Neuroscience

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/56297

Xiaojing Lin^1,2, Tingbao Zhao³, Wenhui Xiong¹, Shaonan Wen⁴, Xiaoming Jin¹, Xiao-Ming Xu¹

¹Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman and Campbell Brain and Spine, Department of Anatomy and Cell Biology, Indiana University School of Medicine, ²Department of Spinal Cord Injury and Repair, Trauma and Orthopedics Institute of Chinese PLA, General Hospital of Jinan Military Region, ³Department of Orthopedics, Shandong Cancer Hospital, Shandong University, ⁴Department of Neurobiology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy Military Medical Sciences

Summary

يصف لنا إجراء تجريبي لقياس نشاط الخلايا العصبية من خلال النوافذ الضوئية المزدوجة أعلاه الثنائية كورتيسيس الأولية somatosensory (S1) في Thy1-GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا باستخدام 2-فوتون (ف 2) الفحص المجهري في فيفو.

Abstract

معارض الدماغ الثدييات تماثل ملحوظ عبر الطائرة السهمي. ومع ذلك، وصف مفصل لديناميات العصبية في مناطق الدماغ متماثل في الحيوانات الثديية الكبار لا يزال بعيد المنال. في هذه الدراسة، يصف لنا إجراء تجريبي لقياس ديناميات الكالسيوم من خلال النوافذ الضوئية المزدوجة أعلاه الثنائية كورتيسيس الأولية somatosensory (S1) في Thy1-GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الفحص المجهري (ع 2) 2-فوتون. هذا الأسلوب من التسجيلات وكوانتيفيكيشنز للنشاط العصبي في مناطق الدماغ الماوس ثنائي واحد في وقت في التجربة نفسها لفترة طويلة فترة في فيفو. وتشمل الجوانب الرئيسية لهذا الأسلوب، الذي يمكن أن تكتمل في غضون ساعة، الجراحات الإجراءات لإنشاء windows الضوئية المزدوجة، واستخدام التصوير ف 2. على الرغم من أن نظهر فقط التقنية في مجال S1، يمكن تطبيق الأسلوب إلى مناطق أخرى من الدماغ المعيشة تسهيل توضيح تعقيدات الهيكلية والوظيفية للشبكات العصبية في الدماغ.

Introduction

الكالسيوم ولائحته ضرورية في التوسط في عمليات فسيولوجية متعددة. رصد ديناميات الكالسيوم مفيد لفهم وظيفة المخ المعتادة، فضلا عن الحالات المرضية في الدماغ اضطرابات ¹^،²^،³^،^،من⁴⁵^،⁶ ^،^،من⁷⁸. التصوير الأسفار GCaMP6s أداة قوية للتحديد الكمي لأرقام سبايك، توقيت، والتردد، فضلا عن مستويات متشابك المدخلات في المختبر و في فيفو ⁹^،^،من¹⁰¹¹.

معارض الدماغ الثدييات تماثل ملحوظ عبر الطائرة السهمي. على الرغم من أن البحوث العصبية الأخيرة قد ألقي الضوء على يعيد البناء القشرية ونشاط الخلايا العصبية الناجمة عن صدمات الدماغ أو النخاع الشوكي إصابة ⁶^،⁷، الأدوار تلك الأنسجة سليمة من شكل متناظر تلعب المناطق المقابلة في الانتعاش، لا تزال غامضة.

في هذه الدراسة، ونحن تصف الإجراءات التجريبية لإنشاء windows البصري متماثل الثنائية للتصوير في فيفو . استخدام هذه النوافذ الضوئية، ونحن تصف قياس ديناميات الكالسيوم من كورتيسيس الأولية somatosensory (S1) في الفئران المعدلة وراثيا GCaMP6s استخدام الفحص المجهري ف 2. في المقطع "النتائج"، نعرض أيضا في فيفو مورفولوجيا الجذعية في نقاط زمنية مختلفة في منطقة S1 في الفئران المعدلة وراثيا اجفب استخدام التصوير ف 2. أسلوب المراقبة فيما يتعلق بديناميات الشبكة في المجالات الثنائية S1 ولكن مثال أولى كيف المزدوج ويندوز الجمجمة مفتوحة سوف يساعد علماء الأعصاب للتحقيق المحلي ومتماثل معالجة المعلومات في الدماغ الثدييات الكبار في العادي الظروف أو في أمراض مختلفة النماذج في فيفو.

Protocol

وأجريت جميع إجراءات معالجة جراحية والحيوانية كما وافقت تحت الدليل للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المجلس القومي للبحوث) والمبادئ التوجيهية "إنديانا جامعة كلية للطب المؤسسية الحيوان الرعاية" والاستخدام اللجنة. ويرد في الشكل 1الشكل التخطيطي للإعداد 2-فوتون التصوير.

1. إعداد الحيوان للتصوير

ضع شاش معقم ومسحات القطن، ويعقم الأدوات الجراحية في مجال جراحة (الجدول 1). قم بتشغيل "معقم حبة صغيرة" لتعقيم الأدوات الجراحية إينتيرسورجيري.
تخدير الماوس (ذكرا كان أو أنثى، 1.5 – 2.5 أشهر، 20-25 غ) عن طريق الحقن داخل (القائمة) من خليط من الكيتامين (17.2 مغ/مل)، إكسيلازيني (0.475 مغ/مل) و acepromazine (0.238 mg/mL) (ميليلتر/ز 6 وزن الجسم). انتظر حتى يتم الوصول إلى عمق مناسب للتخدير عند الحيوان يتوقف عن الاستجابة إلى حافز قرصه تو ولا منعكس القرنية وقد. أثناء الجراحة، إعطاء جرعة معززة من 1/3 الأصلي جرعة مخدر كوكتيل كاللازمة للحفاظ على الدولة مخدر الأصلي.
حقن البوبرينورفين تحت الجلد (الليبي; 0.05 – 0.10 ملغم/كغم) كعامل مسكن قبل الجراحة. تطبيق مرهم واقية لعيون الحيوان لمنع تشكيل القرنية التجفيف وإعتام عدسة العين.
ضع ماوس GCaMP6s المعدلة وراثيا على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم وتغطية ذلك مع ثني جراحية معقمة. تثبيت رأس الحيوان مع "محول رئيس القابضة" للفئران.
حلق الرأس على مدى معظم فروة الرأس مع شفرة حلاقة حافة مزدوجة. تنظيف المنطقة الجراحية مع منصة إعداد الكحول عقيمة تليها حل بوفيدون.

2-إعداد إطار الجمجمة المزمن

جعل قطع مستطيلة من فروة الرأس (2 مم × 3 مم) مع زوج من مقص على أحد جانبي (إلى اليمين) الجمجمة. دفع الجلد جانبا مع مسحه القطن لإنشاء مساحة تعرض > 3 مم في القطر (الشكل 3A). إزالة النسيج الضام تعلق في الجمجمة بلطف كشط الجمجمة بشفرة microsurgical حادة (مشرط بليد #10؛ الشكل 3).
علامة منطقة S1 برسم دائرة بلطف (3 مم في القطر، ومركز التنسيق: مم-1.50 من بريجما و 2.5 ملم من خط الوسط) في الجمجمة باستخدام الأسنان حفر (الشكل 2).
تنفيذ نفس الإجراء في الجمجمة الأيسر (الشكل 2).
تطبيق طبقة رقيقة من الغراء سوبر Cyanoacrylate العظام لتوفير قاعدة لتطبيق الأسمنت الأسنان.
تحت مجهر تشريح، رقيقة أسفل أخدود دائري في الجمجمة حول منطقة S1 استخدام ميكرودريل عالية السرعة (3D الشكل). والغرض من ذلك إنشاء حافة ناعمة لوضع إطار بصري على ذلك.
مرارا وتكرارا تطبيق السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام، درجة حرارة الغرفة) للجمجمة دورياً أثناء عملية رقيق تسهيل الحفر وتبديد الحرارة. القيام الحفر بشكل متقطع لتجنب الاحتكاك الناجمة عن ارتفاع درجة الحرارة. مص بعيداً الحطام العظام مع خط فراغ بيت أو مضخة فراغ.
بعد حفر حوالي 2/3 في العمق للعظام، ببطء وبعناية رقيقة العظم 1/3 المتبقية حتى قطعة دائرية من الجمجمة (رفرف العظام) خال تماما من الجمجمة المحيطة بها.
ببطء وبعناية إزالة رفرف العظام التعميم مع زوج من الملقط # 5/45، وفضح دوراً (الشكل 2؛ 3E الشكل).
إبقاء المنطقة يتعرض الدماغ رطبة مع قام (3E الشكل). تجنب أي ضرر لسفن بيل، حيث سوف تغير تدفق الدم الدماغي نزف والتعجيل بتورم الدماغ وشدة تدهور جودة التصوير.
تنفيذ نفس الإجراء على الجانب الأيسر من الجمجمة (كونترالاتيرال).
لتجميع الإطار البصرية، استخدام لاصق الضوئية للغراء والعلاج بين طبقات كوفيرجلاس واحد في وقت واحد. إذا لزم الأمر، الحارة النافذة الضوئية في حاضنة لتعزيز ارتباط لاصق (50 درجة مئوية، ح 12). الإطار بصري يحتوي على 2 أجزاء: الجزء العلوي يحتوي على تغطية زجاج جولة واحدة يبلغ قطرها 5 مم والجزء السفلي يحتوي على 1 – 3 جولة غطاء النظارات التي يبلغ قطرها 3 مم (الشكل 2D).
تخزين الإطار البصرية في الإيثانول (70%، المجلد/المجلد) وشطفه مع المحلول الملحي المعقم قبل الاستخدام. قبل تركيب الإطار البصرية، تحقق الإطار البصري للعيوب، بما في ذلك مقدار المحاذاة الضوئية لاصقة أو غير دقيقة تحت ستيريوسكوبي صحيحة.
تثبيت النافذة الضوئية عبر منطقة اوديما (الشكل 2D). تقع على الجزء العلوي من النافذة الضوئية في الجمجمة والجزء السفلي من النافذة الضوئية تتناسب مع افتتاح كرانيوتوميزيد وتقع في دوراً حضور الخدمات القطرية (الشكل 2D، هاء).
ختم الجزء العلوي من حافة نافذة ضوئية في الجمجمة مع الغراء سوبر Cyanoacrylate (الشكل 2 واو؛ 3F الشكل).
عندما قد جفت الغراء سوبر Cyanoacrylate، تطبيق الأسمنت الأسنان السوداء (دينتسبلي) لتغطية حافة الزجاج. تطبيق الأسمنت طب الأسنان لجميع الجمجمة المكشوفة والجرح بهوامش لحجب الضوء (الشكل 2-ح؛ الشكل 3).
تنفيذ نفس الإجراء على الجانب الأيسر.
السماح للحيوان استرداد على لوحة تدفئة وإرجاع الحيوان إلى قفصة المنزل للانتعاش تحت الرصد المناسبة. توفير الغذاء الرطب لتسهيل مضغ وترطيب. للحد من الألم، إدارة البوبرينورفين الليبي (0.05 – 2.0 مغ/كغ) كل بوستينجوري ح 8 – 12 لمدة يومين. تسمح الماوس لاسترداد لمدة 7 – 10 يوما إضافيا قبل التصوير.

3-اثنين-فوتون التصوير

في يوم التجربة، تخدير الحيوان مع الكيتامين و xylazine (جرعات والصيانة للتخدير كما هو موضح أعلاه). قم بتنظيف النافذة الجمجمة مع الإيثانول 75% (المجلد/المجلد).
ضع الماوس إطار إنشاء تصوير يتألف مجهر ف 2 و "محول عقد رأسه" يستريح على وسادة تدفئة مع رئيسها المعطل تداولها من خلال أشرطة الإذن تعلق على حامل رأس ماوس.
صورة من جانب واحد من النافذة البصرية في وقت واحد. لتقليل الانحرافات البصرية، تأكد من أن النافذة الضوئية والجمجمة الحق المنحى عمودي على المحور البصري للمجهر.
تأخذ صورة أولية للنافذة الجمجمة مع إضاءة الحقل مشرق في 4 x التكبير كخريطة مرجعية للتسجيل مع أعلى التكبير ف 2 أنجيوجرافيس (4A الشكل1).
التكبير في مجال الاهتمام باستخدام 10 x التكبير (4A الشكل2).
حدد مجالاً من مجالات الاهتمام في منطقة S1 في الطبقات القشرية الأولى أو الثانية (ما يصل إلى 150 ميكرومتر تحت السطح بيل). إذا كان المطلوب هو أعلى التكبير، استخدم هدفا X 20.
البحث عن مجال رؤية مع العديد من الخلايا العصبية. الحصول على الصور باستخدام مجهر ف 2 (الشكل 4 باء). تحديد زمن التعرض للضوء والإثارة مستوى الضوء (إيتش ناين وان زيرو nm) استناداً إلى العمق ومستوى التعبير من GCaMP6s، مع إشارات الأضعف التي تتطلب التعرض لأوقات أطول وكونكوردانتلي أقل وقت القرار. ونحن عادة استخدام المايكروثانيه ~ 4 الواحدة مرات التعرض بكسل. الحصول على الصور في معدلات الإطار 3-5 هرتز بدقة 512 × 512 بكسل.
البدء في تسجيل السلسلة الزمنية. تخزين إحداثيات كل منطقة للفائدة (ROI) بالنسبة لنمط الأوعية الدموية أو إلى جهات الاعتماد في الصور تضخم منخفض. الصورة نفس العائد على الاستثمار مع مرور الوقت. تنفيذ نفس الإجراء لمراقبة ديناميات الكالسيوم من ناحية نصف الكرة الأيسر S1. حساب التغيرات في الأسفار من كل عائدات الاستثمار.
الحصول على الصور أما منفردة أو كفيلم الوقت الفاصل بين (الشكل 41-C3، دال، هاء).
دراسة القشرية الدم تدفق القوى المحركة في فيفو بالتصوير الأصباغ الفلورية ديكستران حقن الوريد الذيل من القوارض بالفحص المجهري ف 2. استخدام فاسكولاتوريس كمعالم للاعتراف والصورة نفس العائد على الاستثمار في تصوير جلسات على مدى فترات طويلة.

4-معالجة البيانات

استخدام إيماجيج والأصل لتحليل الصور. استيراد تسلسل الصور مع إيماجيج (الشكل 5 أ-ب). بالنسبة للصور الفردية (أو تي سلسلة أفلام)، حدد العائد على الاستثمار داخل العصبية المصورة و 2 منفصل قريب مناطق لقياس الخلفية (الشكل 5). الحصول على مجموع كثافة مع وحدة إدارة العائد على الاستثمار (الشكل 5ج).
ملاحظة: ويبين الشكل 6 الصور التمثيلية الكالسيوم. الكالسيوم عابرة (الأخضر) والأوعية الدموية (أحمر) إظهار في نقاط زمنية مختلفة بالثواني (الشكل 6A-د) في ماوس في د 7 بعد تثبيت النافذة الأولى. ويرد أيضا z-الإسقاط من فترة تسجيل 3 دقيقة لقنوات الأحمر والأخضر (6E الشكل) أو قناة الأخضر (6F الشكل). ض-إسقاطات يعرض صورة مضغوطة لكل الصور في الفيلم يدوياً تختار منها حد الخام ودائرة (التي تشمل العصبية الكائن من الفائدة في كل الإطارات) فضلا عن اختيار 2 مستقلة مجاورة المناطق الخلفية ( 6 الرقم).
من كل عائد الاستثمار، حساب الخلفية الفلورية متوسط إف، إف = (FB1 + FB2)/2، والتغييرات fluorescence سوما (و) معبراً عنه ΔF/F، ΔF/F = (F-إف ب)/إف ب.
أداء تحليل ذروة خطوة بخطوة باستخدام دالات إيماجيج بما في ذلك تصحيح الأساس ذروة النتيجة/تصميم التكامل الذروة، ذروة المناسب، و وتوفير ميزات تحليل الذروة.

Representative Results

باستخدام نافذة ضوئية ثنائية، حصلنا على نتائج من تجارب منفصلة 2. التجربة الأولى لتوظيف الفئران معربا عن اجفب بصورة فاريكوسيتيس الجذعية. الشكل 4 1-3 أمثلة للصور التي تم التقاطها عند نقاط زمنية مختلفة بعد غرس نافذة ضوئية. ملاحظة أن عدد ومواقع فروع الجذعية والاشواك استقرارا ملحوظا بين آراء 2 (الشكل 4، هz-الإسقاط).

التجربة الثانية استخدم Thy1-GCaMP6s الفئران المعدلة وراثيا لقياس الكالسيوم داخل الخلايا عابرة، وبالتالي يوضح كيف يمكن قياس فسيولوجيا الكالسيوم داخل واحدة من الخلايا العصبية في فيفو (الشكل 6). يمكن استخدام هذا الأسلوب لتسجيل وقياس النشاط العفوي في السكان من الخلايا العصبية الهرمية طبقة الخامس الموجود في أنها عميقة > 500 ميكرومتر أدناه pia. ويمكن حساب متوسط الردود العفوية على مر الزمن (محسوبة كاستجابات متوسط في كل نقطة الوقت) عبر التجارب العديدة. الأسلوب 2 ف له ميزة الكشف عن النشاط في وقت واحد في السكان العصبية الكبيرة أو متفرقة على مدى فترة ممتدة مع الاضطرابات الميكانيكية قليلاً إلى الدماغ بالمقارنة مع تسجيلات مولتيليكترودي.

لإنشاء مقياس متوسط مقبول، ينصح المحاكمات 5 – 10. وسيكون عدد المحاكمات تعتمد على ردود عفوية أو تقلب الملازمة للاستجابات لحفز خاصة. إذا كانت تتبع جميع الخطوات بدقة، كما هو موضح أعلاه، باحث تدريب في كل تقنية نافذة الجمجمة جمجمة ضعفت و في فيفو 2 ف الكالسيوم تصوير ينبغي أن تكون قادرة على الحصول على تسجيلات من 100-200 من الخلايا العصبية على كلا الجانبين من الحيوانات 1-2 لليوم الواحد.

وبعد تحليل الذروة، ويمكن الحصول على مجموعة من النتائج مثل موقع حقيقي من الذروة والسعة الحقيقية والمنطقة وعرض كامل نصف الحد الأقصى (فوهم) لكل ذروة.

الشكل 1 : التخطيطي رسم توضيحي لمكونات نافذة ضوئية الجمجمة لتصوير (ع 2) 2-فوتون- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : الرسم التخطيطي يوضح الخطوات الأساسية لإعداد إطار الجمجمة. (أ) تحت مجهر تشريح، إزالة الجلد حول المنطقة الجراحية باستخدام زوج من مقص الجراحة. (ب) استخدام ميكرودريل عالية السرعة لإنتاج أخدود دائري (3 مم) في الجمجمة فوق منطقة S1 حتى العظم رفرف داخل الاخدود تصبح منفصلة عن العظام المحيطة بها. (ج) إزالة رفرف العظام لفضح دوراً الكامنة ببطء. (د) تجميع الإطار البصرية مع كوفيرجلاسيس مع 2 من أقطار مختلفة. كوفيرجلاس العليا التي يبلغ قطرها أكبر (5 مم) وقطرها أصغر (3 مم) كوفيرجلاسيس السفلي (عادة 1-3). سوف تعتمد على سمك الجمجمة سمك كوفيرجلاسيس ليتم تثبيتها. (ه) مكان كوفيرجلاس على التعميم فتح الجمجمة إنشاء إطار بصري. وينبغي أن تناسب الجزء السفلي من كوفيرجلاسيس داخل فتح الجمجمة. يجب الاتصال الجزء السفلي من كوفيرجلاسيس برفق في بلده دوراً. (و) ختم النافذة حواف في الجمجمة مع الغراء cyanoacrylate. (ز) عندما يجف cyanoacrylate، تطبيق الأسمنت الأسنان الأسود الجانبي على الحائط الغراء. (ح) تعبئة الإطار الجمجمة مع ddH₂س، واستخدام أهداف غمر المياه للتصوير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . إنشاء windows الثنائية في الجمجمة. (A) بصورة فوتوغرافية يظهر 2 الجمجمة البصرية windows على كل جانب من الجمجمة تغمر منطقة S1. (ب) عالية التكبير من منطقة محاصر في الصورة (A) عرض windows البصرية الثنائية فضح دوراً والأوعية الدموية الأساسية. شريط المقياس = 680 ميكرومتر. (ج) الجمجمة المكشوفة. (د) إنشاء الاخدود الدائري الذي يعتبر رفرف العظام مركزية. شريط المقياس = 900 ميكرومتر. (ه) بعد إزالة رفرف العظام، فتح الجمجمة كانت مليئة بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام). شريط المقياس = 720 ميكرومتر. (و) تركيب الإطار البصرية عبر فتح الجمجمة وختم على حافة النافذة مع سوبر الغراء. دوراً والأوعية الدموية مرئية من خلال النافذة الضوئية. شريط المقياس = 600 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : الكالسيوم وتصوير الجذعية. (A1) تحديد المناطق ذات الاهتمام باستخدام الأوعية الدموية (BV) كمعالم في Thy1-GCaMP6s الفئران. (A2) تحديد الخلايا المسمى نفسه (الأسهم الحمراء) على مر الزمن باستخدام نفس المعالم وسجل. (ب) ممثل Z الإسقاط من إشارات الكالسيوم في الخلايا العصبية (الأسهم الحمراء) من القشرة الأولية somatosensory (S1). شريط المقياس = 10 ميكرون. (C1-3) التصور dendrites (الأخضر) والأوعية الدموية (أحمر) في B6. الفريق الاستشاري--تيراغرام (Thy1-يفب) هجرس/ي في أعماق مختلفة في الطبقة الثانية منطقة S1 في يوم 1 بعد تثبيت النافذة الضوئية. (د) Z-الإسقاط لصور متعددة في نفس المنطقة في يوم واحد. (ﻫ) Z-الإسقاط لصور متعددة في نفس المنطقة في 7 أيام بعد تركيب الإطار البصرية. ملاحظة الاستقرار الملحوظ في عدد وموقع الأشواك الكبار وفروع الجذعية بين يوم 1 و 7 أيام بعد تركيب الإطار البصرية. شريط المقياس = 5 ج-ه ميكرومتر (ج-ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : الكالسيوم إشارة تتبع- (أ، ب) أمثلة على الأفلام المستوردة تي سلسلة مع إيماجيج لتحليل البيانات من الخلايا العصبية 2 (1 الخلايا العصبية والعصبية 2، على التوالي). (ج) جدول يعرض بيانات في شدة الإضاءة من المنطقة لمصلحة (عائد الاستثمار؛ داخل العصبية و 2 منفصلة مجاورة المناطق كخلفية التدابير). (د) حساب الذروة: ΔF/F = (F-إف ب)/إف، إف = (FB1 + FB2)/2 (الخلفية الفلورية متوسط إف [ب]، والتغيرات fluorescence سوما [و] معبراً عنها ΔF/F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 . صور الممثل الكالسيوم. (أ-د) الكالسيوم عابرة (الأخضر) والأوعية الدموية (أحمر) في نقاط زمنية مختلفة في ثانية في ماوس في 7 أيام بعد تركيب الإطار البصرية. السهم الأصفر: خلية نشطة نسبيا أقل. السهم الأبيض: خلية التشويك. (ه، و) ض-إسقاط فترة تسجيل 3 دقيقة للاحمر (الأوعية الدموية) وقنوات الأخضر (الكالسيوم) (ه) وقناة الأخضر فقط (F). (ز) المحدد يتم تمييز الخلايا العصبية ومناطقهم الخلفية المجاورة. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

تصوير اثنين-فوتون يمكن قياس نشاط العديد من الخلايا بدقة معقولة في ما يصل إلى حوالي 800 ميكرون أسفل سطح الدماغ المتزامنة. نحن متكاملة ف 2 وتقنية نافذة ضوئية مزدوجة مع GCaMP6s وراثيا المرمزة لمراقبة ديناميات الكالسيوم في سكان سوماتى الخلايا العصبية طبقة الخامس يقع > 500 ميكرومتر أدناه pia. مع نافذة بصرية مفتوحة على كل جانب من الجمجمة، يتيح الأسلوب تسجيلات للنشاط العصبي عبر مناطق الدماغ الثدييات متماثل للكالسيوم طويلة ومستقرة فيفو فيالتصوير. تشمل الجوانب الرئيسية لهذا الأسلوب أداء الجراحات لإنشاء windows الضوئية المزدوجة فتح الجمجمة وتصوير ف 2 من نشاط الخلايا العصبية في مناطق S1 متناظرة.

دراسة نشاط الشبكة في مناطق S1 الثنائية مثال عن كيف المزدوج ويندوز الجمجمة يمكن أن تستخدم للتحقيق في المعلومات المحلية ومتماثل في الدماغ الكبار فيفو فيتجهيز. كما يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة نشاط الخلايا العصبية (مثل استخدام Thy1-GCaMP6s الفئران) واللدونه القشرية B6. الفريق الاستشاري--تيراغرام (Thy1-يفب) هجرس/ي من أنسجة سليمة المناطق المقابلة متماثل في الانتعاش بعد ديفيرينتيشن نتيجة لإصابة الجهاز العصبي المركزي انفرادية. يمكن أيضا استخدام الأسلوب لدراسة نشاط القشرية استجابة لاستراتيجيات تنشيط الأجهزة الطرفية مثل أوبتوجينيتيك، التحفيز الكهربائية أو الكيميائية. على الرغم من أن نظهر فقط التقنية في مجال S1، يمكن استخدام هذا النهج للتحقيق في أنشطة في مجالات أخرى متماثل في الدماغ المعيشة مثل الخلايا العصبية طبقة الخامس من القشرة الحركية الأولية (M1). ملاحظات بشأن إعادة تنظيم مناطق الدماغ قد يوفر ركيزة العصبية للسلوك الحركي التكيفية، التي تلعب دوراً حاسما في استعادة وظيفة بوستينجوري. كما أنه يسمح لقياس نشاط الخلايا المحددة وراثيا متناظرة المزمنة خلال السلوك في الفئران ثابت رئيس.

من الناحية التقنية، المحققين ينبغي إيلاء اهتمام دقيق للجودة والاتساق في windows الجمجمة المزدوجة. نافذة الجمجمة جمجمة ضعفت تقنية ¹² ينصح بشدة للمبتدئين للممارسة. هي الأشواك المقصورات الكالسيوم بسبب مورفولوجيا والآليات المحلية من تدفق والنتوء. في هذه الدراسة، استخدمنا B6. الفريق الاستشاري--تيراغرام (Thy1-يفب) هجرس/ياء الفئران كمثال لتوضيح العمود الفقري الجذعية الديناميات في فيفو (الشكل 4). قد يتسبب تثبيت نافذة زجاجية فتح الجمجمة دوران العمود الفقري عالية وردود الدبقية رد الفعل بعد الجراحة ¹². على النقيض من ذلك، مع تقنية الإطار ضعفت الجمجمة، العمود الفقري و dendrites يمكن أيضا الحفاظ على.

خيارات الأبعاد وسمك من windows الضوئية سوف تعتمد على مجال الرؤية المنشودة، وانحناء الجمجمة، سمك الجمجمة، ونوع التصوير ¹³. عدم كفاية ضغط كوفيرجلاسيس الضوئية في بلده دوراً قد يسبب سماكة دوراً، نمو الجمجمة، وزادت الحركة الدماغ. وفي المقابل، الضغط المفرط من كوفيرجلاسيس البصرية قد تعوق تدفق الدم القشرية.

للجمعية العامة نافذة ضوئية، الصق وعلاج طبقات إضافية من كوفيرجلاسيس واحد في وقت واحد مع لاصق الضوئية والطول الموجي الطويل الأشعة فوق البنفسجية. للمساعدة على تعزيز ارتباط لاصق، الحارة النافذة ملفقة في حاضنة (50 درجة مئوية، ح 12). تخزين كوفيرجلاس نافذة ضوئية في الإيثانول 70% (المجلد/المجلد)، وقبل الجراحة، شطف مع المالحة العقيمة. النافذة الضوئية يحتاج إلى دراسة لعيوب (مثل مبلغ غير صحيح لمحاذاة لاصقة أو غير دقيقة البصري) تحت ستيريوسكوبي قبل استخدامها لتجنب الفشل. إذا كان بصري لاصقة رقيقة جداً، ممنوع الهواء قد تكون مجعدة، التي يمكن أن تسبب الانحرافات البصرية أو الزجاج غطاء مفرزة في غرس. وفي المقابل، يمكن أن يسبب الكثير لاصقة الضوئية تجاوز الماضي حواف الإطار الجمجمة.

وخلاصة القول، هنا يصف لنا إجراء تجريبي لقياس ديناميات الكالسيوم أو مورفولوجيا الجذعية من خلال windows الجمجمة من 2 متماثل الأولية somatosensory القشرية المناطق في Thy1-GCaMP6s و Thy1-يفب الفئران المعدلة وراثيا، على التوالي، باستخدام الفحص المجهري ف 2. وقد يسهل هذا الأسلوب تشريح العلاقة الهيكلية والوظيفية المعقدة للشبكات العصبية.

Disclosures

ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلف.

Acknowledgments

ونحن ممتنون جداً لقان وينبياو (معهد سكيربال، قسم علم وظائف الأعضاء وعلم الأعصاب، نيويورك جامعة مدرسة الطب، الولايات المتحدة الأمريكية) للإرشادات التقنية الممتازة ورالي باتي، المحرر الطبي (قسم الجراحة العصبية، إنديانا كلية جامعة الطب)، لتحرير المخطوطة. ونحن نشكر الدكتور لقي تشين (معهد بحوث علوم الأعصاب ستارك، كلية الطب بجامعة إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوفير B6. الفريق الاستشاري--تيراغرام (Thy1-يفب) هجرس/ياء الفئران. هذا العمل كان في الجزء التي تدعمها مؤسسة مدير المستشفى العام لمنطقة جينان العسكرية لجيش Chines 2016ZD03 (زيل)، والمعاهد الوطنية للصحة NS059622، NS073636، وزارة الدفاع كدمرب W81XWH-12-1-0562، تستحق الاستعراض جائزة I01 BX002356 من "إدارة الولايات المتحدة لقدامى المحاربين" الشؤون، كريغ ح نيلسون مؤسسة 296749، إنديانا الحبل الشوكي والدماغ إصابة مؤسسة البحوث، هولمان ماري جورج أموال الهبات (إكسمكس).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1.25 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.