i kombination med drastiska förändringar i kost (såsom ApoE-/-Western-typ kost modell)7,8, därmed, förmå icke-fysiologiskt ackumulering av cirkulerande lipid nivåer som driva plack utvecklingen. Dessa modeller kan ha begränsad relevans för kroniska inflammatoriska mänskliga sjukdomar såsom HIV-infektion som inte är associerade med ökad cirkulerande kolesterol eller low-density lipoprotein (LDL) nivåer. Dessutom skillnader i monocyt biologi mellan människor och möss gör testning av immunologiska frågor angående relevansen av subpopulationer av monocyter (såsom mellanliggande monocyter (CD14++CD16+))9 svårt. Detta är viktigt när man studerar de mekanismer som driver hjärt-kärlsjukdom som mellanliggande monocyt räknas självständigt förutsäga kardiovaskulära händelser10,11. Även analyser finns för att mäta sekventiellt antingen monocyt själavandring eller skum cellnybildningen i isolering, har inga in vitro- test validerats för att kvantifiera båda aspekter av tidig aterogenes med samma celler från kliniska kohorter. Transwell modeller använder en modifierad Boyden tvåkammarsystem där celler läses in den övre kammaren och transmigrate över en porös plast barriär eller cell enskiktslager i en nedre kammare som normalt innehåller media med korrektiv12 , 13. samtidigt som ofta används för att analysera leukocyt själavandring, dessa modeller inte generellt införliva ett lager som representerar intima, vilket resulterar i livslopp cellerna migrerar till lösning, och Tillåt inte för mätning av skum cell bildning eller omvänd transmigration av samma celler. Modeller av skum-cellbildande däremot inte hänsyn till eventuella transmigratory-inducerad ändringar monocyter eller effekterna av endothelial aktivering som är kända för att bidra till att skum cell formation14. Dessutom dessa system inducera skum cell formation från makrofager följs cell kultur plattor av tillägg av mättar koncentrationer av exogena oxiderat LDL (oxLDL)15,16, en nyckel inducerare foam cell bildas. LDL som används i dessa modeller är ofta oxideras av icke-fysiologiskt-relevanta processer såsom CuSO4 behandling17, därför ifrågasätta den fysiologiska betydelsen av studier med hjälp av dessa modeller.
Här beskriver vi en analysmetod som kvantifierar monocyt själavandring och skum cell bildandet av samma celler som inte kräver tillsats av EXOGEN oxLDL, således bättre modellering rollen av monocyter i skum cell formation. Denna modell har ursprungligen utvecklats av Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18, och har varit förfinas ytterligare i vårt laboratorium att bedöma ex vivo atherogenicity av monocyter isolerade under icke-aktiverande villkor från individer med underliggande inflammatoriska tillstånd åtfölja sjukdomar såsom HIV infektion19 samt åldrande20, som är associerade med en ökad risk för åderförkalkning. Denna modell ger också en plattform för att besvara grundläggande biologiska frågor angående benägenheten för olika monocyt delmängder till formuläret skum celler20, påverkan av endothelial aktivering av cytokiner såsom TNF på skum-cellbildande14 , och flyttande egenskaperna av monocyter såsom djup och hastighet själavandring i geler19. Dessutom monocyt själavandring och skum cellbildande kan kvantifieras med standard mikroskopi, live cell imaging, flow flödescytometri och imaging flödescytometri, därför att ge en mångsidig metod för att utvärdera rollen av monocyter i aterogenes.
Protokollet beskrivs här erbjuder en mångsidig och fysiologiskt relevanta metod för att bedöma atherogenicity av monocyter från mänskliga kliniska kohorter, genom att kombinera både monocyt själavandring och skum cellnybildningen. Denna modell erbjuder fördelar jämfört med alternativa metoder för skum-cellbildande eftersom det tar hänsyn till effekten av monocyt själavandring på skum cellnybildningen och tillåter mätning av omvänd själavandring6 utöver de inneboende benägenhet…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt Prof. William Muller och Dr. Clare Westhorpe arbete för deras nyckelroll i utvecklingen av tidigare iterationer av denna modell. Författarna vill även tacka AMREP Flow flödescytometri kärnan för sortering av monocyt underdelar och Alfred Hospital infektiös sjukdom enheten klinisk forskning sjuksköterskor för rekrytering av HIV + individer för vissa studier. Författarna erkänner tacksamt bidrag till detta arbete Victoria operativa infrastrukturen supportprogrammet fick av Burnet Institute. TAA stöds av en RMIT University rektors postdoktorsstipendium. Detta arbete stöds av NHMRC projektbidrag 1108792 tilldelas AJ och AH. TK stöds av NIH beviljar NIH K08AI08272, NIH/NCATS bidrag nr UL1TR000124.
Gel preparation reagents | |||
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
10X M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – 0.5 M, pH 8.0 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) – 1 mM, pH 8.0 |
0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin – 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
PBS (1X) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10X): Dilute to 1X with sterile H20 |
0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF – Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopy | |||
1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry | |||
Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS–, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasticware | |||
96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |